Article de méthode

Low-cost protocole d’analyse de l’empreinte et la pendaison de zone Test pour souris appliqué le Stress chronique retenue

DOI :

10.3791/59027

⸱

23 janvier 2019

 , 
1Division of Biology, Center for Molecular Medicine, Jichi Medical University

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le protocole de bas prix consistant en analyse de l’empreinte et la pendaison boîte test après que retenue pour le stress est utile pour évaluer les troubles du mouvement du modèle murin.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Trouble de la démarche est fréquemment observée chez les patients atteints de troubles de la motricité. Dans les modèles de souris utilisées pour les troubles du mouvement, analyse de la démarche est un test comportemental important pour déterminer si les souris imitent les symptômes des patients. Déficits moteurs sont souvent induites par le stress, quand aucun phénotype moteur spontanée n’est observée dans les modèles murins. Par conséquent, analyse de démarche suivie par le stress de chargement serait une méthode sensible pour évaluer le phénotype moteur dans des modèles murins. Toutefois, les chercheurs font face à l’exigence d’un appareil coûteux pour obtenir automatiquement les résultats quantitatifs de l’analyse de la démarche. Pour le stress, stress par des méthodes simples de chargement sans appareils coûteux requis pour un choc électrique et forcé en cours d’exécution est souhaitable. Par conséquent, nous introduisons un protocole simple et peu coûteux consistant en analyse d’empreinte avec du papier et d’encre, pendaison boîte test pour évaluer la fonction motrice, et chargement de stress défini par retenue avec un tube conique. Les déficits moteurs de souris ont été détectés avec succès par le présent protocole.

Introduction

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Troubles de la motricité sont définies comme les perturbations du système nerveux montrant un excès ou un manque de mouvements volontaires ou automatique1. En particulier, trouble de la démarche est souvent documenté chez les patients atteints de troubles de circulation pour2,3,4. Analyse de la démarche est donc un test comportemental adapté pour la validation des modèles animaux de dyskinésies. Chez les souris, les allures automatisé analyses ont été réalisées pour la marche à vitesse naturelle5 et à une vitesse réglable par tapis roulant6,7. Ces analyses fournissent automatiquement les résultats quantitatifs de la démarche. Une autre méthode pour détecter le trouble de la démarche est appelée analyse de l’empreinte. Après marquage le fond des pieds avec de l’encre, souris marchent sur papier, et les empreintes sont analysés. Au départ, Vaseline et en poudre de charbon de bois ont été utilisées pour visualiser l' empreinte8et puis ont été remplacés par l’encre le polygraphe papier9 et révélateurs photographiques sur papier photographique10. Une méthode moins coûteuse et moins toxique à l’aide d’encre et papier que les autres méthodes reste à ce jour11. Analyse de l’empreinte est moins cher par rapport à l’analyse automatisée5,6,7 et serait utile pour évaluer les troubles du mouvement chez les modèles murins pour les chercheurs sans fonds de recherche abondante .

La pendaison épreuve de boîte est une sorte de quatre tests de pendaison de branche à l’aide de fil cage couvercle12 et wire mesh écran13. La boîte est un appareil avec couvercle pivotant treillis sur le dessus de la boîte le long d’une barre centrale. En plus de l’analyse de la démarche, le test est peu coûteuse et facilement possible. Par conséquent, nous avons effectué la pendaison boîte test pour évaluer la force de préhension et l’équilibre, de plus à l’analyse d’empreinte de pas dans le présent protocole.

Stress induit des symptômes de troubles de circulation14,15. Déficits moteurs sont souvent induites par plusieurs stress chroniques, même quand aucun phénotype moteur spontanée n’est observée dans les modèles murins d’un mouvement trouble16,17,18. Retenue est l’une des méthodes couramment utilisées pour le chargement chez la souris, parce que l’animal n’est pas physiquement endommagé19 et le coût est inférieur comparé avec d’autres méthodes telles que l’électrocution avec des appareils dédiés de stress et forcé en cours d’exécution avec l’utilisation d’un tapis roulant. Retenue par un tube, qui est effectué par une souris dans un tube conique troués 50 mL de confinement, est plus facile que d’autres méthodes telles que fil mesh passoire, branche enregistrée et habillage d’animaux avec de la gaze (révisé20). Dans cet article, nous résumons les protocoles de l’empreinte de l’analyse et la boîte de la pendaison d’essai après retenue par un tube. Ce protocole permettrait d’utiliser des modèles de souris de dyskinésies sans phénotype moteur spontané.

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Protocole

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Toutes les expériences sur des animaux ont été menées de manière humaine. Les institutionnels Animal Experiment Comité de Jichi Medical University a approuvé l’étude. L’étude a été menée conformément au règlement institutionnel pour l’expérimentation animale et les fondamentaux de la directive pour bonne conduite of Animal Experiment et des activités connexes dans les établissements de recherche universitaires sous la juridiction du MEXT japonais. Les souris utilisées dans le présent protocole ont été décrites précédemment21.

1. accrocher la boîte Test

  1. Noter le poids de chaque souris. Marquer la queue par marquage stylo pour discrimination individuel (p. ex.., une ligne double lignes et lignes triples).
    Remarque : Courbes de croissance sont utilisés pour un indice de l’état de santé général22.
  2. Placez les souris dans la salle d’expérience au moins 30 min avant le test comportemental. Définir la zone de la pendaison, qui se compose d’une caisse claire (25 x 25 x., 40 cm3) avec un couvercle rotatif maille sur la partie supérieure (Figure 1). Le couvercle du treillis peut être tourné le long d’une barre centrale de sorte que le dessus soit inversée de 180 degrés.
  3. Mettre une souris dans le centre du couvercle du treillis. Tourner délicatement le couvercle du treillis côté vers le bas.
  4. Mesurer la chute de latence (temps de suspension) de la souris du couvercle du treillis.
    Remarque : Si la souris n’est pas moins de 5 min, enregistrer le temps de latence que 5 min.
  5. Retourner la souris à la cage. Nettoyez la boîte accrochante avec l’éthanol à 70 % après chaque test.

2. analyse de l’empreinte

Remarque : Après la boîte accrochante test, effectuer l’analyse de l’empreinte.

  1. Mettre en place le Piste (Figure 2 a).
    1. Couper un morceau de papier blanc (29,7 cm x 42 cm x 0,09 mm) longitudinalement en trois longueurs d’égale largeur. Posez un morceau de papier blanc (9,9 cm x 42 cm) sur la table.
    2. Mettre les boîtes de but sombre à l’extrémité distale du papier. Autres boîtes (à peu près la même longueur que celle du papier) avec les murs des deux côtés de la piste, empêchant la sortie des souris.
    3. Mis d’encre noire et encre rouge en pétri distinct (35 mm de diamètre).
  2. Session de formation.
    Remarque : Effectuez la séance d’entraînement qu’à l’âge de 4 semaines.
    1. Mettre une souris sur l’extrémité proximale du papier (Face la tête vers la zone de but). Laissez la souris à pied de l’extrémité proximale à la zone de but. Supprimer la souris de la zone de but. Si la souris s’arrête sur le papier, poussez doucement la souris pour les boîtes de but par doigt.
    2. Maintenez le pointeur de la souris en agrippant la peau entre le pouce et l’index afin de limiter le mouvement des membres antérieurs. Ensuite, saisissez le dos et la queue entre la sphère du pouce et les autres doigts afin de limiter la circulation des membres postérieurs.
      Remarque : Tenue insuffisante d’une souris se traduit par des taches d’encre sur les vêtements.
    3. Plongez au fond des pattes antérieures à l’encre rouge et la partie inférieure des membres postérieurs à l’encre noire. Immédiatement, placez la souris sur l’extrémité proximale du papier (Face la tête vers la zone de but). Laissez la souris à pied de l’extrémité proximale à la zone de but. Si la souris s’arrête sur le papier, poussez doucement la souris pour les boîtes de but par doigt.
    4. Supprimer la souris de la zone de but. Aller à la séance d’examen.
  3. Séance d’essais.
    1. Issue de la session de formation, mis en place la piste d’empreintes avec un nouveau morceau coupé du livre blanc.
    2. Maintenez le pointeur de la souris en agrippant la peau entre le pouce et l’index afin de limiter le mouvement des membres antérieurs. Ensuite, saisissez le dos et la queue entre la sphère du pouce et les autres doigts afin de limiter la circulation des membres postérieurs.
    3. Plongez au fond des pattes antérieures à l’encre rouge et la partie inférieure des membres postérieurs à l’encre noire. Immédiatement, placez la souris sur l’extrémité proximale du papier. Laissez la souris à pied de l’extrémité proximale à la zone de but.
      Remarque : Parce que les souris préfèrent l’obscurité, marcher devient plus stable que la souris s’approche la zone sombre objectif. Si la souris s’arrête sur le papier, poussez doucement la souris pour les boîtes de but par doigt. Alors, si les empreintes fiables ne sont pas obtenus pour l’analyse (voir étape 2,4. Analyse des empreintes pour les détails) comme la souris s’est arrêté, réessaie la séance d’examen.
    4. Retourner la souris à la cage dans la zone de but. Nettoyer la zone de but avec l’éthanol à 70 % après chaque séance d’essais. Sécher le papier imprimé à pied.
  4. Analyse des empreintes
    1. Trois mesures de chaque paramètre ("Stridez" de longueur des membres antérieurs et postérieurs, avant et arrière largeurs de base, se chevauchent entre les membres antérieurs et postérieurs, Figure 2 b) avec une règle de papier imprimés à pied.
      Remarque : Parce que les empreintes des extrémités proximales et distales souvent montrent des variations importantes en raison de l’arrêt ou en cours d’exécution, choisissent la partie avec un modèle de démarche constante d’empreintes. La partie médiane du pied-imprimé papier sera généralement appropriée pour l’analyse.
      1. Pour la longueur des foulées, mesurer les distances entre les mêmes parties de la patte (paw pad ou orteil).
      2. Pour la largeur de base avant, tracer une ligne entre consécutives empreintes avant droit (ou gauche). Ensuite, mesurez la longueur de la ligne verticale de l’héliplate-forme de l’empreinte avant gauche (ou droite) jusqu'à la ligne tracée entre les empreintes de pas droit (ou gauche).
      3. Pour la largeur de la base arrière, tracer une ligne entre consécutives empreintes postérieurs droit (ou gauche). Ensuite, mesurez la longueur de la ligne verticale de l’héliplate-forme de l’empreinte postérieur gauche (ou droite) jusqu'à la ligne tracée entre les empreintes de pas droit (ou gauche).
      4. De chevauchement, mesurez la distance entre l’avant plaquettes de gauche (ou droit) et empreintes de pattes.
    2. Moyenne des trois mesures pour chaque individu. Utiliser la moyenne individuelle de chaque paramètre pour l’analyse statistique.
      1. Pour la longueur des foulées, utiliser la moyenne des moyennes individuelles des progrès gauche et droite.
      2. Pour l’asymétrie de longueur des enjambées, utiliser la valeur absolue de la différence entre les moyennes individuelles du flanc gauche et la longueur de la branche droite.
      3. Pour l’analyse statistique des autres paramètres (largeur de base avant, la largeur de base arrière et chevauchement), utilisez directement la moyenne individuelle.

3. restraint Stress chargement

  1. Préparation des Tubes de retenue.
    1. Faire 16 trous (environ 2 mm de diamètre) dans un tube conique de 50 ml (30 mm de diamètre x 115 mm de longueur) le long des repères de l’échelle (5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 mL) et l’arrière de chaque échelle marquer en foret carré (Figure 3). Faire un trou à l’extrémité du tube conique 50 mL (environ 5 mm de diamètre) pour la respiration en coupant l’extrémité. Faire un trou (environ 4 mm de diamètre) dans le capuchon du tube pour passer la queue de souris.
  2. Chargement de stress
    1. Placer les souris dans la chambre expérimentale.
    2. Tenir une souris en agrippant la peau entre le pouce et l’index. Entrez la souris dans le tube de retenue de la tête. Passer la queue à travers le trou du bouchon. Fermer le bouchon.
      Remarque : Limiter les mouvements des membres antérieurs, car les souris rejettent entrant dans le tube par les membres antérieurs.
    3. Gardez la souris enfermée pendant 2 h sur un bureau à température ambiante. Retirer le tube de retenue de la souris et le retour à la cage.
      Remarque : Les tubes de retenue peuvent être réutilisés après un lavage et sec.

4. l’annexe expérimental (Figure 4) :

  1. Effectuer la pendaison boîte de test et l’analyse de l’empreinte sur le même jour à l’âge de 4 semaines (voir l’étape 1. Test boîte suspendus et l’étape 2. Analyse de l’empreinte pour plus de détails) comme une mesure de base sur toutes les souris avant le regroupement en « groupe de stress » et un « groupe de stress non ».
    Remarque : Environ 8-10 souris 2-3 litières peuvent convenir d’utiliser dans une expérience. Analyse de l’empreinte à l’âge de 4 semaines consiste en des séances de formation et de test.
  2. Au hasard de diviser les souris dans un « groupe de stress » et un « groupe de stress non ».
    Remarque : Lorsque les souris sont utilisées consistant en plusieurs portées, répartir uniformément même portée dans les deux groupes. Nombre dans chaque groupe est constitué d’environ 4-5 souris.
  3. Appliquer l’effort de retenue au groupe « stress » 6 fois au cours des deux semaines (voir l’étape 3. Stress de contrainte de chargement pour plus de détails).
    NOTE : 6 fois de retenue sont appliquées toutes les deux semaines, suivie d’un accrochage case analyse test et empreinte de 6 à 12 semaines d’âge. Ne s’appliquent pas le stress de retenue le jour de l’essai de la pendaison du coffret test et l’analyse de l’empreinte.
  4. Effectuer la pendaison boîte de test et d’analyse de l’empreinte, la séance d’examen le jour même à 6, 8, 10 et 12 semaines d’âge.

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Résultats

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Les souris mâles hétérozygotes de Atp1a3 (Atp1a3+ / −) qui sont le modèle murin pour l’apparition rapide de dystonie parkinsonisme et type sauvage ont été utilisés dans le présent protocole. Atp1a3+ / − a montré nettement plus courtes longueurs de foulée des membres antérieurs et postérieurs que ceux du type sauvage à 4 semaines d’âge (Figure 5 a et 5 b Figure, ouvrir le cercle et ...

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Discussion

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L’analyse de l’empreinte et la boîte de pendaison d’essai sont simples et peu coûteux des tests comportementaux pour la fonction motrice des souris. Les phénotypes neurocomportementales dans plusieurs modèles de souris ont été correctement détectés par ces tests. Par exemple, raccourcir la longueur de foulée dans la sclérose latérale amyotrophique24, augmentation de la longueur de foulée asymétrique à l’ataxie-télangiectasie25, accroissement de la durée de chevauchement dan...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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Ce travail a été soutenu par KAKENHI JSPS (société japonaise pour la Promotion des sciences) (subvention pour la recherche scientifique C), accorder le numéro 18K 07373 (H.S.) et des subventions pour les universités privées.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Boîte suspendueO' hara & Co.http://ohara-time.co.jp/products/wire-hanging-test/
MarqueurZEBRAMO-120-MC-BK
Boîte de butO' hara & Co.http://ohara-time.co.jp/products/balanced-beam-test/Accessoire pour appareil de caissons d’essai à faisceau équilibré
O' hara & Co.-Paroi latérale de la piste Encre
noireShin-asahi-Encre
rougeMaruyamakogyoBC-6
Boîte de Pétri jetableCorning351008boîtes de Pétri (35 mm de diamètre)
Askul Multipaper Super White J Monochrome A3Askul701-712Papier blanc (29,7 cm x 42 cm x 0,09 mm)
50 mL Tube coniqueCorning
Perceuse carréeKAKURI CorporationUSINE de bricolage (K32-0313)
430829

Références

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Mots-clés

Analyse de la marchefonction motrice chez la souristest de charge de stressmesure de la longueur de foul elargeur de base post rieurepr paration du tube de contentionph notypage comportemental

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