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Article de méthode

Avancée d’imagerie du poumon Homing des Lymphocytes humains dans un modèle In Vivo de l’Inflammation allergique, issue des feuilles lumière microscopie expérimentale

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DOI :

10.3791/59043

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16 avril 2019

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1Department of Medicine 1, University Hospital of Erlangen, 2Department of Medicine 3, University Hospital of Erlangen

Dans cet article

Résumé

Le protocole introduit ici permet la caractérisation de la capacité de radioralliement pulmonaire des lymphocytes humains primaires dans des conditions inflammatoires in vivo. Une infiltration pulmonaire des cellules immunitaires humaines moutschen transférés dans un modèle murin d’inflammation allergique peut être imagée et quantifiée par microscopie à fluorescence lumière-feuille de tissu pulmonaire chimiquement défrichées.

Résumé

Accumulation dans les tissus de cellules immunitaires activées hautement représente une caractéristique de diverses maladies inflammatoires chroniques et a émergé comme une cible thérapeutique séduisante dans la prise en charge clinique des patients affectés. Afin d’optimiser les stratégies visant à un règlement thérapeutique de l’infiltration des tissus pathologiquement déséquilibrée des cellules immunitaires pro-inflammatoires, il sera particulièrement important pour atteindre les aperçus améliorés en maladie et organe-spécifiques propriétés homing des lymphocytes périphériques. Le protocole expérimental décrit ici permet de contrôler l’accumulation des lymphocytes humains fluorescent étiquetés et moutschen transférés dans le cadre d’une inflammation pulmonaire induite par la papaïne poumon. Contrairement aux tests in vitro standards fréquemment utilisés pour l’analyse de la migration des cellules immunitaires et la chimiotaxie, le paramètre in vivo maintenant introduit tienne compte des aspects spécifiques du poumon d’organisation tissulaire et l’influence du complexe inflammatoire scénario qui se déroulent dans l’organisme murine vivant. En outre, imagerie microscopique en trois dimensions transversales lumière-feuille fluorescence ne fournit pas uniquement des données quantitatives sur l’infiltration de cellules immunitaires, mais représente aussi le modèle de la localisation des cellules immunitaires dans l’inflammation pulmonaire. Dans l’ensemble, nous sommes en mesure de présenter une technique innovante de haute valeur pour la recherche immunologique dans le domaine des pneumopathies inflammatoire chronique, qui peut être facilement appliqué en suivant le protocole étape par étape fourni.

Introduction

Troubles inflammatoires classiques du poumon, telles que l’asthme allergique et la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC), sont bien connus pour être chassés par un augmentation du recrutement des lymphocytes activés dans le tissu pulmonaire1,2. Les cytokines lymphocytes-réalisé (par exemple, IL-4, IL-5, IL-9, IL-13, IFN-γ et TNF-α) promouvoir davantage le chimiotactisme des cellules immunitaires innées et adaptatives, induire de remodelage des voies aériennes fibreuses ou endommager directement le poumon parenchyme2. Jusqu'à présent, les mécanismes sous-jacents responsables de l’accumulation pathologique des lymphocytes dans les tissus pulmonaires ne sont pas encore bien compris. Par analogie avec l’empreinte de tissus sélective des cellules T pour le homing gut et cutanée, pulmonaires cellules dendritiques (CD) sont évidemment en mesure d’amorcer des cellules T périphériques pour l’infiltration pulmonaire préférentiels, au moins en partie par l’intermédiaire de l’induction de l’expression CCR4 sur la surface des lymphocytes3. Outre CCR4, voies respiratoires-infiltration des lymphocytes T sont également caractérisés par une expression particulièrement accrue des récepteurs chimiokines CCR5 et CXCR3 par rapport aux cellules T dans le sang périphérique1,4,5. Dans l’ensemble, les données sont compatibles avec le concept que homing poumon des lymphocytes T dans des conditions physiologiques ou inflammatoires implique un certain nombre de récepteurs de chimiokines différents et leurs ligands respectifs et donc dépend une étroite collaboration contrôlé la collaboration entre cellules immunitaires innée et adaptative1. En particulier, au cours de la phase initiale d’exposition pathogène ou allergène, les cellules du système immunitaire inné répondent à stimulation TLR ou à médiée par les IgE réticulation par la libération immédiate des chimioattractants différents, comme LTB4, CCL1, CCL17, CCL22, CCL20, CXCL10 et PGD21,6,7. Comme un excellent exemple, l’interaction entre PGD2 et le récepteur du facteur chimiotactique CRTh2 est connu pour être d’une importance particulière pour le chimiotactisme des cellules Th2 et apparaît donc aussi prometteur cible thérapeutique dans la prise en charge clinique de l’asthme. En effet, les patients souffrant d’asthme modéré a montré une amélioration des symptômes et une augmentation significative du volume expiratoire forcé en une seconde (VEMS1) après le traitement avec un antagoniste sélectif de CRTh2 par rapport au groupe placebo8 ,9. Dans un état plus ont progressé de la réponse inflammatoire, déjà recruté des lymphocytes T sont capables d’augmenter davantage accumulation pulmonaire lymphocytaire via la libération d’IL-4 et IL-13 comme stimulus puissants pour des contrôleurs de domaine pulmonaires. Par la suite, ces cellules myéloïdes innées de la régulation l’expression de CCL17 et CCL22 dans une fonction STAT6 manière1,10,11.  Bien que la complexité du scénario décrit empêche toujours une compréhension complète de poumon de cellules de T d’autoguidage, elle offre une multitude de cibles moléculaires pour un contrôle optimisé potentiellement thérapeutique des maladies pulmonaires inflammatoires ou allergiques. Par conséquent, il y a un besoin urgent de techniques expérimentales novatrices, qui sont en mesure d’approfondir et compléter nos connaissances dans le domaine du chimiotactisme des cellules T et domiciliation de poumon.

Due au fait que homing poumon des lymphocytes dans le corps humain est influencé par plusieurs paramètres physiques, humorale et cellulaire1, la plupart des méthodes expérimentales existantes n’est pas en mesure de modéliser la complexité entière de ce processus immunologique. Au lieu de cela, beaucoup de protocoles normalisés pour l’analyse du poumon homing sélectivement se concentrent sur un aspect précis impliqué dans la cascade d’attraction lymphocytaire, adhésion, la migration et rétention. Outre une décision purement descriptive du ARNm ou protéine modèle expression des intégrines et chemokine récepteurs sur les lymphocytes périphériques ou poumon-infiltration et la mesure complémentaire des niveaux respectifs de chemokine dans le sang, lavage broncho-alvéolaire (LBA) ou tissu pulmonaire12,13,14,15, essais de culture in vitro de cellules bien établies permettent une caractérisation fonctionnelle de l’adhérence des lymphocytes ou chimiotactisme dès défini des conditions expérimentales16,17,18. En principe, tests d’adhérence in vitro statique surveillent la capacité de liaison des lymphocytes cultivés à une monocouche endothéliale ou à lames en verre recouverts de molécules d’adhérence endothéliales recombinante (p. ex., MAdCAM-1, VCAM-1), alors que norme in vitro la chimiotaxie dosages sont généralement appliqués pour quantifier la capacité des lymphocytes à migrent le long d’un gradient de chemokine dans un système de transwell19. Les deux paramètres in vitro permettent un ajustement contrôlé et la modulation des conditions expérimentales, mais n’ont pas d’autre part des variables importantes qui critique les répercussions sur la chimiotaxie in vivo et l’adhérence des lymphocytes. Essentiellement, des essais de culture des cellules statiques ne pas tenir compte de l’influence des forces de cisaillement provoquées par le flux de sang permanent19 et potentiellement négligent l’implication du milieu immunologique environnante et interaction des cellules immunitaires des lymphocytes, tous deux présents dans un organisme vivant. Afin de surmonter ces limitations, l’interprétation des résultats acquis en statiques essais in vitro de chimiotactisme et de l’adhérence besoin encore validation dans des expériences d’adhérence dynamiques sous des conditions de débit20,21 et en Vivo modèles de pathologie inflammatoire orgue19. En effet, important pourraient tirer des conclusions sur la régulation de poumon de cellules de T d’autoguidage dans des conditions inflammatoires ou allergiques provenant d’études animales analyser génétiquement modifié souris dans des modèles définis de différentes maladies pulmonaires3, 22 , 23. la comparaison quantitative du poumon infiltration lymphocytes entre les souris de type sauvage et des souris ayant un déficit pour un gène spécifique d’intérêt représente un outil bien établi et largement utilisé pour définir l’impact du cellulaire particulière voies ou récepteurs sur le modèle axée sur la maladie de distribution de cellules T. Cependant, contrairement à avant discuté des essais de culture cellulaire in vitro, une conception de l’étude basée sur des modèles animaux classiques n’a pas la capacité d’analyser et de surveiller des cellules T humaines primaires directement dérivés du sang ou le BAL des patients souffrant d’une inflammation pulmonaire maladie. Ainsi, il reste encore difficile à valider sur le plan fonctionnel si une maladie pulmonaire diagnostique spécifié est apte imprimer des lymphocytes humains de tropisme préférentiel pulmonaire et dans quelle mesure les paramètres cliniques peuvent influer sur ce scénario. Récemment, une approche très élégante in vivo a été introduite dans le cadre des maladies inflammatoires de l’intestin (MII), qui est parvenue à surmonter la plupart de ces limitations et ouvert de nouvelles avenues de hautes études translationnelles sur lymphocytes intestinaux homing24 . Profitant des protocoles pour la compensation des tissus à base de solvants suivie de fluorecence feuilles lumière transversale comme un puissant outil d’imagerie, il était possible de visualiser les infiltrations et la distribution de cellules de T humaines moutschen transférés dans l’intestin des souris immunodéficientes colitic24. En particulier, ce paramètre expérimental mis en place deux innovations principales : (1) des cellules immunitaires humaines primaires peuvent être analysés dans des conditions déterminées expérimentalement in vivo ; (2) une assez grande surface de l’organe malade (environ 1,5 x 1,5 cm) peut être photographiée en qualité haute résolution, suivie de reconstruction 3D. En outre, plusieurs études récentes établi avec succès l’utilisation de tissus à base de solvant de compensation et la microscopie de fluorescence lumière-feuille comme des outils importants pour poumon avancé d’imagerie25,26. Pour bénéficier de cette avancée technologique dans le domaine de l’immunologie pulmonaire, nous avons adopté maintenant le système d’analyse des homing de poumon.

Le protocole présenté ici constitue une introduction étape par étape comment purifier et fluorescent étiquette primaire T humain cellules pour le transfert à des souris avec une inflammation pulmonaire induite et, en outre, décrit en détail le processus ultérieur de lumière-feuille microscopiques imagerie de fluorescence, y compris la préparation de l’orgue et de traitement d’image. Dans l’ensemble, nous espérons pouvoir soutenir les futures études translationnelles dans le domaine des maladies pulmonaires inflammatoires ou allergiques en introduisant une sophistiqué, mais néanmoins réalisable modèle expérimental de surveillance homing poumon lymphocytes humains conditions in vivo.

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Protocole

Dans les expériences impliquant des animaux ont été réalisés conformément aux protocoles approuvés par les autorités locales compétentes à Erlangen (Regierung von Unterfranken, Würzburg, Allemagne). Souris ont été logés dans des conditions spécifiques exempts de micro-organismes pathogènes. La collecte de sang humain a été approuvée par le comité local d’éthique et de la Commission de révision institutionnelle de l’Université d’Erlangen-Nuremberg. Chaque patient a donné consentement éclairé.

1. provoquer l’Inflammation pulmonaire allergique chez la souris

Remarque : Comme décrit dans les précédentes études27, la procédure expérimentale suivante permet induisant l’inflammation des voies respiratoires allergiques chez les souris et, en conséquence, déclenche l’accumulation de cellules immunitaires innées et adaptatives dans le BAL. Le protocole décrit a été établi chez les souris C57BL/6J, mais adoption à d’autres souches consanguines standards devrait être possible.

Voir Figure 1A , pour un résumé de la procédure expérimentale in vivo.

  1. Anesthésier souris par injection intrapéritonéale de kétamine/xylazine.
    Remarque :     utiliser uniquement la souris C57BL/6J âgés de 6 semaines et avec un poids d’au moins 16 g.
    1. Préparer la solution de la kétamine/xylazine dans du PBS (12 mg/mL kétamine ; xylazine 1,6 mg/mL) et de déterminer le poids exact des souris.
    2. Injecter la première souris avec 8 µL/g de poids corporel de kétamine/xylazine solution par voie intrapéritonéale et confirmer une anesthésie profonde par l’absence du réflexe pincée patte avant de procéder à l’étape 1.3.
  2. Fraîchement préparer 5 mg/mL de papaïne dans du PBS. Lentement, déposer 10µl (50 µg) de la solution de papaïne dans la narine. Surveillez attentivement la souris jusqu’au réveil.
  3. Répétez les étapes 1.1 et 1.2 pour toutes les souris comprises dans le test. Effectuez les étapes 1.1-1.3 sur trois jours consécutifs.

2. purifier et étiqueter fluorescent CD4 de sang périphérique humain+ T Cells

Remarque : Cellules processus dans des conditions stériles.

  1. Recueillir 18 mL de sang humain complet d’une veine périphérique. Effectuer la centrifugation en gradient de Ficoll-Hypaque afin de sélectionner la fraction des cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC).
    Remarque : Collecte et l’analyse du matériel humain primaire doivent être approuvés par les autorités locales d’éthiques. Seule une personne ayant une qualification médicale adéquate est autorisée à prélever le sang d’une veine périphérique.
    1. Recueillir le sang dans de l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)-contenant monovettes (1,6 mg EDTA/mL de sang) afin d’éviter la coagulation.
      Facultatif : Utiliser le sang de la couche leuco-plaquettaire, un sous-produit du don de sang enrichi dans les leucocytes, au lieu de sang veineux complet.
    2. Transférer le sang dans un tube conique de 50 mL et diluer 1:2 dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Soigneusement ajouter 10 mL de Ficoll-milieu (densité 1,077 g/mL) comme une couche de fond sous le sang dilué. Centrifuger l’échantillon (800 x g pendant 15 min à température ambiante sans frein).
    3. Avec précaution, retirer le tube de la centrifugeuse et l’interphase contenant des PBMC de transfert dans un nouveau tube conique de 50 mL. Jeter l’empeigne et la couche inférieure. Remplir le tube contenant des PBMC de PBS et centrifuger (300 x g pendant 10 min à 4 ° C). Retirez le surnageant.
      Remarque : Éventuellement, si nécessaire, effectuer la lyse des érythrocytes restants. Ajouter avec précaution 3 mL de tampon de lyse (ACP) d’ammonium-chlorure-potassium (chlorure d’ammonium de 155 mM, 19 mM potassium hydrogène carbonate et 0,68 mM EDTA, pH 7,27) au culot de cellules resuspendues et vortex l’échantillon. Secouer les tubes pendant 3 min. Pour retirer le tampon de lyse ACP, ajouter 40 mL de PBS et centrifuger (300 x g pendant 10 min à 4 ° C). Jeter le surnageant.
  2. Purifier les CD4+ T des cellules par l’intermédiaire de microbilles de CD4.
    Remarque : En général, il y a plusieurs distributeurs de microbilles magnétiques pour la purification de CD4 humain+ cellules, qui devraient se traduire par des niveaux comparables de la pureté de la cellule. Choix du produit doit reposer sur les préférences individuelles. Les étapes suivantes du protocole (2.2.2–2.2.7) sont ajustés à un produit défini de faisant CD4 et colonnes de séparation respectifs comme indiqué plus loin dans la Table des matières. Quelques modifications du protocole pourraient être requis en cas qu’un autre produit faisant de CD4 est sélectionné.
    1. Resuspendre le culot PBMC dans un minimum de 80 µL de PBS contenant 0,5 % sérum fœtal (SVF) et 2 mM EDTA (PBS/FBS/EDTA-tampon) par 107 PBMC. Utiliser une population de départ d’environ 30 x 106 PBMC afin finissons-en avec environ 3 x 106 à 6 x 106 purifiée CD4 humain+ T des cellules.
    2. Ajouter 20 µL de microbilles de CD4 par 107 PBMC, mélanger doucement et laisser incuber 20 min à 4 ° C. Remplir le tube de PBS/FBS/EDTA-tampon (refroidi à 4 ° C) et centrifugeuse (300 x g pendant 10 min à 4 ° C). Retirez le surnageant.
    3. Placer une colonne de séparation dans un champ magnétique. Rincer la colonne avec 3 mL de PBS/FBS/EDTA-tampon. Resuspendre le culot dans 500 µL de PBS/FBS/EDTA-tampon (refroidie à 4 ° C) et transférer la suspension de cellules dans la colonne de séparation rincés placée dans un champ magnétique.
    4. Rincer la colonne de séparation trois fois avec 3 mL de PBS/FBS/EDTA-tampon (refroidie à 4 ° C) et jeter les effluents.
    5. Supprimez la colonne de séparation du champ magnétique et le placer dans un tube de 15 mL. Éluer les CD4+ la fraction cellulaire dans 5 mL de PBS/FBS/EDTA-tampon à l’aide du piston.
    6. Remplir le tube de PBS et centrifuger (300 x g pendant 10 min à 4 ° C). Retirez le surnageant. Répétez cette étape de laver deux fois.
    7. Déterminer le nombre de cellules ont donné par une méthode standard de choix (p. ex., chambre de Neubauer).
  3. Étiqueter les CD4+ T les cellules avec un colorant de prolifération de cellules fluorescentes.
    1. Resuspendre le CD4+ T cells dans du PBS (jusqu'à 107 cellules/mL ; ne pas utiliser à moins de 500 µL de PBS).
    2. Préparer une solution de 6 µM d’une prolifération des cellules excitables-lumière rouge teindre (voir Table des matières) dans du PBS (préchauffée à température ambiante). Mélanger cette solution 1:2 à l’avant, préparé minutieusement suspension cellulaire et vortex (concentration finale de 3 µM).
    3. Incuber pendant 10 min à 37 ° C (abri de la lumière). Ajouter par la suite, les cinq volumes du milieu RPMI contenant 10 % de SVF et incuber pendant 5 min sur glace (abri de la lumière).
    4. Lavage étiquetés cellules trois fois dans RPMI moyen contenant 10 % SVF (centrifuger à 300 x g pendant 10 min à 4 ° C). Remettre en suspension les cellules marquées dans du PBS, stocker sur la glace et protéger de la lumière jusqu'à l’utilisation.
      Remarque : Une conservation de cellules plus longue (> 60 min) aurait un impact négatif sur la survie des cellules.
      Facultatif : Déterminer la pureté de la CD4+ fraction et l’efficacité de la procédure d’étiquetage des cellules par cytométrie en flux. Remettre en suspension 0,5 x 106 à 1 x 106 CD4+ cellules dans 100 µL de tampon (1 % FBS, 2 mM EDTA dans du PBS) et ajouter un anticorps de CD4 anti-humain couplé avec un colorant fluorescent de choix. Incuber 30 min à 4 ° C. Ajouter 1 mL de tampon et centrifuger (300 x g pendant 10 min à 4 ° C). Jeter le surnageant. Procéder à la mesure de débit par cytométrie en flux de l’échantillon (résultat représentatif est représentée sur la Figure 1B, C).

3. moutschen transfert humaines CD4 des cellules+ T en Mmice destinataire papaïne-exposés

Remarque : Voir Figure 1A , pour un résumé de l’in-vivo effectué procédure expérimentale. Effectuer des transferts de cellule, un jour après la dernière administration intranasale de la papaïne.

  1. Ajuster la suspension de CD4 humain fluorescent étiquetés+ T (étape 2.3.4) des cellules à une concentration de 1 x 107 cellules/mL dans du PBS. Remplir 100 µL de la suspension cellulaire dans un 1 mL/30 G-seringue.
  2. Placer soigneusement la première souris de C57BL/6J exposés à la papaïne (étapes 1,1 à 1,3) dans un dispositif de retenue pour injection dans la veine queue. Utilisez la seringue préparée (étape 3.1) à ponctionner la veine caudale et injecter lentement 100 µL de la suspension cellulaire contenant 1 x 106 étiqueté CD4 humain+ cellules. Ne tirez pas immédiatement l’aiguille après l’injection, mais attendez encore 5 secondes afin d’éviter la décharge de la suspension cellulaire.
  3. Relâchez le bouton de la souris depuis le dispositif de retenue et continuer avec le prochain animal. Garder un animal au moins exposés à la papaïne, qui ne subit pas de transfert avec cellules fluorescent étiquetés pour servir de témoin négatif pour la microscopie de fluorescence lumière-feuille.

4. préparer les tissus pulmonaires pour la microscopie de Fluorescence lumière-feuille

Remarque : Les étapes suivantes sont effectuées 3 h après que le transfert de fluorescent étiqueté des cellules humaines (étape 3.2). Les procédures expérimentales décrites dont la cueillette des tissus pulmonaires, fixation et tissus à base de solvant de compensation ont été adaptés de protocoles décrits actuellement24,28.

  1. Sacrifier la souris par inhalation de dioxyde de carbone (C02).
  2. Perfuse le poumon in situ avec du PBS contenant 5 mM EDTA.
    1. Ouvrir le thorax via coupe le long du sternum pour exposer le cœur. Ponctuée le ventricule droit avec une canule de 21 G reliée à un cathéter.
    2. Ouvrez le ventricule gauche en coupant et ainsi permettre au liquide de sang et perfusion quitter. Lentement perfuse le poumon avec 20 mL de PBS glacée contenant 5 mM EDTA via le cathéter.
  3. Afin d’effectuer la fixation in situe du poumon, ne pas retirer le cathéter du ventricule droit. Lentement perfuse le poumon avec 2 mL de paraformaldéhyde glacée de 4 % (PFA) résolu dans du PBS. Retirer le cathéter et la canule.
    Remarque : PFA-base de fixation in situe du tissu pulmonaire représente une technique bien établie afin de préparer les tissus pulmonaires murin pour analyse microscopique ultérieure29,30.
    Mise en garde : PFA est toxique et doit être manipulé sous une hotte avec soin.
  4. Remplir les poumons de 0,75 % d’agarose in situ.
    1. Préparer de 0,75 % d’agarose dans du PBS et gardez-le solide à 50 ° C dans un thermo-shaker jusqu'à utilisation. Enlever les glandes salivaires de la souris, couper le muscle sternohyoid et exposer la trachée en glissant un forceps sous.
    2. Ponctuent la trachée exposée avec une aiguille de 30 G et remplacez-le par un cathéter 30 G émoussé pour prévenir d’autres dommages de la trachée et fuite indésirable d’agarose. Sceller la jonction entre le cathéter et la trachée, à l’aide d’un porte-aiguille.
      Facultatif : Combiner l’ici décrit la procédure avec collection de BAL pour analyser des cellules humaines infiltrés de BAL comme l’a récemment décrit dans le détail,31 (voir Figure 2E pour les résultats représentatifs).
    3. Remplissez soigneusement les voies respiratoires avec 0,75 % d’agarose (refroidi à la température corporelle) via le cathéter jusqu’au déroulement complet du poumon ; attendre jusqu'à solidification complète de l’agarose. Retirer le cathéter et soigneusement récolter le poumon dans un obscure 2 mL tube rempli de 4 % PFA.
  5. Pour une fixation supplémentaire incuber l’échantillon chez 4 % PFA résolu dans du PBS pendant 2 h à 4 ° C sous rotation continue (tr/min 31).
  6. Déshydrater des tissus en incubant ensuite l’échantillon à rotation continue (31 tr/min) à 4 ° C à 50 % d’éthanol (pH 9), éthanol à 70 % (pH 9) et 100 % d’éthanol ; chaque étape pendant au moins 4 h. À la fin, effectuez une deuxième période d’incubation dans l’éthanol 100 % frais pendant 4 h.
  7. Effectuer la compensation solvantée du tissu à l’aide de cinnamate d’éthyle (ECi). Par conséquent, transférer l’échantillon dans ECi. Incuber une nuit à température ambiante (sous rotation constante) jusqu'à ce que le tissu apparaît translucide (voir Figure 1D pour images représentatives).
    Remarque : Les échantillons stockés dans ECi à température ambiante (Abrie de la lumière) sont restés stables pendant quelques semaines ou mois.

5. effectuer la microscopie de Fluorescence lumière-feuille de Lobes pulmonaires Wwhole murin

Remarque : S’il vous plaît voir la Table des matières pour plus d’informations sur le microscope à fluorescence lumière-feuille et le logiciel correspondant, sur lequel reposent les étapes suivantes. Des systèmes comparables par d’autres fabricants, cependant, peuvent être utilisés aussi bien avec modifications spécifique du protocole suivant. Avant de commencer, familiarisez-vous avec le mode d’emploi spécifique au microscope et suivez les instructions techniques par la personne responsable sur site.

  1. Mettre en place le microscope de lumière-feuille.
    1. Allumez le microscope de lumière-feuille et ouvrez le logiciel sur l’ordinateur d’imagerie correspondant. Remplissez le compartiment de mesure avec ECi filtrée (filtre 100µm) et placez-le dans sa position entre les faisceaux laser.
    2. Une petite goutte de colle de stable à solvant organique permet de coller le poumon pour le porte-échantillon. Pour que la profondeur de l’emboitement des lumière-feuilles aussi petit que possible, affectez le lobe pulmonaire debout. Ensuite, placez le porte-échantillon dans sa chambre.
    3. La valeur de l’indice de réfraction de l’objectif 3.5 lorsque ECi est utilisé comme réactif de compensation.
  2. Effectuez les réglages au microscope lumière-feuille pour détecter les cellules humaines dans le contexte de la totalité de l’organe.
    1. Sélectionnez les lasers nécessaires (filtre pour mesure > activer les cases à cocher des lasers nécessaires) et choisissez les intensités appropriées dans le logiciel de contrôle (laser de contrôle de transmission > utiliser le curseur pour définir laser intensité > s’applique). Utiliser une longueur d’onde d’excitation de 488 nm (525/50 filtre) pour détecter les tissus pulmonaires auto-fluorescente et 640 nm (680/30 filtre) pour exciter des cellules humaines marquées avec un fluorophore émettant dans le spectre rouge.
    2. Mettre l’accent sur l’échantillon excitée à 488 nm et adapter la mise au point via l’outil « correction chromatique » à la longueur d’onde d’excitation de 640 nm (utilisez le curseur pour régler la correction chromatique > appliquer).
    3. Choisissez un facteur de zoom approprié ; utiliser une vue d’ensemble de faible grossissement (p. ex., 6,3 x) afin de déterminer la répartition générale des cellules marquées au sein des tissus pulmonaires et les images grossies (p. ex., 32 x) pour la localisation détaillée.
    4. Sélectionnez une largeur de feuille uniformément élucider l’organe entier ou une section spécifique d’intérêt (optique > utilisez le curseur pour définir la largeur de la feuille; habituellement entre 20 à 40 %). Définir l’ouverture numérique de feuille (NA) avec NA supérieur, créant des images plus nettes (optique > utilisez le curseur pour définir la feuille NA; pour un lobe de poumon murine élargi à son importance physiologique permet souvent une NA de 0,025 %).
    5. Sélectionnez le nombre de feuilles de lumière pour être utilisé sous « paramètres de mesure avancée ». En cas d’éclairage bidirectionnel, fusionner les feuilles de lumière gauche et droite pour créer une image homogène lumineuse (Avancé > fusionner lightsheets > sélectionnez mode de mélange > utilisez les curseurs pour définir le chevauchement entre les deux feuilles de lumière).
      Remarque : Il est recommandé de profiter de l’éclairage bidirectionnel de l’échantillon avec trois feuilles de lumière chacun.
      Facultatif : Pour augmenter encore la qualité de l’image, utilisez l’opération focus dynamique. Cela permet de déplacer le focus dans la direction x lors de l’acquisition de l’image.
    6. Définir des positions de début et de fin de la z-pile pour mesurer et définir la taille de palier à 5 µm (Z xyz-table > scanner gamme).
      Remarque : Positions de début et fin d’une z-pile dépendent de la taille et le positionnement du lobe pulmonaire au sein de la chambre de mesure. Cependant, environ 300 à 800 z-piles sont habituellement acquis pour un lobe de poumon unique (taille de palier de 5 µm).
    7. Enregistrer des fichiers à l’aide de « paramètres de sauvegarde automatique » et démarrez la mesure pour capturer des images. Après la finition d’acquisition de données, nettoyer la salle sous l’eau courante et le porte-échantillon contaminé par ECi.
      Remarque : Utiliser les mêmes paramètres à l’image de plusieurs lobes pulmonaires qui sont censés être comparé par la suite.

6. image après traitement et la Quantification des cellules humaines poumon-accumulé

Remarque : Consultez la Table des matières pour plus de détails sur le logiciel d’imagerie post pour l’analyse 3D, sur lesquels reposent les étapes suivantes. Cependant, alternative post-logiciels d’imagerie peut être utilisé aussi bien.

  1. Charger la première image d’une z-pile (activer le bouton surpass, fichier > ouvrir > sélectionnez l’image) afin de lancer l’ouverture de toutes les autres images de la z-pile choisie et leur reconstruction 3D automatique.
  2. Afin d’assurer un affichage correct de x, y et z dimensions, vérifier les tailles de voxel et ajustez-les si nécessaire (modifier > propriétés de l’image > Entrez la taille du voxel manuellement). Pour la taille du voxel de z, entrez la taille de palier choisie entre deux images (ici 5 µm).
  3. Afficher chaque chaîne en une couleur distincte (edit > afficher le réglage de l’affichage). Cliquez sur chacun des canaux un après l’autre pour définir une couleur de choix (dans la Figure 2A, B, C, D le signal de l’autofluorescence est affiché en gris et étiqueté humaines CD4 des cellules+ en rouge).
  4. Régler l’intensité, niveau de noir et de contraste pour chaque canal (edit > afficher le réglage de l’affichage) en utilisant les triangles dans les bars de canal ou en entrant le nombre exact dans des canaux de communication. Réglage de l’intensité, utiliser le triangle rectangle. Pour le réglage du niveau de noir, utiliser le triangle gauche et pour le réglage du contraste, utiliser le triangle central.
    Remarque : Utilisez le poumon dérivée de la souris de contrôle sans transfert de cellules (étape 3.3) faire la différence entre les signaux de culture cellulaire humaines spécifiques et non-spécifique fond.
  5. Pour quantifier les cellules marquées dans le tissu pulmonaire utilisent « ajouter de nouveaux spots » dans la barre d’outils et sélectionnez « ignorer la création automatique, modifiez manuellement » pour le comptage des cellules manuelle.
    Remarque :     vous pouvez également utiliser la cellule automatique comptage outil sous « points ». Cependant, comptage manuel permet de distinguer plus précisément les signaux spécifiques et non spécifiques.
    1. Pour comparer l’accumulation de cellules humaines entre les différents échantillons, définir un cube de poumon avec un volume spécifique à l’aide de l’outil de découpe 3D (edit > 3D des cultures) (ici 813 μm x 813 μm x 1,000 μm).
    2. Pour compter cellules accumulé sélectionnez canal 640 nm et définir une « échelle de rayon » de 10 µm. Cliquez ensuite sur «modifier», cochez «sélectionner» dans le menu de pointeur et marquer chaque cellule avec un point via Maj-clic avec le bouton gauche de la souris. Trouver le nombre total de cellules comptées affichés dans les statistiques.
      Remarque : Il est fortement recommandé de compter plusieurs cubes par lobe pulmonaire (ici 5) pour garantir la fiabilité des résultats et de compenser pour la sélection scientifique dépendant du volume pulmonaire comptés (résultats de stratégie et de représentant de quantification sont représentés en Figure 2D).
  6. Capturer une image à l’aide de l’outil « instantané » et/ou de prendre une vidéo à l’aide de l’outil de « animation ». Enregistrer ajusté les fichiers sous forme de fichiers .ims (fichier > exporter).
    Remarque : À des fins représentatives, afficher ou masquer la trame en cochant ou décochant l’image dans la barre d’outils. En outre, affichage des images en tant que projection d’intensité maximale (MIP) (toolbar > volume > mode > vérifier MIP) ou utiliser le « mode de surface (barre d’outils > ajouter des nouvelles surfaces). Le « mode de surface doit être activé séparément pour chaque canal mettre en évidence l’architecture de tissu ou de corps cellulaires (images représentatives sont montrées dans la Figure 2C).

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Résultats

Le protocole présenté décrit un modèle expérimental de souris, qui permet la surveillance et quantification de l’accumulation de moutschen transféré les lymphocytes T humains dans les poumons par l’intermédiaire de la microscopie en fluorescence lumière-feuille. Figure 1 A fournit un aperçu schématique des étapes de la planification expérimentale in vivo. Afin de garantir des résultats fiables, il est d’une importance essentielle pour assurer une bonne qualité de l’isolement...

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Discussion

Le paramètre expérimental décrit ici offre la possibilité de contrôler la capacité de radioralliement pulmonaire des principales cellules immunitaires humaines sous des conditions inflammatoires in vivo et donc pertinente compléments classiquement effectuée chimiotactisme et adhérence in vitro dosages. Pour prendre en compte les caractéristiques spécifiques organe anatomique du poumon, des aspects importants de cellules immunitaires d’autoguidage (incluant la distribution de chimiotactisme et...

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Déclarations de divulgation

M.F. Neurath a servi comme conseiller pour Pentax, Giuliani, MSD, Abbvie, Janssen, Takeda et Boehringer. Les autres auteurs ne pas divulguer tout conflit.

Remerciements

Les auteurs remercient financement par la DFG Collaborative Research Centers SFB 1181 et 241 de la TRR. L’Optical Imaging Centre Erlangen (OICE) et en particulier Ralf Palmisano, Philipp Tripal et Tina Fraaß (projet Z2 de la DFG CRC 1181) sont reconnus pour un soutien technique spécialisé pour l’imagerie microscopique de fluorescence lumière-feuille.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Agarose NEEO UltraCarl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Allemagne2267.4
AlexaFlour594 anticorps anti-CD45 humainBioLegend, San Diego, États-Unis304060
Chlorure d’ammoniumCarl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, AllemagneCanule K2981
21 GBecton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, États-Unis301300
Colorant pour prolifération cellulaire eflour670eBioscience Inc., San Diego, États-Unis65-0840-85
CD4 MicroBeads, humanMiltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany130-045-101
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Allemagne8043.1
Tube de prélèvement sanguin de potassium-EDTA, 9 mLSarstedt AG & Co., Nü ; mbrecht, Allemagne21066001
Ethly cinnamate (ECi)Sigma-Aldrich, Steinheim, Allemagne112372-100G
Éthanol &ge ; 99.5 % (EtOH)Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Allemagne5054.3
FBS (sérum de bovin fœtal) Good FortePAN-Biotech GmbH, Aidenbach, AllemagneP40-47500
Filtre 100 µ ; m  ;VWR International Germany GmbH, Darmstadt, Allemagne732-2758
Imaris Image Analysis Software 9.0.2Bitplane AG, Zurich, Suissen.a.ImspectorPro
softwareAbberior Instruments GmbH, Gö ; ttingen, Allemagnen.a.Ketamin
  ;Inresa Arzneimittel GmbH, Fribourg, Allemagne3617KET-V
LaVision UltraMicroscope IILaVision BioTec GmbH, Bielefeld, Allemagnen.a.MACS
MultiStandMiltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Allemagne130-042-303
Canule Multifly 20 GSarstedt AG & Co., Nü ; mbrecht, Allemagne851638035 Aiguille 30
GB. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hesse, Allemagne9161502
Neubauer chambre de comptageneoLab Migge GmbH, Heidelberg, AllemagneC-1003
Pattex GlueHenkel AG & Co, Dü ; sseldorf, AllemagnePSK1C
LS columnMiltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Allemagne130-042-401
Milieu de séparation des lymphocytes (densité 1 077 g/mL)anprotecAC-AF-0018
PapainMerck1 071 440 025
PBS Dulbecco (solution saline tamponnée au phosphate)Biochrom GmbH, Berlin, AllemagneL182-10
PerCP/Cy5.5 anti-human CD4BioLegend, San Diego, États-Unis317428
PerCP/Cy5.5 souris IgG2b, isotype &kappa ; CtrlBioLegend, San Diego, États-Unis400337
PFA (paraformaldéhyde)Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Allemagne0335.1
Hydrogénocarbonate de potassiumCarl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, AllemagneP7481
Pipette sérologique 10 mLSarstedt AG & Co., Nü ; mbrecht, Allemagne86.1254.001  ;
Seringue 1 mLB. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hesse, Allemagne9166017V
Seringue 5 mLBecton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, États-Unis260067
Seringue 20 mLBecton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, États-Unis260069
Tube 1,5 mLSarstedt AG & Co., Nü ; mbrecht, Allemagne72 706 400
Tube 2 mLSarstedt AG & Co., Nü ; mbrecht, Allemagne72.695.400  ;
Tube de 2 mL, brunSarstedt AG & Co., Nü ; mbrecht, Allemagne72 695 001
Tube 15 mLSarstedt AG & Co., Nü ; mbrecht, Allemagne62.554.502  ;
Tube 50 mLSarstedt AG & Co., Nü ; mbrecht, Allemagne62.547.254  ;
Séparateur QuadroMACSMiltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Allemagne130-090-976
Xylazin (Rompun 2 %)Bayer Vital GmbH, Leverkusen, AllemagneKPOBD32

Références

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