Article de méthode

Amélioration d’Extrusion de haute viscosité de microcristaux de Time-resolved série femtoseconde cristallographie à rayons x Lasers

DOI :

10.3791/59087

⸱

28 février 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Biology and Chemistry - Laboratory for Biomolecular Research, Paul Scherrer Institut, 2Photon Science Division - SwissFEL, Paul Scherrer Institut, 3RIKEN SPring-8 Center, 4Department of Cell Biology, Graduate School of Medicine, Kyoto University, 5Department of Biology, ETH Zürich

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le succès d’une expérience de cristallographie femtoseconde série temporelle est tributaire de la livraison d’échantillon efficace. Nous décrivons ici les protocoles afin d’optimiser l’extrusion de microcristaux de bactériorhodopsine par un injecteur de micro-extrusion de haute viscosité. La méthodologie s’appuie sur l’homogénéisation des échantillons avec un coupleur de trois voies nouvel et de visualisation avec une caméra à haute vitesse.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Haute viscosité micro-extrusion injecteurs ont considérablement réduit la consommation d’échantillon de série femtoseconde cristallographique expériences (SFX) à rayons x lasers à électrons libres (XFELs). Une série d’expériences à l’aide de la bactériorhodopsine de pompe de proton axée sur la lumière ont créé davantage ces injecteurs comme une option privilégiée pour fournir des cristaux pour femtoseconde série temporelle de cristallographie (TR-SFX) résoudre les changements structurels de protéines après photoactivation. Pour obtenir plusieurs instantanés structurels de haute qualité, il est essentiel de recueillir de grandes quantités de données et d’assurer le dégagement de cristaux entre chaque impulsion de laser de pompe. Ici, nous décrivons en détail comment nous avons optimisé l’extrusion de microcristaux de bactériorhodopsine pour nos récentes expériences de TR-SFX à la Source de lumière cohérente Linac (L.I.C.). L’objectif de la méthode consiste à optimiser l’extrusion pour un débit stable et continue tout en conservant une forte densité de cristaux pour augmenter le taux à laquelle les données peuvent être collectées dans un TR-SFX expérimenter. Nous atteindre cet objectif en préparation lipidique phase cubique avec une répartition homogène des cristaux avec une seringue trois voies roman périphérique suivie d’ajuster la composition de l’échantillon basée sur la mesure de la stabilité de l’extrusion prise avec une haute vitesse de couplage configuration de la caméra. La méthode peut être adaptée pour optimiser le flux des autres microcristaux. Le programme d’installation sera disponible pour les utilisateurs de la nouvelle installation Suisse Laser à électrons libres.

Introduction

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Femtoseconde série cristallographie (SFX) est une technique de biologie structurale qui exploite les propriétés uniques des rayons x lasers à électrons libres (XFEL) afin de déterminer les structures de la température ambiante des milliers de cristaux de taille micrométrique tout en semant la plupart des les dommages de rayonnement par la « diffraction avant destruction » principe1,2,3.

Dans une extension temporelle de SFX (TR-SFX), les impulsions femtoseconde de XFEL sont utilisées pour étudier les changements structurels en protéines4,5. La protéine d’intérêt est activée avec un laser optique (ou une autre activité trigger) juste avant d’être abattu par XFEL dans une installation de pompe-sonde. Par précisément contrôler le délai entre les impulsions de la pompe et la sonde, la protéine cible peut être capturée dans des États différents. Films moléculaires des changements structuraux onze ordres de grandeur dans le temps de démontrer la puissance des nouvelles sources XFEL pour étudier la dynamique de plusieurs protéines cibles6,7,8,9, 10,11,12,13. Principalement, la méthode rejoint les techniques structurelles dynamiques spectroscopiques et statiques en un seul, fournissant un aperçu dans la dynamique des protéines à près de résolution atomique.

Des systèmes simples pour TR-SFX peuvent contenir un déclencheur endogène d’activation avec un composant photosensibles comme rétinienne à la bactériorhodopsine (bR)9,10, les chromophores photosystème II12,13, protéine jaune photoactif (PP)6,7 réversible ayant protéine fluorescente11, ou un photolyzable le monoxyde de carbone dans la myoglobine8. Excitant les variations de la technique encore en développement dépendent du mix et injectent des schémas14,15 , afin d’étudier les réactions enzymatiques ou un champ électrique utilisé pour induire des changements structurels16. Étant donné que les sources XFEL seulement existent depuis quelques années et en extrapolant au-delà de succès dans l’avenir, la méthode montre potentielle comme un vrai jeu-changeur en ce qui concerne notre compréhension de la façon dont la fonction de protéines.

Parce que les échantillons biologiques sont détruites par une seule exposition à une forte puissance impulsion XFEL, nouvelles approches pour la cristallographie des protéines ont été nécessaires. Parmi ces procédures, la capacité de croître de grandes quantités de microcristaux uniforme devait être développés17,18,19. Pour activer la collecte de données à un XFEL, ces cristaux doit être livrés, mis au rebut et ensuite renouvelé à chaque impulsion XFEL. Étant donné que XFELs feu utilisables impulsions à 10 à 120 Hz, livraison d’échantillon doit être rapide, stable et fiable, tout en également maintenant les cristaux intacte et limitante la consommation. Parmi les solutions les plus réussies est un injecteur de micro-extrusion de haute viscosité, qui délivre un très streaming radiographie faisceau pulsé20colonne de température ambiante chargés de cristal lipidique phase cubique (LCP). Les cristaux orientés au hasard, intégré dans le flux de la LCP, qui sont interceptés par l’éparpillement d’impulsions XFEL radiographies sur un détecteur où un patron de diffraction est enregistré. LCP est un choix naturel pour une moyenne de livraison échantillon tel qu’il est fréquemment utilisé comme un milieu de croissance pour membrane protein cristaux17,21,22,23, encore d’autres support de haute viscosité 24,25,26,27,28,29,30 et31 de la protéines solubles ont également été utilisés dans l’injecteur. SFX avec l’injecteur haute viscosité a réussi au cours de la détermination de la structure de la membrane protéines13,32 dont G (RCPG) des récepteurs couplés aux protéines33,34, 36, 35,37, avec la qualité des données suffisante pour native "phasage"38,39 tout en étant à temps et l’échantillon efficace. Actuellement, ces injecteurs sont plus couramment utilisés pour les mesures de la température ambiante à rayonnement synchrotron sources28,30,40,41 ainsi que pendant plus techniquement exigeant des expériences de TR-SFX à XFELs9,10,13,,42.

Des expériences de TR-SFX comparables ont été réalisées en utilisant d’autres types d’injecteur comme phase liquide livraison dans un flux axé buse6,7,12, cependant, cette méthode nécessite des quantités de protéines n’est pas disponibles pour un grand nombre cibles intéressantes sur le plan biologique. Pour la détermination des structures statiques à l’aide de l’extrusion visqueuse une consommation moyenne de 0,072 mg de protéines par diffraction de 10 000 indexé par rapport à 9,35 mg pour le jet de liquid les buses ont été signalés (c'est-à-dire, environ 130 fois plus d’échantillon efficace)20. L’injecteur haute viscosité s’est avéré être un dispositif d’administration échantillon viable pour TR-SFX tout en seulement sacrifiant certains de cet échantillon efficacité43. Dans Nogly et coll. (2018)10, par exemple, consommation d’échantillon était environ 1,5 mg par 10 000 modèles indexées, qui se compare favorablement à des expériences similaires de TR-SFX en utilisant le PP où la consommation moyenne d’échantillon était beaucoup plus élevée avec 74 mg de protéine pour 10 000 habitants 6de patrons indexée. Injecteurs de haute viscosité ont donc des avantages manifestes lorsque la quantité de protéines disponibles est limité, ou lorsque les cristaux est cultivées directement en LCP.

Pour TR-SFX en utilisant haute viscosité injecteurs de céder les données plus fiables plusieurs questions techniques doivent être abordés : la vitesse d’écoulement doit rester supérieur à une valeur critique minimale ; le taux de succès doit être maintenu à un niveau qui ne rend pas la collecte de données lente (par exemple, supérieure à 5 %) ; et l’échantillon doit être livré sans perturbations excessives. Idéalement, ces conditions sont déjà remplies bien avant une expérience TR-SFX régulier d’utiliser le temps disponible de XFEL aussi efficacement que possible. Exploitation, un ralentissement du flux de LCP peut permettre de sonder les cristaux qui ont été activés avec plus d’une impulsion laser optique et provoquer des États actifs mixtes, ou matériau pompé de palpage lorsqu’umpumped matériel est attendu dans le faisceau. Un autre avantage d’injection pré-test est que les temps d’arrêt au cours de la collecte de données à un XFEL est minimisée comme temps relégué au remplacement des injecteurs bouchés, changeant des échantillons non-extrusion, et autres tâches de maintenance est réduite.

Nous présentons ici une méthode pour optimiser la livraison d’échantillon pour la collecte de données TR-SFX avec un injecteur de micro-extrusion de haute viscosité. Pour plus de simplicité, les méthodes décrites ne comptent pas sur l’accès à une source de rayons x, même si le travail à une source de rayonnement de synchrotron29 pourrait fournir des informations complémentaires sur le taux de succès escomptés et diffraction de cristal. Nos protocoles ont été développés pour optimiser les expériences pour capturer une isomérisation rétinienne dans la pompe à protons bactériorhodopsine10 et sont réalisés en deux phases, commençant par la préparation des échantillons de cristaux pour l’extrusion suivie par l’extrusion de surveillance en utilisant une configuration de caméra à grande vitesse. Dans la première phase, le LCP chargés de cristal est mélangé avec LCP supplémentaire, lipides de transition basse température ou d’autres additifs pour assurer que le mélange final est adapté pour la livraison dans l’environnement de l’échantillon sans colmatage ou ralentissement. Un nouveau coupleur seringue trois voies a été développé pour améliorer l’homogénéité mélange de performance et d’échantillon. La deuxième phase se compose d’un test d’extrusion enregistré par une caméra rapide de mesurer directement la stabilité de vitesse d’extrusion. Suite à l’analyse des données vidéo, effectuer le réglage du protocole de préparation d’échantillon pour améliorer les résultats expérimentaux. Ces procédures peuvent être adaptés pour préparer d’autres protéines pour la collecte de données TR-SFX, avec des modifications minimes et contribueront à une utilisation efficace des beamtime XFEL limitée. Avec de nouvelles installations XFEL juste de commencer leur opération44,45 et le transfert des méthodes de collecte de données série axée sur l’injecteur à synchrotrons28,30,40,41 , les années à venir sûrement continuera à fournir passionnantes nouvelles connaissances sur la dynamique structurale d’une gamme toujours plus grande des protéines cibles.

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Protocole

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1. préparation des échantillons de Crystal protein

  1. Environ 30 min avant que l’échantillon doit être injecté, charge 50 µL de cristal-laden monooléine base LCP dans une seringue en 100 µL.
  2. Pour injection à la pression atmosphérique : charge 10 µL de paraffine liquide à l’arrière d’une deuxième seringue. En tenant la seringue verticalement, expulser les bulles d’air de la seringue.
    1. Pour l’injection dans l’environnement sous vide : charge 5 µL de MAG 7,9 et 5 µL de paraffine liquide à l’arrière d’une deuxième seringue. En tenant la seringue verticalement, expulser les bulles d’air de la seringue.
  3. Connecter la seringue avec paraffine/MAG 7,9 à un coupleur seringue standard, purger l’air du coupleur en appuyant doucement sur le piston jusqu'à ce qu’un petit volume (< 1 µL) de paraffine/lipide est visible à l’extrémité de l’aiguille du coupleur.
  4. Connecter la seringue de l’échantillon pour le coupleur de la seringue, en prenant soin de ne pas introduire d’air dans l’échantillon. Mélanger dans la lipide/paraffine en passant de l’échantillon à travers le coupler plusieurs fois.
  5. Dans une autre seringue de 100 µL de charger 20 µL de LCP prémélangée (27 % PEG, 100 mM pH Sorensen 5.6 + MO). Enlever les bulles d’air si nécessaire.
  6. Retirez la seringue vide le coupleur et fixez le LCP prémélangée à la seringue à l’aide d’un coupleur de seringue standard cristallifères. Passer l’échantillon à travers le coupleur 100 fois.
    Remarque : Exemple de mélange peut chauffer l’échantillon légèrement46. Mélange doit être fait à un rythme lent où la température de l’échantillon peut être tenue relativement constante.
  7. Inspecter l’échantillon pour la transparence contre une source de lumière. Si un LCP transparent homogène est formée, passez à l’étape 1.9.
  8. Amener l’échantillon dans la phase cubique, ajouter 3 µL de monooléine et mélanger 50 fois (comme décrit ci-dessus). Répétez cette procédure jusqu'à ce qu’une phase transparente a formé pour éviter un excès de monooléine.
    Remarque : La formation de la LCP est dépendante de la température47 et obtenir les meilleurs résultats sont atteints légèrement au-dessus de 20 ° C. Le montant des monooléine supplémentaire nécessaires dépendra du volume de solution precipitant résiduelle reporté de cristallisation.
  9. Au préalable tester la rigidité de l’échantillon (comme prévu dès la phase LCP) et extrudez-capacité, détacher la seringue vide de l’attelage de la seringue et, tenant la seringue verticalement, déposez une petite quantité d’échantillon (< 2 µL) par l’intermédiaire de l’attelage. Si l’échantillon extrudé forme un cylindre vertical, puis l’échantillon est prêt pour les essais d’extrusion.
  10. Ajustez le volume total de l’échantillon à 100 µL en ajoutant plus prémélangée LCP (comme à l’étape 1.5).
  11. Fixer la seringue de l’échantillon et deux seringues vides au coupleur seringue trois voies (purger l’air de l’attelage comme avant). Mélanger au moins 50 fois (ou jusqu'à homogénéité) en passant la moitié de l’échantillon dans la deuxième seringue puis en pressant les deux moitiés de l’échantillon dans la seringue troisième simultanément.
  12. Placer la seringue contenant l’échantillon mélangé au microscope stéréo pour vérifier une répartition homogène des cristaux.

2. essai d’Extrusion d’échantillon en utilisant une configuration de caméra haute vitesse

  1. Détermination des paramètres expérimentaux.
    1. Sélectionnez la taille de la buse pour le test.
      Remarque : Les tailles de buse sont généralement 50 ou 75 µm diamètre interne (ID), mais n’importe quelle taille d’environ 30 à 100 µm ID peut être considéré comme. Sélection est basée sur un équilibre entre le temps moyen de colmatage, diffusion de fond, échantillon consommation et taux de succès.
    2. Calculer la vitesse d’écoulement optimale basée sur la taille du spot laser expérimental (diamètre de2 1/e) et le schéma de collecte de données (p. ex., entrelacée de lumière et sombre) qui servira à XFEL.
    3. Calculer le débit souhaité (figure-protocol-1) de l’échantillon de la vitesse d’écoulement optimale (figure-protocol-2) et le diamètre du gicleur choisi (figure-protocol-3) :
      figure-protocol-4
      Déterminer le débit (figure-protocol-5) qui doit être entré à la pompe HPLC basée sur le coefficient d’amplification (figure-protocol-6) de l’injecteur.
      figure-protocol-7
      Calculer la pression maximale (figure-protocol-8) de la pression nominale de l’aménagement de la buse (figure-protocol-9) et le coefficient d’amplification de l’injecteur (figure-protocol-10) :
      figure-protocol-11
  2. Programme d’installation de l’injecteur d’extrusion de haute viscosité pour utilisation hors connexion, comme illustré à la Figure 1.
    Remarque : Les fonctions de l’injecteur par extrusion hydraulique alimenté par une pompe HPLC et utilise une gaine de gaz hélium fluide conjointement contrôlée par un régulateur de gaz. L’installation de la pompe et le régulateur ne sont pas abordées dans le présent protocole. Consultez le chapitre quatre de James (2015)48 pour un manuel détaillé.
    1. Purger la pompe et toutes les canalisations d’eau afin d’assurer les débits sont exactes. Purger la scène hydraulique de l’injecteur.
    2. Monter l’injecteur (ou l’appareil photo) sur une scène en trois axes pour faciliter le cadrage et mise au point pour les vidéos à grande vitesse. Laisser un espace autour du point d’injection pour l’objectif, l’illumination, écran réfléchissant et un petit bécher pour attraper l’échantillon irradié.
    3. Construire une buse « factice » (un réservoir vide avec une buse attaché) et installez-le sur l’injecteur pour faciliter le positionnement, le focus et illumination.
    4. Monter la caméra à grande vitesse avec la buse près du point focal de l’objectif.
    5. Positionnez l’écran réfléchissant derrière l’injecteur et régler l’éclairage pour la lumière avant la buse.
    6. Allumez et vous connecter à l’appareil photo avec le logiciel fourni. Avec une vidéo en direct en cours d’exécution pour la rétroaction visuelle, placer l’extrémité de la buse dans le centre de l’image et l’emmener en mise au point avec la scène de trois axes.
    7. Régler l’éclairage jusqu'à ce que la buse soit bien visible et de l’arrière-plan est éclairé uniformément.
  3. Configuration de la caméra d’enregistrer des vidéos time-lapse à grande vitesse.
    1. Set de framerate à 1000FPS. La valeur de résolution 512 x 512 pixels.
    2. Avec le temps de pose maintenant fixé par la cadence, ajustez le niveau d’éclairement jusqu'à ce que la buse est visible (c'est-à-dire, non sous- ou surexposées). Repositionner la buse afin qu’il soit centré de gauche à droite et se trouve dans le tiers supérieur du cadre.
    3. Exécuter des opérations de balance des blancs ou de correction de fond.
    4. Mettre en place la caméra en mode Time-lapse. Un intervalle défini à 30 s et se répète à 40 fois, définir le mode de déclenchement aléatoire (ou reset aléatoire) et entrez le nombre d’images à enregistrer à 1000.
  4. Charger le réservoir avec 20 µL de l’échantillon et fixez l’embout capillaire.
  5. Fixer le réservoir rempli à l’injecteur. Fixez le tuyau de gaz dans le port de la buse et démarrer le flux de gaz.
  6. Manuellement, faire avancer le piston en ouvrant la vanne en ligne en appuyant sur la seringue. Fermer le robinet quand le piston fait un contact solid avec l’échantillon dans le réservoir.
  7. Programmer la pompe avec le débit calculé et sélectionner la pression maximale à la valeur calculée (voir étape 2.1.3).
  8. En même temps, démarrer la pompe et l’enregistrement de la caméra.
  9. Comme l’extrusion commence, régler la pression du gaz pour accroître la stabilité. Augmenter la pression du gaz si le liquide forme une goutte à l’extrémité de la buse au lieu d’une colonne. Réduire la pression si l’extrusion est cassée en raison du cisaillement excessif de l’écoulement de gaz, ou oscille rapidement (fouet).
  10. Surveiller l’extrusion (10 min est habituellement assez pour reconnaître une condition d’écoulement homogène) et, lorsque la pression de la pompe rampes brusquement vers le haut près de l’heure de fin prévue, arrêter l’enregistrement, arrêter la pompe et évacuer la pression du système en ouvrant la vanne de décharge.
  11. Analyse des fichiers vidéo
    Remarque : Extrusion d’échantillon qui est clairement insuffisante ne requiert pas une analyse détaillée. Toutefois, il est toujours utile d’identifier le mode de défaillance afin que l’échantillon peut être optimisé.
    1. Ouvrez le fichier vidéo avec le logiciel d’analyse (p. ex., Fidji49) et étalonner les instruments de mesure.
    2. Étalonner les mesures en sélectionnant une ligne de longueur connue dans l’image vidéo avec l’outil de sélection de ligne. Ouvrez la fenêtre de l’Échelle définie via Analyze | Définissez l’échelle et entrez la distance connue et les unités de mesure.
      Remarque : Le diamètre connu de la buse offre une longueur de calibrage adéquat pour ces mesures.
    3. Trouver un cadre dans la vidéo où il y a une fonctionnalité traçable visible (par exemple, un cristal) dans l’extrusion. Notez le numéro de châssis.
    4. Avancez la vidéo à un cadre où la même fonctionnalité est visible, mais a déplacé de sa position dans l’étape précédente. Notez le numéro de châssis.
    5. À l’aide de l’outil de mesure de ligne droite, mesurez la distance entre le début caractéristique et le point de terminaison via Analyze | Mesure.
      Remarque : Plus la distance traçable, les moins d’erreurs de mesure affectera les calculs
    6. Calculer la vitesse de réaction de la distance et le temps écoulé (le nombre de frames écoulés divisé par framerate).
    7. Répétez les étapes 2.11.3-2.11.6 plusieurs fois pour chaque segment de la vidéo.
    8. Tracer des séries de données comme dans la Figure 2.

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Résultats

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Le produit de départ idéal pour les procédures décrites ici (Figure 3) sont des densités élevées de microcristaux incorporé dans le milieu visqueux porteur pour l’injecteur. La procédure nécessite environ 50 µL du transporteur en charge de cristal pour chaque préparation. Ceux-ci peuvent être cultivés directement en LCP comme avec le bR9,10 utilisé ici, à titre d’exemple (Figure 4...

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Discussion

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La méthode TR-SFX avec l’injecteur d’extrusion visqueuse s’est avéré pour être une technique viable pour les études de dynamique des structures de bactériorhodopsine9,10 et photosystème II13 et semble désormais prête à étudier des protéines conduisant l’autre certains processus biologiques photo comme transport ionique axée sur la lumière ou de la perception sensorielle5,50. Les pr...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs ne déclarent aucuns en conflit d’intérêts.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous reconnaissons Gebhard Schertler, Rafael Abela et Chris Milne pour favoriser l’utilisation des injecteurs haute viscosité à la PSI. Richard Neutze et son équipe sont reconnus pour des discussions sur la résolution temporelle de cristallographie et livraison d’échantillon à l’aide d’injecteurs haute viscosité. Soutien financier, nous reconnaissons la Swiss National Science Foundation pour subventions 31003A_141235, 31003A_159558 (à J.S.) et PZ00P3_174169 (pour avis). Ce projet a été financé par la recherche Horizon 2020 de l’Union européenne et le programme d’innovation en vertu de la subvention de Marie-Curie-Sklodowska accord N° 701646.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Mosquito LCP Seringue CouplingTTP labtech store3072-01050
Hamilton Seringue 1710 RNR, 100 µ ; lHamiltonHA-81065
Hamilton Seringue 1750 RNR, 500 & micro ; lHamiltonHA-81265
MonooléineNu-Chek Prep, Inc.M-239
7.9 MAGAvanti Polar Lipids Inc.850534O
50 % w/v PEG 2000Dimensions moléculairesMD2-250-7
Paraffine (liquide)Sigma-Aldrich1.07162
Caméra haute vitessePhotronPhotron Mini AX
Objectif à fort grossissementNavitar12X Zoom Lens System
Platine à trois axesThorLabsPT3/M
Fibre légèreThorlabsOSL2
Fibre de silice fondueMolex/PolymicroTSP-505375
Virole tactile LiteIDEXLT-100
ASU injecteur à haute viscositéd’État de l’ArizonaAchetable auprès d’Uwe Weierstall (weier@asu.edu)
Pompe HPLCShimadzuLC-20AD
Régulateur de gaz électroniqueProportion AirGP1
Université

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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