Article de méthode

Suivi de la survie des neurones par l’intermédiaire de la microscopie en Fluorescence longitudinale

DOI :

10.3791/59036

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19 janvier 2019

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1Department of Neurology, University of Michigan School of Medicine, 2Neuroscience Graduate Program, University of Michigan School of Medicine

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

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Nous présentons ici un protocole visant à surveiller la survie sur une base unicellulaires et identifier les variables qui permettent de prédire significativement la mort cellulaire.

Résumé

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Les analyses de cytotoxicité standard, qui nécessitent la collecte de lysats ou des cellules fixées à plusieurs moments, ont limité la sensibilité et la capacité d’évaluer les facteurs qui influencent le destin neuronale. Ces tests requièrent l’observation des populations distinctes de cellules à des moments distincts. Ainsi, des cellules individuelles ne peuvent pas être suivies prospectivement au fil du temps, limitant sévèrement la capacité de distinguer que des événements subcellulaires, comme examen formation ou niveau de protéine, sont pilotes pathogènes de la maladie, les réponses homéostatiques, ou des phénomènes purement fortuits. Unicellulaire microscopie longitudinale permet de surmonter ces limitations, ce qui permet au chercheur de déterminer les différences de survie entre les populations et dessiner des relations causales avec une sensibilité accrue. Ce guide vidéo exposera un flux de travail représentatif pour expériences mesurant unicellulaires survie des neurones du cortex primaire rat exprimant un marqueur de la protéine fluorescente. Le spectateur va apprendre à atteindre la haute efficacité transfections, de collecter et de traiter des images permettant le suivi prospectif des cellules individuelles et comparer la survie relative des populations de neurones en utilisant l’analyse de risques proportionnels de Cox.

Introduction

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La mort des cellules anormales est un facteur déterminant dans de nombreuses maladies, y compris le cancer, neurodégénérescence et course1. Les dosages robustes et sensibles pour la mort des cellules sont essentielles pour la caractérisation de ces troubles, ainsi que le développement de stratégies thérapeutiques pour étendre ou réduire la survie cellulaire. Il y a actuellement des dizaines de techniques pour mesurer la mort cellulaire, soit directement, soit par le biais de substitution des marqueurs2. Par exemple, la mort cellulaire peut être évaluée visuellement à l’aide de colorants vitaux qui tachent sélectivement l....

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Protocole

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Tous les travaux d’animaux vertébré a été approuvé par le Comité sur l’utilisation et l’entretien des animaux à l’Université du Michigan (protocole # PRO00007096). Des expériences sont soigneusement planifiés afin de minimiser le nombre d’animaux sacrifiés. Enceinte femme sauvage (WT), rats Long Evans non transgéniques (Rattus norvegicus) sont logés séparément dans des chambres équipées avec enrichissement environnemental et pris en charge par l’unité de laboratoire Animal médecine (ULAM) à l’Université du Michigan, dans conformité avec le Guide de NIH-prise en charge pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Tous les rats ont été conservés da....

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Résultats

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Selon la méthode de transfection décrite ici, DIV4 neurones corticaux de rat ont été transfectées avec un plasmide codant la protéine fluorescente mApple. À partir de transfection après 24h, cellules ont été photographiés par microscopie de fluorescence toutes les 24 h pendant 10 jours consécutifs. Les images qui en résultent ont été organisés comme indiqué dans la Figure 2, puis cousus, empilés et a marqué pour la mort de cellules (Figur.......

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Discussion

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Ici, la méthodologie de contrôler directement la survie neuronale sur une seule cellule de base est présentée. Par contraste avec les tests traditionnels pour la mort des cellules qui se limitent à des moments discrets et des populations entières de cellules, cette méthode permet l’évaluation continue d’une variété de facteurs tels que la morphologie cellulaire, expression de la protéine ou la localisation, et permet de déterminer comment chaque facteur influence la survie cellulaire de manière prospective.

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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Nous remercions Steve Finkbeiner et membres du laboratoire Finkbeiner pour microscopie robotique d’avant-garde. Nous remercions également Dan Peisach pour la construction du logiciel initial requis pour le traitement de l’image et automatisée d’analyse de survie. Ce travail a été financé par l’Institut National des troubles neurologiques et Stroke (NINDS) R01-NS097542, Université du Michigan Protein Folding maladie Initiative et Ann Arbor Active contre l’ALS.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Neurobasal MediumGIBCO21103-049
Opti-MEMGIBCO31985-070
CompactPrep Plasmid Maxi KitQiagen12863
Chlorure de magnésium hexahydraté SigmaM9272
Acide kynurénique hydratéTCIH0303
Poly D-LysineMilliporeA-003-E
GlutamaxGIBCO35050-061
Lipofectamine 2000Invitrogen52887
B27 supplémentThermo FisherA3582801
Pénicilline/StreptomycineGIBCO15140122
96 plaquesTPP0876

Références

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  1. Lockshin, R. A., Zakeri, Z. Cell death in health and disease. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 11, 1214-1224 (2007).
  2. Kepp, O., Galluzzi, L., Lipinski, M., Yuan, J., Kroemer, G. Cell death assays for drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 10, 221-237 (20....

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Mots-clés

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