Mesurer le remodelage et la recréation du microenvironnement tumoral-os à l’aide de la co-culture Calvaria et de l’histomorphométrie

Résumé

La culture ex vivo des explantations osseuses peut être un outil précieux pour l’étude de la physiologie osseuse et l’évaluation potentielle des médicaments dans le remodelage des os et les maladies osseuses. Le protocole présenté décrit la préparation et la culture des calvarias isolées des crânes de souris nouveau-nés, ainsi que ses applications.

Résumé

L’os est un tissu conjonctif constitué d’ostéoblastes, d’ostéocytes et d’ostéoclastes et d’une matrice extracellulaire minéralisée, qui lui donne sa force et sa flexibilité et lui permet d’accomplir ses fonctions. L’os est continuellement exposé à une variété de stimuli, qui dans des conditions pathologiques peuvent déréglementer le remodelage des os. Pour étudier la biologie osseuse et les maladies et évaluer les agents thérapeutiques potentiels, il a été nécessaire de développer des modèles in vitro et in vivo.

Ce manuscrit décrit le processus de dissection et les conditions de culture des calvarias isolés des souris néonatales pour étudier la formation osseuse et le microenvironnement de tumeur d’os. Contrairement aux modèles in vitro et in vivo, ce modèle ex vivo permet la préservation de l’environnement tridimensionnel du tissu ainsi que la diversité cellulaire de l’os tout en se chavant dans des conditions définies pour simuler le microenvironnement désiré. Par conséquent, il est possible d’étudier le remodelage des os et ses mécanismes, ainsi que les interactions avec d’autres types de cellules, tels que les interactions entre les cellules cancéreuses et les os.

Les essais signalés ici utilisent des calvarias de souris BALB/C vieilles de 5 à 7 jours. Les hémi-calvarias obtenus sont cultivés en présence d’insuline, de cellules cancéreuses du sein (MDA-MB-231), ou de milieu conditionné des cultures de cellules cancéreuses du sein. Après analyse, il a été établi que l’insuline a induit la nouvelle formation d’os, tandis que les cellules cancéreuses et leur résorption d’os induite par le milieu conditionné. Le modèle calvaire a été utilisé avec succès dans la recherche fondamentale et appliquée pour étudier le développement osseux et les maladies osseuses induites par le cancer. Dans l’ensemble, c’est une excellente option pour un essai facile, informatif et peu coûteux.

Introduction

L’os est un tissu conjonctif dynamique qui a plusieurs fonctions, y compris le soutien des muscles, la protection des organes internes et de la moelle osseuse, et le stockage et la libération de calcium et les facteurs de croissance^1,2. Pour maintenir son intégrité et sa bonne fonction, le tissu osseux est continuellement en cours de remodelage. En termes généraux, un cycle de remodelage des os peut être divisé en résorption osseuse et formation osseuse¹. Un déséquilibre entre ces deux phases de remodelage osseux peut conduire au développement de pathologies osseuses. En outre, les maladies telles que le cancer du sein affectent souvent l’intégrité osseuse; environ plus de 70 % des patients à un stade avancé ont ou auront des métastases osseuses. Lorsque les cellules cancéreuses du sein pénètrent dans les os, elles affectent le métabolisme osseux, ce qui entraîne une résorption excessive (lésions ostéoclastiques) et/ou une formation (lésions ostéoblastiques)³.

Pour comprendre la biologie des maladies osseuses et développer de nouveaux traitements, il est nécessaire de comprendre les mécanismes impliqués dans le remodelage des os. Dans la recherche sur le cancer, il est essentiel d’étudier le processus de métastase osseuse et sa relation avec le microenvironnement métastatique. En 1889, Stephen Paget a émis l’hypothèse que les métastases se produisent quand il y a compatibilité entre les cellules tumorales et le tissu cible, et a suggéré que le site métastatique dépend de l’affinité de la tumeur pour le microenvironnement⁴. En 1997, Mundy et Guise ont introduit le concept du « cercle vicieux des métastases osseuses » pour expliquer comment les cellules tumorales modifient le microenvironnement osseux pour atteindre leur survie et leur croissance, et comment le microenvironnement osseux favorise leur croissance en fournissant du calcium et des facteurs de croissance^5,,6,,7.

Pour caractériser les mécanismes impliqués dans le remodelage des os et la métastase osseuse et pour évaluer les molécules ayant un potentiel thérapeutique possible, il a été nécessaire de développer des modèles in vitro et in vivo. Cependant, ces modèles présentent actuellement de nombreuses limitations, telles que la représentation simplifiée du microenvironnement osseux, et leur coût^8,9. La culture des explantations osseuses ex vivo a l’avantage de maintenir l’organisation tridimensionnelle ainsi que la diversité des cellules osseuses. En outre, les conditions expérimentales peuvent être contrôlées. Les modèles explants comprennent la culture des os métatarsiens, des têtes fémorales, des calvarias et des noyaux mandibulaires ou trabecular¹⁰. Les avantages des modèles ex vivo ont été démontrés dans diverses études. En 2009, Nordstrand et ses collaborateurs ont signalé la mise en place d’un modèle de coculture basé sur les interactions entre les cellules du cancer de l’os et de la prostate¹¹. En outre, en 2012, Curtin et ses collaborateurs ont signalé le développement d’un modèle tridimensionnel à l’aide de cocultures ex vivo ¹². Le but de ces modèles ex vivo est de recréer les conditions du microenvironnement osseux aussi précisément que possible pour être en mesure de caractériser les mécanismes impliqués dans le remodelage normal ou pathologique des os et d’évaluer l’efficacité de nouveaux agents thérapeutiques.

Le protocole actuel est basé sur les procédures publiées par Garrett¹³ et Mohammad et coll.¹⁴. Les cultures néonatales de calvaria de souris ont été employées comme modèle expérimental, car elles conservent l’architecture tridimensionnelle de l’os sous le développement et des cellules osseuses, y compris les cellules à tous les stades de la différenciation (c.-à-d. ostéoblastes, ostéoclastes, ostéocytes, cellules stromales) qui mènent aux ostéoclastes et aux ostéoblastes matures, ainsi qu’à la matrice minéralisée¹⁴. Le modèle ex vivo ne représente pas totalement le processus pathologique des maladies osseuses. Cependant, les effets sur le remodelage des os ou l’ostéolyse osseuse induite par le cancer peuvent être mesurés avec précision.

En bref, ce protocole se compose des étapes suivantes : la dissection des calvarias de souris de 5 à 7 jours, la préculture de calvaria, les applications de la culture de la calvaria (p. ex., la culture en présence d’insuline, les cellules cancéreuses ou le milieu conditionné, et même les agents avec potentiel thérapeutique, selon le but de l’enquête), fixation osseuse et décalcification de calvaria, traitement tissulaire, analyse histologique et interprétation des résultats.

Protocole

Toutes les souris utilisées dans ces essais ont été obtenues à partir de souches de souris BALB/c, utilisant des souris mâles et femelles sans discernement. Des expériences culturelles antérieures ont également été réalisées à l’aide d’autres souches, telles que FVB, souris suisses, CD-1, et CsA souris^11,12,14. Toutes les souris ont été logées selon les directives des National Institutes of Health (NIH), l’Annexe Q. Les procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) du Center for Scientific Research and Higher Education d’Ensenada (CICESE).

1. Dissection calvaire

1. Stériliser les instruments de dissection (p. ex., 1 x 2 forceps de tissu dentaire, ciseaux chirurgicaux droits, ciseaux disséquants, pinces à pointe fin, forceps de dissection fine de pointe courbée, forceps disséquants, scalpel). L’eau distillée stérile peut être utilisée pour nettoyer les outils chirurgicaux entre chaque dissection, et sterile 1x PBS peut être utilisé pour nettoyer chaque hémi-calvaria.
2. Placer les instruments de dissection stériles, l’eau, 1x PBS, et les matériaux nécessaires pour effectuer la procédure (par exemple, les micropipettes, verres précipités, plats stériles Petri) dans un capot de flux laminaire.
   REMARQUE : Effectuez l’ensemble de la procédure dans des conditions stériles.
3. Ajouter 12 ml de PBS stérile de 1x dans deux plats Petri de 10 cm.
4. Sélectionnez les chiots et placez-les près du capot.
   REMARQUE : Disséquez les calvarias de 5 à 7 jours de chiots.
5. Choisissez et maintenez la souris soigneusement à l’aide de forceps disséquants.
6. Décapiter la souris à l’aide de ciseaux disséquants et placer la tête dans un plat Petri avec PBS.
   REMARQUE : La décapitation n’est pas adaptée aux souris plus âgées. Si l’expérience doit être faite avec des souris plus âgées, la méthode d’euthanasie doit être modifiée selon les règles d’expérimentation animale.
7. Maintenez la tête fermement par la zone du nez avec 1 x 2 forceps de tissu de dents et retirez la peau au-dessus du crâne jusqu’à ce que la calvaria soit visible.
8. Identifier les sutures (c.-à-d. sagittal, coronale et lambdoid) du crâne sur la calvaria exposée.
9. Pénétrer avec la pointe des microsciseurs d’environ 2 mm derrière la suture lambdoid et faire une coupe droite à côté de lui.
10. Insérez la pointe des microsciseurs sur le côté arrière du crâne. Faire une coupe droite le long du côté distal de la suture lambdoid vers la suture coronale. Procédez de la même façon avec l’autre suture lambdoid.
11. Faire une autre coupe (à un angle de 45 degrés) pour connecter l’extrémité de la coupe faite avec la coupe de la fonte antérieure.
12. Répéter les étapes 1.10 et 1.11 avec l’autre suture lambdoid.
    REMARQUE : Il est important d’identifier les sutures pour effectuer des coupes appropriées et d’être en mesure d’effectuer une analyse adéquate de l’intégration et des données.
13. Utilisez des forceps à pointe fine pour enlever la calvaria et la placer dans un plat Petri. Avec un scalpel, faire une coupe droite de la fontanel postérieure le long de la suture sagittale par la suture coronale et se terminant dans la fontanel antérieure pour obtenir deux hémi-calvarias.
14. Ramassez chacun des hémi-calvarias avec les pincettes à pointe fine et placez-les dans un nouveau plat Petri contenant PBS.

2. Culture Calvaria

1. Ajouter 1 ml de moyen DMEM à haute teneur en glucose complété par 0,1 % d’albumine de sérum bovin (BSA) et 1 % d’antibiotique/antimycotique (c.-à-d. pénicilline et streptomycine) dans les puits d’une plaque de 24 puits. Avec des forceps à pointe fine, ramasser chaque hémi-calvaria et le placer dans un puits.
   REMARQUE : Mettez le côté de concave d’hémi-calvarias vers le bas.
2. Incuber l’hémi-calvarias pour 24 h à 37 oC avec 5% de CO₂.
3. Retirez le milieu de culture de chaque puits et ajoutez 1 ml de milieu frais contenant le composé pour tester ou conditionner les milieus d’autres cellules.
   REMARQUE : Utilisez au moins trois hémi-calvarias pour chaque groupe de traitement et utilisez des contrôles négatifs et positifs.
4. Incuber les hémi-calvarias pendant 7 jours, changer les médias tous les 2-3 jours.

3. Culture avec cellules cancéreuses

1. Sélectionnez un plat Petri avec des cellules cancéreuses à 80-90% confluence et trypsinize eux. Pour trypsiniser, lavez les cellules cancéreuses 1x à l’aide de PBS (5 ml par 75 cm² flacon) suivies d’incubation dans une solution HBSS contenant 0,05 % de trypsine et 0,53 mM EDTA (2 ml par 75 cm² flacon).
2. Transférer la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 ml et une centrifugeuse à 800 x g pendant 5 minutes à température ambiante (RT).
3. Retirer et jeter le supernatant.
4. Résuspendez le granule dans 2 ml de DMEM contenant 2% de sérum bovin fœtal (FBS) et 1% d’antibiotique/antimycotique. Comptez les cellules vivantes.
5. Attribuer des hémi-calvarias à chaque groupe d’étude (c.-à-d. le groupe de contrôle négatif et de coculture pour l’ARN ou l’histologie).
6. Retirez les médias de culture des hémi-calvarias et ajoutez 1 ml de DMEM contenant 2% de FBS et 1% d’antibiotique/antimycotique complétés ou non complétés par des cellules cancéreuses.
   REMARQUE : La quantité de cellules à ajouter peut changer en fonction de la ligne cellulaire testée. Avec les cellules cancéreuses comme MDA-MB-231 ou PC-3, 500 000 cellules par puits fonctionnent de façon appropriée.
7. Incuber pour 24 h à 37 oC avec 5% de CO₂. Passez chaque hémi-calvaria à un nouveau puits pour ne retenir que les cellules cancéreuses qui ont adhéré au tissu osseux.
8. Incuber pendant 7 jours à 37 oC avec 5% de CO₂ et changer les médias tous les 2-3 jours.

4. Fixation

1. Couper des carrés de papier de soie pour envelopper les hémi-calvarias.
   REMARQUE : Des tampons en mousse biopsié ou des capsules d’acier pour les petites biopsies peuvent également être utilisés.
2. Utilisez des forceps fins droites pour ramasser chaque hémi-calvaria de la suture sagittale, placez-les sur un papier de soie et enveloppez-le.
3. Placer l’hémi-calvaria enveloppée à l’intérieur d’une cassette d’intégration étiquetée.
4. Placer la cassette dans un récipient avec 10% de formaline tamponnée par le phosphate.
5. Fixer pour 24 h à 4 oC.

5. Décalcification

1. Retirer le formaline, ajouter 1x PBS, et agiter les tissus pendant 30 minutes pour rincer les hémi-calvarias.
2. Retirez le PBS et ajoutez 10 % d’EDTA (pH à 8, 0,34 M).
   REMARQUE : Vérifiez que la solution couvre complètement les tissus.
3. Décalcifier les tissus pour 48 h à 4 oC.
4. Jetez la solution EDTA et ajoutez 1x PBS pour rincer le tissu.
5. Conservez les hémi-calvarias dans 70% d’éthanol jusqu’à la transformation de l’histologie.

6. Traitement des tissus

1. Déshydrater les tissus avec des rondelles d’éthanol de 96 %, 60 min (3x), suivis de 100 % d’éthanol, 60 min (3x).
2. Remplacer l’éthanol par 100% de xylène, 60 min (3x).
3. Incuber les cassettes en cire de paraffine, 60 min (2x).

7. Embedding

1. Ouvrez les cassettes, retirez soigneusement le papier de soie et déballez la calvaria.
2. Ramassez chaque calvaria avec soin et empilez tous les hémi-calvarias du même groupe dans la même orientation.
3. Mettre un peu de paraffine dans un moule.
4. Ramassez tous les hémi-calvarias avec les forceps et placez-les à l’intérieur du moule avec la suture sagittale vers la base du moule.
   REMARQUE : L’orientation des hémi-calvarias dans le moule pendant l’inclusion est cruciale pour obtenir des sections histologiques cohérentes et des résultats reproductibles parce que cette orientation permettra l’identification postérieure des os avant et pariétal des calvarias et la suture coronale facilitant l’évaluation quantitative.
5. Relâchez les forceps et vérifiez que les hémi-calvarias restent en place.
6. Placez la cassette étiquetée sur le moule et remplissez-la avec plus de paraffine pour couvrir l’hémi-calvarias.
7. Déplacez les moules à la surface froide.

8. Section

1. Couper 500-600 m de suture sagittale avec le microtome.
2. Couper 4 m d’épaisseur et recueillir les sections nécessaires.
3. Couper encore 300 m.
4. Couper et recueillir six autres sections d’épaisseur de 4 m.
5. Couper le bloc 300 m plus loin et collecter plus de sections.
6. Monter les sections sur des lames de microscope en verre.
7. Séchez les toboggans à RT.

9. Staining

1. Immerger les sections dans 100% xylène pendant 3 min.
2. Submerger dans 100% d’éthanol pendant 1 min.
3. Fusionner dans 96% d’éthanol pendant 1 min.
4. Immerger dans 80% d’éthanol pendant 1 min.
5. Submerger dans 70% d’éthanol pendant 1 min.
6. Rincer à l’eau pendant 3 min.
7. Submerger dans l’hématoxyline pendant 3 min.
8. Rincer dans l’eau jusqu’à ce que la section soit claire.
9. Submergez dans une solution saturée de carbonate de lithium pendant 10 secondes.
10. Rincer à l’eau pendant 3 min.
11. Submerger dans 96% d’éthanol pendant 1 min.
12. Submerger à l’éosine pendant 3 min.
13. Immerger dans 96% d’éthanol pendant 1 min.
14. Submerger dans 100% d’éthanol pendant 1 min.
15. Submerger dans 100% de xylène pendant 3 min.
16. Ajouter un peu par milieu de montage à la glissière et le protéger avec un coverlip.
    REMARQUE : Vous pouvez compléter la coloration de l’hématoxyline et de l’éosine (H et E) avec la coloration acidulée résistante au tartrate (TRAP) pour évaluer l’œstéoclaste et l’ostéolyse.

10. Évaluation quantitative : définition du domaine d’analyse

1. Examinez les sections de faible puissance (c.-à-d. 4x) pour identifier l’orientation et les sutures.
2. Définissez la suture coronale et identifiez la longue surface osseuse d’un côté et la surface courte de l’autre.
3. Identifiez la suture coronale sous le grossissement de 40x, et déplacez deux ou trois champs optiques loin de la suture le long de la longue surface. Capturez des images de cette zone pour analyse.
4. Décrivez l’ancienne zone osseuse et la nouvelle zone osseuse. L’eosin Y avec orange G tache l’os ancien plus foncé et le nouveau briquet d’os.
5. Mesurez la zone osseuse totale de l’os ancien et nouveau avec le logiciel Image J à l’aide de l’outil de seuil de couleur. Exprimez les résultats sous le titre 'm².

11. Analyse des données

1. Analyser les résultats à l’aide d’un logiciel statistique. Des différences significatives entre les groupes peuvent être déterminées à l’aide de tests appropriés (p. ex., test Mann-Whitney U non parparamétrique comme on le fait herel).

Résultats

Pour évaluer la formation osseuse dans le modèle calvaire, nous avons cultivé les hémi-calvarias dans les médias avec ou sans 50 g/mL d’insuline. Des sections de tissus ont été préparées et tachées de H et E. Dans ces conditions, l’histologie a montré que l’intégrité structurale de l’os calvaire était maintenue, permettant l’identification de ses différents composants(figure 1). Les calvarias traitées à l’insuline présentaient une augmentation de la quantité ...

Discussion

Ici, nous décrivons le protocole pour un modèle ex vivo calvaire pour évaluer la formation ou la résorption d’os et pour étudier les interactions des cellules cancéreuses avec l’os de souris calvaire. Les étapes critiques de cette technique sont la dissection, la culture, l’intégration et l’analyse histomorphométrique des calvarias. Pendant la dissection des calvarias, il est crucial de couper l’hémi-calvarias en trapézoïde, car il facilitera fortement l’orientation pendant l’inclusion de paraffine. Lors de l’ét...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Culture cellulaire 24 puits	Corning	CLS3524
24 puits culture non tissulaire	Falcon	15705-060
2 mL cryovial	SSI	2341-S0S
Antibiotiques-Antimycosiques	Corning	30-004-CI
BSA	Biowest	P6154-100GR
Centrifuge	Eppendorf	22628188	Centrifugeuse 5810R
Lamelles de recouvrement	Corning	2935-24X50
Résine Cytoseal	Richard Allen	8310-10
DMSO		D2650-100ML
Dulbecco’s Modification of Eagles Medium, avec 4,5 g/L de glucose et de L-glutamine, sans pyruvate de sodium	Corning	10-017-CV
Dulbecco’s PBS (10X)	Corning	20-031-CV
Ebedding Cassettes	Sigma	Z672122-500EA
EDTA	Golden	26400
Station de travail d’enrobage	Thermo Scientific	A81000001
Eosin	Golden	60600
Éthanol absolu	JALMEK	E5325-17P
Sérum de bovin fœtal	Biowest	BIO-S1650-500
Filtres	Corning	CLS431229
Pinces et ciseaux	LANCETA HG	74165
Tamponné au formol 10 %	Sigma	HT501320
Lames en verre 25 x 75 mm	Premiere	9105
Harris’s Hematoxylin	Jalmek	SH025-13
Lames à profil haut	Thermo Scientific	1001259
Histoquinet	Thermo Scientific	813150	STP 120
Insuline du pancréas bovin	Sigma	16634
Microscope	ZEISS	Axio Scope.A1
Microtome	Thermo Scientific	905200	MICROM HM 355S
Nourriture pour souris, 18 % prot, 2018S	Harlan	T.2018S.15
Neubauer	VWR	631-0696
Orange G	Biobasic	OB0674-25G
	Paraplast	Paraplast 39601006
Section de paraffine Bain de flottation Boîte	de Pétri MH8517X1		électrothermique
	Corning	CLS430167
Phloxin B	Probiotek	166-02072
Bleu	trypanSigma	T8154
Trypsine-EDTA	Corning	25-051-CI
Distributeur de cire	Électrothermique	MH8523BX1
Xylène	Doré	534056-500ML