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Article de méthode

Une Nanoémulsion Tripeptide-stabilisé de l’acide oléique

8.6K vues

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DOI :

10.3791/59034

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27 février 2019

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Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit une méthode efficace pour synthétiser une nanoémulsion d’un conjugué de la teneur en acide oléique acids-platinum(II) stabilisé avec un tripeptide lysine-tyrosine-phénylalanine (KYF). Les formes nanoémulsion dans des conditions douces synthétiques par auto-assemblage de la KYF et le conjugué.

Résumé

Les auteurs décrivent une méthode pour produire une nanoémulsion composée d’un noyau de acids-Pt(II) en acide oléique et d’un revêtement (KYF) de lysine-tyrosine-phénylalanine (KYF-Pt-NE). La KYF-Pt-NE encapsule pt (ii) à 10 % m/m, a un diamètre de 107 ± 27 nm et une charge négative de la surface. La KYF-Pt-NE est stable dans l’eau et dans le sérum et est biologiquement active. La conjugaison d’un fluorophore à KYF permet la synthèse d’une nanoémulsion fluorescente qui convient pour l’imagerie biologique. La synthèse de la nanoémulsion s’effectue dans un environnement aqueux et les formes de KYF-Pt-NE par auto-assemblage d’un peptide KYF court et un conjugué de acids-platinum(II) en acide oléique. Le processus d’auto-assemblage dépend de la température de la solution, le rapport molaire des substrats et la vitesse d’écoulement de l’addition du substrat. Étapes cruciales incluent maintenant le taux d’agitation optimal pendant la synthèse, permettant un délai suffisant pour l’auto-assemblage et pré concentre la nanoémulsion progressivement dans un concentrateur centrifuge.

Introduction

Ces dernières années, il y a eu un intérêt croissant pour l’ingénierie des nanoparticules pour des applications biomédicales comme medicaments et bioimaging1,2,3,4. La multifonctionnalité des systèmes à base de nanoparticules nécessite souvent incorporant plusieurs composants dans une formulation. Les blocs de construction qui reposent souvent sur des lipides ou des polymères se distinguent par leurs propriétés physico-chimiques ainsi que leur biocompatibilité et biodégradabilité, qui finalement pourrait affecter la fonction de la nanostruct....

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Protocole

1. synthèse de la teneur en acide oléique Acids–Platinum(II) conjugué

  1. Activation du cisplatine
    1. Suspendre 50 mg (0,167 mmol) de cisplatine dans 4 mL d’eau (p. ex., nanopure) à 60 ° C.
    2. Ajouter goutte à goutte 55,2 mg (0.325 mmol) de AgNO3 dans 0,5 mL d’eau à la solution de cisplatine et de remuer la réaction pendant au moins 2 h à 60 ° C. Le précipité blanc de AgCl formera indiquant l’état d’avancement de la réaction.
    3. Pour déterminer si la réaction d’activation est terminée, effectuez le test avec 10 % HCl pour la présence d’ions Ag+ libres en solution. Le critère devrait être négatif (aucun précipité d’AgCl ....

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Résultats

Image représentant TEM KYF-Pt-ne préparé à l’aide de ce protocole est montré dans la Figure 2 a. La KYF-Pt-NEs sont sphériques en morphologie, bien dispersée et de taille uniforme. Le diamètre du noyau de la KYF-Pt-NEs, mesurés directement à partir de trois images TEM avec un minimum de 200 mesures fait, est de 107 ± 27 nm. Le diamètre hydrodynamique des KYF-Pt-NE, analysée par spectroscopie lumineuse dynamique (DLS), s’est avéré pour être de 240 nm avec un i.......

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Discussion

Des étapes cruciales dans la synthèse de nanoémulsion incluent le rapport molaire des substrats de réglage, maintenir contrôle température et le débit de la fréquence pendant l’ajout de acids–Pt(II) en acide oléique, fournissant suffisamment de temps pour l’auto-assemblage et purifier le produit à l’aide une colonne de concentrateur centrifuge. Ces paramètres influent sur la taille et la morphologie de la KYF-Pt-NE ; ainsi, il est particulièrement important maintenir le bon rapport molaire et ajuster les conditions synth.......

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Déclarations de divulgation

Auteurs n’ont pas de conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

Nous reconnaissons l’appui financier de l’Institut National du Cancer, grant SC2CA206194. Aucun intérêts financiers concurrents ne sont déclarés.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
2-(1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tétraméthyluronium
tétrafluoroborate (TBTU)
ANASPEC INC. :AS-20376SPPS
Boîte confocale à 4 puitsLab-Tek II, Thermo Fisher Scientific154526Pour l’imagerie
l’acide 6-bromohexanoïqueChem-Impex INT' L INC.24477Modification par clic pour le peptide
A2780Généreusement offert par le professeur John Martignetti de l’hôpitalLignée cellulaire du cancer de l’ovaire
Barnstead NanopureThermo FisherD11901Système de filtration d’eau
BUCHI rotavapor R-3BuchiZ568090Pour l’élimination des solvants et le séchage des échantillons
Centrifugeuse 5810 Reppendorf5811FPour la séparation du complexe de platine
Cis-dichlorodiamineplatinum (II) 99 %Acros Organics19376-0050Tests in vitro
CP70Généreusement offert par le professeur John Martignetti de l’hôpitalLignée cellulaire du cancer de l’ovaire
Bain d’eau numériqueVWR97025-134Pour réchauffer les milieux de culture cellulaire
Diffusion dynamique de la lumière (DLS)Brookhaven Instrument CorporationPour les mesures de la taille des nanoparticules
ES-2ATCCCRL-1978Lignée cellulaire du cancer de l’ovaire
Fmoc-L-Lys(Boc)-OH 99,79 %Chem-Impex INT' L INC.00493SPPS
Fmoc-L-Phe Résine d’alcool 4-alkoxybenzyle (0,382 meq/g),Chem-Impex INT' L INC.01914SPPS
Fmoc-LTyr(tBu)-OH 98 %Alfa AesarH59730Incubateur CO2 SPPS
HERACELL 150iIncubateur Fisher
Pousse-seringue haute pressionNew Era1010-USPour l’ajout de complexes de platine dans la synthèse de nanoparticules
Plaque chauffante/agitateurVWR12365-382Pour l’agitation et le chauffage
des échantillonsLAMP-1 Anticorps (conjugué avec Alexa Fluor 647)Santa Cruz Biotechnologysc-18821 AF647Pour l’imagerie
N,N-diisopropyléthylamine (DIPEA)Oakwood Chemical005027SPPS
Ninhydrin 99 %Alfa AesarA10409Kaiser
test Acide oléiqueChem-Impex INT' L INC.01421Pour la synthèse du complexe de platine
OV90ATCCCRL-11732Lignée cellulaire du cancer de
l’ovaire PBSCorning21-031-CVPour le lavage cellulaire
Support de montage PermountFisher ChemicalSP15-100Pour l’imagerie
PhénolFisher ChemicalA92500Test Kaiser
Acide phosphotungstiqueFisher ChemicalA248-25coloration négative pour TEM
Piperidine 99 %BTC219260-2.5LSPPS
Platinum AAS standard soultionAlfa Aesar880861000ug/ml pour courbe d’étalonnage
Bromure de propargyle 97 %Alfa AesarL10595Pour modification d’alcyne de fluorescéine
Armoire biologique scientifiqueThermo Scientific Fisher1385Bio-hood pour culture cellulaire
Système d’aspiration autonettoyantWelch2028Pompe à vide pour rotavapor
Nitrated’argent Acros Organics19768-0250Activation du cisplatine
SKOV3ATCCHTB-77Lignée cellulaire du cancer de l’ovaire
Hydroxyde de sodiumFisher ScientificS313-1Pour la synthèse du complexe de platine
Chlorured’étain (II)Sigma Aldrich208256Test de présence de platine
TOV21GATCCCRL-11730Lignée cellulaire du cancer de l’ovaire
Acide trifluoroacétique 99 % (TFA)Alfa AesarL06374SPPS
Triisopropylsilane (TIPS)Chem-Impex INT' L INC.01966SPPS
Triton-XSigma AldrichT8787-100MLPour l’imagerie
Poudre d’uranine 40 %Fisher ScientificS25328APour la modification alcyne de la fluorescéine
Vivaspin 20 (10000 MWCO)SartoriousVS2001Pour le lavage et la condensation des nanoparticules
VWR Microscope inverséVWR89404-462Pour la surveillance des cultures cellulaires
de Mount Sinai Mount Sinai Thermo Scientific

Références

  1. Agrahari, V., Agrahari, V., Mitra, A. K. Nanocarrier fabrication and macromolecule drug delivery: challenges and opportunities. Therapeutic Delivery. 7 (4), 257-278 (2016).
  2. Anselmo, A. C., Mitragotri, S. Nanoparticles in the clinic. Bioengineering & Translat....

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Réimpressions et autorisations

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