À l’aide au transfert d’énergie Fluorescence in Vitro pour étudier la dynamique des protéines Complexes à une échelle de temps de milliseconde

Melaku Garsamo; Yun Zhou; Xing Liu

doi:10.3791/59038

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Article de méthode

À l’aide au transfert d’énergie Fluorescence in Vitro pour étudier la dynamique des protéines Complexes à une échelle de temps de milliseconde

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DOI :

10.3791/59038

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14 mars 2019

Melaku Garsamo¹^,³ , Yun Zhou²^,³ , Xing Liu¹^,³

¹Department of Biochemistry, Purdue University, ²Department of Botany and Plant Pathology, Purdue University, ³Center for Plant Biology, Purdue University

Dans cet article

Résumé

Interactions protéines-protéines sont essentielles pour les systèmes biologiques, et des études de la cinétique de liaison donnent un aperçu de la dynamique et la fonction de complexes protéiques. Les auteurs décrivent une méthode qui quantifie les paramètres cinétiques d’une protéine complexe à l’aide de transfert d’énergie de fluorescence par résonance et la technique de flux stoppé.

Résumé

Les protéines sont les principaux opérateurs des systèmes biologiques, et généralement, ils interagissent avec d’autres macro - ou petites molécules pour remplir leurs fonctions biologiques. Ces interactions peuvent être très dynamiques, ce qui signifie que les sous-unités qui interagissent constamment associées et dissociées à certains taux. Tout en mesurant l’affinité de liaison à l’aide de techniques telles que quantitative déroulant révèle la force de l’interaction, étudier la cinétique de la liaison rapide permet de mieux comprendre comment l’interaction se produit et combien de temps chaque complexe peut exister. En outre, mesurer la cinétique d’une interaction en présence d’un facteur supplémentaire, comme un facteur d’échange de protéine ou d’une drogue, permet de révéler le mécanisme par lequel l’interaction est réglementée par l’autre facteur, fournissant des connaissances importantes pour la promotion de la recherche biologique et médicale. Nous décrivons ici un protocole de mesure de la cinétique de la liaison d’une protéine complexe qui a un taux élevé association intrinsèque et peut être dissocié rapidement par une autre protéine. La méthode utilise le transfert d’énergie de fluorescence resonance pour signaler la formation du complexe protéine in vitro, et il permet la surveillance de la liaison rapide et dissociation du complexe en temps réel sur un fluorimètre flux stoppé. À l’aide de ce test, les constantes de vitesse association et dissociation de la protéine complexe sont quantifiées.

Introduction

Activités biologiques sont effectuées en fin de compte par des protéines, plus de qui interagissent avec les autres pour des fonctions biologiques appropriées. En utilisant une approche computationnelle, le montant total des interactions protéine-protéine chez l’homme est estimé à ~ 650 000¹et perturbation de ces interactions souvent conduit à des maladies². En raison de leur rôle essentiel dans le contrôle des processus cellulaires et organismiques, plusieurs méthodes ont été développées pour l’étude des interactions protéine-protéine, comme deux-hybride de levure, complémentation de fluorescence bimoléculaire, split-lu....