La pneumonectomie gauche combiné avec Monocrotaline ou Sugen comme un modèle d’Hypertension pulmonaire chez le rat

Résumé

La pneumonectomie gauche rongeur est une technique utile dans la recherche d’une hypertension artérielle pulmonaire. Nous présentons ici un protocole visant à décrire la procédure de pneumonectomie rat et les soins post-opératoires afin d’assurer la mortalité et la morbidité minime.

Résumé

Dans ce protocole, nous détaillons les étapes de la procédure correctes et précautions nécessaires pour effectuer une pneumonectomie gauche et induisent des HAP chez les rats avec l’administration supplémentaire de monocrotaline (MCT) ou SU5416 (Sugen). Nous comparons également ces deux modèles à d’autres modèles de HAP couramment utilisés dans la recherche. Ces dernières années, la mise au point des modèles animaux de HAP a poussé vers l’étude du mécanisme d’angioproliferation des lésions plexiforme, dans laquelle le rôle de la circulation sanguine pulmonaire accrue est considéré comme un déclencheur important dans le développement de graves pulmonaire le remodelage vasculaire. Un des modèles rongeurs plus prometteurs de l’augmentation du débit pulmonaire est la pneumonectomie gauche unilatérale combinée avec un « second coup » de MCT ou Sugen. La suppression du poumon gauche mène à la circulation sanguine pulmonaire accrue et turbulent et remodelage vasculaire. Il n’existe actuellement aucune procédure détaillée de la chirurgie de la pneumonectomie chez les rats. Cet article décrit un protocole étape par étape de la procédure chirurgicale pneumonectomie et soins postopératoires chez les rats Sprague-Dawley. En bref, l’animal est anesthésié et le coffre est ouvert. Une fois que l’artère pulmonaire gauche, veines pulmonaires et des bronches sont visualisées, ils sont ligaturés et le poumon gauche est supprimé. La poitrine puis fermé et récupéré l’animal. Sang est obligé de circuler uniquement sur le poumon droit. Cette augmentation de la pression vasculaire entraîne un remodelage progressif et l’occlusion des petites artères pulmonaires. Le deuxième coup de MCT ou Sugen est utilisé une semaine après la chirurgie pour induire la dysfonction endothéliale. La combinaison de l’augmentation du débit sanguin dans le poumon et la dysfonction endothéliale produit HAP sévère. La principale limite de cette procédure est qu’il exige des compétences chirurgicales générales.

Introduction

Hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) est une maladie progressive et mortelle caractérisée par une augmentation du débit sanguin pulmonaire, augmentation de la résistance vasculaire, l’inflammation et remodelage des petits vaisseaux sanguins pulmonaires¹. Ce remodelage habituellement se traduit par des lésions vasculaires qui obstruent et oblitérer les petites artères pulmonaires, provoquant une vasoconstriction et augmentant le ventricule droit postcharge². Il existe peu de traitements pharmacologiques réussie de HAP ; en conséquence, vestiges de la mortalité liée au HAP hautes. Récemment, au centre de recherche sur la pathologie de l’hypertension pulmonaire a déménagé vers un mécanisme d’angio-prolifération dans laquelle le rôle de la circulation sanguine pulmonaire accrue est considéré comme un déclencheur important dans le développement de pulmonaire vasculaire remodelage des^3,4.

Modèles animaux d’hypertension pulmonaire ont fourni des idées essentielles qui aident à expliquer la physiopathologie de la maladie et ont servi de plateforme pour drogue, cellule, gène et la protéine livraison. Traditionnellement, le modèle de l’hypertension pulmonaire induite par l’hypoxie chronique et le modèle de lésion pulmonaire MCT ont été les principaux modèles utilisés pour étudier les HAP physiopathologie⁵. Toutefois, ils ne sont pas suffisants pour produire une augmentation artérielle pulmonaire flux néointimale tendance et du remodelage par rapport aux modifications décrites chez des patients humains. Le modèle de l’hypoxie chronique chez les rongeurs se traduit par l’épaississement des parois des vaisseaux avec vasoconstriction hypoxique sans angio-oblitération des petits vaisseaux pulmonaires⁶. En outre, la condition d’hypoxie est réversible. Ainsi, le modèle de l’hypoxie n’est également pas suffisant pour produire des HAP sévère. Le modèle de lésion pulmonaire MCT provoquer une dysfonction endothéliale, mais les lésions vasculaires oblitérante complexes, trouvées chez l’homme avec le PAH primaire sévère ne se développent pas dans le rat². En outre, chez les rats traités MCT ont tendance à mourir de la toxicité pulmonaire induite par le MCT, maladie veino-occlusive du foie et la myocardite plutôt que de PAH². Enfin, la pneumonectomie seule ne suffit pas produire des lésions néointimale dans les petits vaisseaux pulmonaires dans un court laps de temps. Après la pneumonectomie, il y a élévation minimale dans la pression artérielle pulmonaire⁷. Chez l’homme, la pneumonectomie est bien tolérée lorsque le poumon controlatéral est saine⁷.

Toutefois, la procédure de pneumonectomie gauche associée à MCT ou Sugen est avantageuse car elle imite la circulation sanguine pulmonaire accrue et se traduit par remodelage vasculaire pulmonaire comparable aux HAP clinique sévère. La pneumonectomie est effectuée sur le poumon gauche, qui a seulement 1 lobe, plutôt que sur la droite, qui a quatre lobes. Si le poumon droit a été supprimé, l’animal serait incapable de compenser l’insuffisance respiratoire. Dans le modèle de la pneumonectomie-MCT, néointimale modèle de remodelage se développe dans plus de 90 % des assurés-animaux traités⁷. De même, la combinaison des résultats Sugen et pneumonectomie en HAP grave, caractérisée par des lésions vasculaires angio-oblitérante, prolifération, apoptose et RV dysfonction⁸. La procédure de pneumonectomie gauche est également avantageuse par rapport aux autres interventions chirurgicales pour induire des HAP. Précédemment décrits chez les rats pour augmenter le débit sanguin pulmonaire vers les poumons ultrarésistant le shunt aorto-caval ou anastomose de l’artère sous-clavière-pulmonaire. Ces modèles sont extrêmement compliqués^7,9,10,11. Pour effectuer un shunt aorto-caval, abdomen de l’animal doit être ouvert. Le shunt est placé dans l’aorte abdominale, ce qui augmente le flux sanguin vers les organes abdominaux au lieu de juste les poumons, donc, Hap prend beaucoup plus de temps à développer. En outre, il est difficile de déterminer le débit sanguin à travers le shunt, alors qu’avec la pneumonectomie le sang couler à la doublette de poumon restant. L’anastomose de l’artère sous-clavière-pulmonaire a aussi beaucoup de complications. Le flux du sang artériel dans la veine peut mener à la thrombose de l’anastomose et saignements. Comme le shunt aorto-caval, il est difficile de déterminer la circulation sanguine par l’intermédiaire de l’anastomose. En outre, c’est une technique coûteuse et difficile qui nécessite des compétences chirurgicales vasculaires. La pneumonectomie gauche unilatérale double du débit sanguin et la contrainte de cisaillement dans le poumon controlatérale et, en combinaison avec MCT ou Sugen, provoque les constatations histopathologiques et hémodynamiques typiques des HAP qui est la cellule endothéliale dommages^{8, 12}.

La nouveauté de ce manuscrit est présentée dans le protocole chirurgical très détaillé et complet de la pneumonectomie gauche chez des rats et à la discussion des défis techniques et physiologiques de ces modèles. Parce que ce protocole n’est pas disponible, de nombreux chercheurs croient que le modèle est trop difficile. Les enquêteurs qui ont exercé la pneumonectomie gauche ont été confrontés à une mortalité élevée et des taux de morbidité associées à la perte inutile d’animaux, compromettre l’évaluation scientifique. Au lieu de cela, beaucoup utilisera des modèles classiques telles que l’injection, l’hypoxie chronique ou juste la pneumonectomie MCT pour créer des HAP. Toutefois, ces modèles sont beaucoup moins efficaces que la combinaison de MCT ou Sugen avec la pneumonectomie gauche. L’objectif principal de cet article est de fournir le protocole chirurgical d’abord détaillé et reproductible pour la pneumonectomie unilatérale gauche chez le rat et fournir le meilleur modèle chirurgical de HAP. Combinant ce protocole pour pneumonectomie unilatérale gauche avec MCT ou SU5416 permettra aux chercheurs de créer un modèle beaucoup plus efficace et cliniquement pertinent de HAP sévère pour l’étude de la pathogenèse de cette maladie mortelle.

Protocole

Les procédures décrites ci-dessous ont été approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de l’école de médecine de l’Icahn au mont Sinaï. Tous les rats ont reçu des soins compatissants en conformité avec le mont Sinaï « Guide for the Care and Use of Laboratory Animals ».

1. préparation pour la chirurgie

1. Autoclave Cooley-Mayo courbes droites ciseaux Iris (petits ciseaux), ciseaux de Vannas McPherson Iris (dos ciseaux), forceps de tissue Wangensteen (pince atraumatique), ciseaux (grands ciseaux), forceps tissue de Gerald, spéculum ordinaire brins (self en conservant rétracteur), cauterizer de petit bateau, gaze, sonde amphidrome, mince porte-aiguille vasculaire et Micro-Jacobson pinces hémostatiques de moustique (mosquito).

2. préparation et Intubation des Rats

1. Administrer une injection sous-cutanée de buprénorphine analgésie (0,1 mg/kg) chez les rats Sprague-Dawley mâles, de vieux de 6 à 8 semaine, 30 min avant la chirurgie.
2. Placez le rat individuellement dans une chambre exposée à l’isoflurane 4 % et d’oxygène (1 L/min) pendant 3-4 min jusqu'à ce que le rat est correctement anesthésié (c.-à-d., inconscient, respirer lentement et ne répond plus à toucher ou à paraître).
3. Intubation de Rats
   1. Retirer le rat de la chambre et le rat à un conseil d’administration du ruban adhésif pour le rat repose à plat sur le dos, la bouche au bord du Conseil d’administration. Chaîne permet de tenir le rat par les deux dents de devant pour que le col reste plates/droites.
   2. Placer une source de lumière de fibre optique oie au-dessus du cou sur le larynx, soulever et tenir avec les doigts, la langue et remonter l’épiglotte pour visualiser les cordes vocales. La trachée doit être illuminée derrière les cordes vocales ; Ajustez la position de la lumière jusqu'à ce que la trachée est lumineuse.
   3. Intuber les rats en insérant un cathéter 16 G dans le larynx dans les 60 s d’éliminer le rat de la chambre, comme ils se réveiller rapidement. Si le rat se réveille avant intubation réussie, replacez le rat et répéter.
   4. Se brancher instantanément le rat au ventilateur de reprendre livraison isoflurane et oxygène. Confirmer l’intubation en utilisant un miroir froid d’observer la condensation de l’humidité dans l’air expiré du cathéter. Assurez-vous que l’animal est toujours respirer par l’expansion de la poitrine.
4. Connectez le rat au ventilateur. Définie l’oxygène de circuler à 1 L/min. le cas le taux de ventilation à 70 respirations/mn avec un volume de marée de 0,35 à 0,45 mL. La valeur de pression expiratoire positive (PEP) pour 2 à 4 cm H₂O. Reduce isoflurane à 2 – 3 %.
5. Placez le rat sous le microscope dans la position de décubitus droit sur un coussin chauffant à 37 ° C. Les pattes avant du ruban vers le bas. Raser le thorax gauche derrière le pied avant jusqu'à la fin de la cage thoracique avec une tondeuse. Nettoyer la zone chirurgicale avec solution de povidone-iode gaze et 10 %, suivie de l’éthanol à 70 % (trois fois).
6. Placez l’oxymètre à pied de la rat et surveiller la fréquence cardiaque et la saturation en oxygène tout au long de la chirurgie. Fréquence cardiaque devrait se situer entre 200 et 500 bpm et oxygène la saturation doit être > 95 %.

3. préparation du milieu stérile

1. Visualiser la zone chirurgicale sous le microscope. Cela doit être fait tout d’abord parce que le microscope ne peut être modifié une fois que l’environnement est stérile.
2. Enfilez des gants chirurgicaux stériles. Ne pas toucher quoi que ce soit en dehors de la zone chirurgicale du corps du rat, les draps chirurgicaux et les instruments stérilisés.
3. Placez un drap stérile sur le corps du rat et sur le plateau à instruments pour créer un environnement stérile.
4. Avec des gants stériles, placer les instruments stériles sur le plateau à instruments stériles.

4. gauche pneumonectomie chirurgicale

1. Utiliser les ciseaux Cooley-Mayo et forceps tissue Gerald pour découper un petit trou dans le champ chirurgical. Le trou doit être d’environ 2 à 3 cm de diamètre pour visualiser pleinement l’incision, mais pas trop grosses pour que stérilisé uniquement la peau sont exposée.
2. Faire une incision latérales longues de 2 cm dans le thorax gauche à l’aide d’une lame chirurgicale. Utilisation de gaze et la plume de bistouri électrique pour gérer les saignement/maintiennent hémostase. Utiliser les ciseaux Cooley-Mayo pour couper chaque couche du tissu jusqu'à ce que les côtes et les muscles intercostaux sont exposés.
3. Entrer dans l’espace Intercostal
   1. Le moustique permet de faire un trou à travers le muscle du troisième espace intercostal.
   2. La sonde double culot permet de déplacer le poumon de la manière de visualiser l’artère pulmonaire. L’enquêteur peut pénétrer dans un autre espace intercostal si l’artère pulmonaire n’est pas accessible.
   3. Utilisation iris ciseaux et ciseaux d’iris de Vannas McPherson (dos ciseaux) pour ouvrir les muscles intercostaux à environ 1 à 2 cm. utilise le crayon de bistouri électrique pour arrêter tout saignement.
   4. Placer une petite auto maintien rétracteur de tenir les côtes et les muscles ouvrir.
4. Ouvrez seulement la plèvre gauche et descendre plus bas dans l’abdomen pour permettre l’accès à l’artère pulmonaire et des bronches, le poumon gauche. Charger un hemoclip moyen dans l’applicateur pince ligature.
5. Ligature de la bronche gauche et l’artère pulmonaire principale gauche
   1. Soulever la partie supérieure du poumon gauche soigneusement avec la pince atraumatique de Wangensteen d’exposer l’artère pulmonaire.
   2. Clip de l’artère pulmonaire en fermant le clip et l’applicateur autour de l’artère. Veillez à ne pas fermer ou rupture de la veine azygos gauche. Ne pas serrer trop fortement dans le cas contraire, le navire peut se rompre.
   3. Ouvrez l’incision en utilisant l’amygdale pour séparer les fibres musculaires.
   4. Charger un autre moyen hemoclip dans l’applicateur pince ligature afin qu’il soit prêt.
   5. Utiliser la pince atraumatique pour soulever la partie inférieure du poumon hors de l’incision jusqu'à ce que la bronche gauche et la veine pulmonaire gauche sont visualisées. Pince atraumatique doit être utilisé pull pour déplacer le poumon et hors de l’incision. Le poumon étant trop volumineux pour être sorti en un seul mouvement sans se déchirer le tissu, la pince de la question est nécessaire pour maintenir le poumon en place tandis que la pince atraumatique servent soigneusement pour retirer plus de poumon.
   6. Ligaturer ensemble la bronche gauche et gauche veine pulmonaire principale en fermant l’applicateur autour d’eux. Ne pas serrer la veine et bronches trop vigoureusement sinon, le navire peut se rompre.
6. Retirer le poumon avec des ciseaux. Veillez à ne pas couper ou déchirer le clip. Utiliser un petit morceau de gaze stérile pour absorber le sang et assurez-vous qu’il n’y a pas de saignement.
7. Fermeture des côtes et des Muscles intercostaux
   1. Avant de fermer les muscles intercostaux, insérer un cathéter 16 G dans la cavité thoracique de l’incision chirurgicale et dans le septième espace intercostal. Veillez à ce que le chercheur peut visualiser l’aiguille pour ne pas percer des organes vitaux ou les vaisseaux.
   2. Retirer immédiatement l’aiguille, en laissant le cathéter en place. Cela servira un drain thoracique.
   3. Fermer les côtes et les muscles intercostaux avec une suture de Prolène 4-0.
   4. Proche de la peau et l’espace sous-cutané avec une suture de 5-0 en cours d’exécution (Table des matières).
   5. Placer une suture de 5-0 (Table des matières) dans la peau et autour de sa poitrine le tube donc quand le drain thoracique est enlevé, le trou sera lié fermée.
8. Évacuer l’air de la cavité pleurale avec une seringue de 3 mL par le cathéter de retrouver la dépression normale dans le thorax. Clamper immédiatement le cathéter avec un porte-aiguille pour empêcher l’air de refluer dans la cavité thoracique. Retirer le cathéter et attacher la suture pour fermer le trou rapidement.

5. post-opératoire récupération

1. Mettre l’animal en position sternale. Désactiver l’isoflurane, mais continuer à donner de l’oxygène de rat par le tube endotrachéal. N’abandonnez pas l’animal à tout moment jusqu'à ce qu’il a repris connaissance suffisante pour se déplacer et l’animal est en sécurité dans sa cage.
2. Administrer par voie sous-cutanée à 2 – 3 mL de solution de Ringer amorcez stérile.
3. Surveiller la fréquence cardiaque (≈200 – 500 bpm), de la saturation en oxygène (≥ 95 %), et couleur animale pour confirmer l’animal respire bien.
4. Quand l’animal commence à faire des mouvements de respiration spontanée et les mouvements du cou et répond à des stimuli physiques (par exemple les yeux élargissement, nez se déplaçant et oreilles répondant aux sons), sortir l’animal en tirant sur le cathéter et débrancher le respirateur.
5. Retourner l’animal à une cage vide, loin de la compagnie des autres animaux. L’animal doit être seul pendant au moins 3 jours.
6. Pour le contrôle de la douleur, administrer 0,1 mg/kg de buprénorphine par voie sous-cutanée toutes les 12 h pendant 3 jours.

6. l’administration de « Second coup » MCT ou Sugen

1. Administrer 1 mL de MCT (60 mg/kg) ou 1 mL de Sugen (25 mg/kg) par injection sous-cutanée, 1 semaine après la chirurgie.

7. terminal récolte

1. Sept semaines après l’administration de MCT ou Sugen, placer l’animal dans une chambre avec fluide oxygène (1 L/min) et 4 % isoflurane.
2. Connectez l’animal au ventilateur par l’intermédiaire de coiffe. Garder l’oxygène circulant et abaissez l’isoflurane à 2,5 à 3 %. Placez l’animal sur son dos et de la bande vers le bas de tous les membres.
3. Se raser l’animal le long de l’abdomen entier.
4. Ouverture de la poitrine
   1. Faire une incision vers le bas de la poitrine avec un scalpel du cran sous-clavière pour le xyphoid.
   2. Utiliser la pince de tissu pour tenir le xyphoid. Couper à travers le sternum avec les ciseaux Cooley-Mayo jusqu'à ce que le cœur et l’artère pulmonaire sont entièrement accessibles. Utiliser le bistouri électrique pour arrêter le saignement. Tenir que les côtes ouverts avec un rétracteur.
5. Identifier l’artère pulmonaire. Ajustez l’orientation du cœur, si nécessaire, en ajoutant la gaze dessous. Utiliser un cathéter IV de 20 G à la perforation de l’artère pulmonaire entre la valve pulmonaire et la bifurcation de l’artère pulmonaire principale. Avancer seulement le cathéter de 20 G dans l’artère et retirer l’aiguille. Avancez la sonde de pression transsonique Fr 1.2 dans le cathéter IV qui est dans l’artère pulmonaire. Une fois la courbe PA stable, enregistrer la pression au moins 10 s. Répétez ces étapes pour enregistrer la pression dans le ventricule droit.
6. Retirer le cœur et les poumons. Placer les morceaux du poumon dans du formol à être fixé à la paraffine et coloration à l’hématoxyline et éosine.

Résultats

Selon le système de classification reconnus, une hypertension artérielle pulmonaire se caractérise par une pression de l’artère pulmonaire moyenne (Papm) dépassant les limites maximales de pression de l’artère pulmonaire normale (c'est-à-dire, 25 mm Hg). Dans la pneumonectomie + groupe MCT, Hap sévère développé par 21 jours avec une augmentation Papm (Figure 1). La Papm est calculée par la formule :

Discussion

Dans les poumons touchés par la PAH, prolifération vasculaire avec formation néointimale et l’oblitération des artères pulmonaires se traduire par modifications hémodynamiques graves, l’insuffisance ventriculaire droite et précoce mortalité^7,8. Les modifications apportées aux parois des vaisseaux augmentent la résistance à la circulation sanguine, augmentant la pression artérielle et ventriculaire droite. Dans les premiers stades de la PAH, généralement 3 semaine...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Lame chirurgicale	Bard-Parker	371215	Incision
Forane (Isoflurane, USP)	Baxter	NDC 10019-360-40	anesthésie
BD Angiocath 16 G	BD	381157	tube d’intubation, drain thoracique
BD 1 mL Seringue à insuline	BD	329652	administrer buprinex en postopératoire
Biogel Chirurgiens Gants chirurgicaux	Biogel	30460-01	gants chirurgicaux stériles
Wahl BravMini+ Trimmer	Braintree Scientific	CLP-41590 P	site chirurgical de rasage
SU5416	Cayman Chemical	13342	Sugen  ;
Illuminateur à fibre optique	Cole-Parmer	EW-41723-02	lumière pour intubation
Surgipro II 4-0 Suture	Covidien	VP831X	Fermeture des muscles intercostaux
Polysorb 5-0 Suture	Covidien	GL-885	Fermeture de la peau
Medium Slide Top Chambre d’induction	DRE Veterinary	12570	livraison d’oxygène et d’isoflurane
DRE Compact 150 Rongeur Appareil d’anesthésie	DRE Veterinary	373	administration d’oxygène et d’isoflurane
Kit de cautériseur pour petits vaisseaux	Outils scientifiques fins	18000-00	cautérisateur pour minimiser les saignements
VentElite Ventilateur pour petits animaux	Harvard Apparatus	55-7040
VentilateurSTAT Jr	Kent Scientific	MSTAT-JR	oxymètre de pouls et moniteur de fréquence cardiaque
Capteur d’oxymètre de pouls Mouse Paw	Kent Scientific	Oxymètre de pouls SPO2-MSE	et capteur de fréquence cardiaque
PhysioSuite RightTemp	Kent Scientific	PS-02	Temperature
pad PVP Prep Solution	Medline	MDS093944	Nettoyage du site chirurgical
Drapé en poly Drapé	Medline	NON21002Z	couvrir l’animal
Seringue de 3 mL	Medline	SYR103010	administrer des fluides postopératoires
Kits microchirurgicaux, Integra  ;	Miltex	95042-540	outils chirurgicaux : spéculum à fil lisse, sonde à double extrémité, McPherson-Vannas Ciseaux à iris droits, ciseaux à iris droits
Pince hémostatique - Micro-Jacobson-Mosquito	Miltex	17-2602
Buprénorphrine HCl 0,3 mg/mL	Par Pharmaceutical	NDC 42023-179-01	Soulagement de la douleur
Ciseaux courbes Cooley-Mayo	Bouling	352090	Grands ciseaux
Gerald Pince à tissus	Bouloching	351900	Pince
à tissus Wangesnsteen	Pince à moulage Boulochage	342929	pince atraumatique
Bouloching Porte-aiguille vasculaire mince	Bouloching	354962DG	porte-aiguille
Crotaline	Sigma-Aldrich	C2401-1G	MCT
Surflash 20 G IV Cathéter	Terumo	SR*FF2051	Pour la lecture de la pression pendant le prélèvement d’organes
Système PV ADVantage avec cathéter 1,2 Fr	Transonic Inc	ADV500	Enregistrer la pression de l’artère pulmonaire et du ventricule droit
Moyenne Hemoclip	Weck	523700	Vaisseaux ligaturés
Open Ligating Clip Applicator ; Moyenne incurvée	Weck Horizon	237081	applicateur d’hémoclip
Microscope chirurgical	Zeiss OPMI MD	1808	grossissement