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Article de méthode

Effet des anticorps Anti-c-fms sur la Formation des ostéoclastes et la prolifération des précurseurs des ostéoclastes In Vitro

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DOI :

10.3791/59089

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18 mars 2019

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1Division of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics, Department of Translational Medicine, Tohoku University Graduate School of Dentistry

Dans cet article

Résumé

Ce protocole comprend la dissection de murin des os longs et l’isolement de la moelle osseuse, pour générer des macrophages de la moelle osseuse et de produire des ostéoclastes à l’aide de la colonie de macrophages stimulant facteur (M-CSF) et activateur du récepteur du ligand facteur nucléaire Kappa-B (RANKL) ou facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α) et leur arrestation par des anticorps anti-c-fms, récepteurs de M-CSF.

Résumé

Remodelage osseux est un processus complexe et implique des périodes de dépôt et de résorption. La résorption osseuse est un processus par lequel osseuse est décomposé par les ostéoclastes en réponse à différents stimuli. Précurseurs ostéoclastiques se différencient en ostéoclastes multinucléaires en réponse à la colonie de macrophages stimulant facteur (M-CSF) et activateur du récepteur du ligand facteur nucléaire Kappa-B (RANKL). Dans des conditions pathologiques, le profil des cytokines est différent et implique un mélange des cytokines inflammatoires. Facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α) est l’un des cytokines plus importants que l'on retrouve en grande quantité dans les zones concernées avec ostéolyse inflammatoire. Le but du présent protocole est de fournir une méthode par laquelle murin de moelle osseuse est isolé pour générer les ostéoclastes par induction avec M-CSF et RANKL ou TNF-α, qui est inhibée par la suite en augmentant les doses d’anticorps anti-c-fms, le récepteur pour M-CSF. Cette expérience met en évidence la valeur thérapeutique des anticorps anti-c-fms dans les maladies inflammatoires de la résorption osseuse.

Introduction

Les ostéoclastes sont des cellules très spécialisées, et ils se différencient des cellules souches hématopoïétiques par la fusion de plusieurs précurseurs ostéoclastiques. Ils sont essentiels pour le remodelage osseux sain et contribuent à la résorption osseuse pathologique associée à des maladies ostéolytiques inflammatoires comme l’arthrite rhumatoïde et la maladie parodontale1.

Fonction Osteoclastogenesis et ostéoclastes sont médiés par deux facteurs clés ; macrophages stimulant les colonies facteur (M-CSF) et activateur du récepteur du ligand de facteur nucléaire kappa-B (RANKL). M-CSF tant RANKL sont importants pour de différenciation ostéoclastique2. Un autre facteur qui a été montré pour induire la formation des ostéoclastes de macrophages de la moelle osseuse in vitro est le facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α)3,4,5. TNF-α ostéoclastique médiée par la formation s’est avérée être crucial pour l’ostéolyse en maladies osseuses destructrices comme6de la polyarthrite rhumatoïde, la maladie parodontale7et l’ostéoporose postménopausique8.

C-fms est le récepteur membranaire de M-CSF et intervient dans son action. Le rôle de c-fms est bien documenté dans la littérature comme il a été démontré que l’administration d’un anticorps dirigé contre c-fms (anticorps anti-c-fms) complètement arrêtées osteoclastogenesis dans un modèle de l’arthrite ainsi que de TNF-α induite par les érosions osseuses tout en osteoclastogenesis lointain de l’articulation enflammée a été encore robuste9. L’administration d’anticorps anti-c-fms inhibe la résorption osseuse et de la formation d’ostéoclastes induite par le lipopolysaccharide (LPS) en souris cranienne10 aussi bien que dans la parodontite induite par LPS modèle11. En outre, les anticorps anti-c-fms inhibent résorption mécanique racine induite par le stress pendant la dent orthodontie mouvement12, ainsi que mouvement dentaire orthodontique et la résorption osseuse associée à dents orthodontique mouvement13.

M-CSF a été rapporté ont d’autres fonctions qui sont essentielles à la réponse immunitaire hôte. L’absence de M-CSF chez les souris op/op avec pneumonie bactérienne conduisent à l’augmentation de la charge bactérienne et de la diffusion bactérienne au foie avec nécrose hépatique14. Par conséquent, M-CSF est important pour une réponse immunologique dans la protection contre l’infection.

Cette étude démontre l’effet des anticorps anti-c-fms sur M-CSF et RANKL ou TNF-α a induit la formation d’ostéoclastes in vitro et M-CSF induit la prolifération des précurseurs ostéoclastiques. Ce protocole montre l’isolement des cellules de la moelle épinière murin des os longs et les étapes pour générer des macrophages de la moelle osseuse (BMM) qui sont considérés comme des précurseurs ostéoclastiques et d’induire la différenciation de BMM en ostéoclastes multinucléaires par deux méthodes ; RANKL ou TNF-α. Le protocole compare également l’arrestation d’osteoclastogenesis dans les deux méthodes à l’aide d’anticorps anti-c-fms.

Le processus par lequel la moelle osseuse est extrait et utilisée ultérieurement pour générer des précurseurs ostéoclastiques est fiable en produisant de grandes quantités de cultures d’ostéoclastes pure qui peuvent être utilisés dans de multiples applications en aval telles que le dépistage des drogues. L’utilisation de RANKL ou TNF-α pour induire l’osteoclastogenesis dans le présent protocole distingue osteoclastogenesis comme un processus physiologique (RANKL) d’osteoclastogenesis comme un processus pathologique (TNF-α), qui à son tour fournit deux procédures alternatives pour guider la décision, dont l’un est supérieur en ce qui concerne les réactifs à utiliser dans les applications en aval. Ce protocole prévoit également une méthode par laquelle nous pouvons déterminer une concentration appropriée d’anticorps anti-c-fms qui peut être utilisé sans danger pour des études ultérieures impliqués dans la résorption osseuse et maladies ostéolytiques.

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Protocole

Toutes les procédures animaux et soins des animaux ont été réalisés selon les règlements et règles de l’Université de Tohoku.

1. manutention et Dissection postérieur murin

  1. Avant la dissection, remplir une plaque avec environ 50 mL de α-MEM selon la taille du contenant et placez-le sur la glace. Cela servira comme un conteneur de collection jusqu'à la fin de la dissection de tous les os. Pour cela et les expériences, utilisez α-MEM contenant 10 % bovine sérum fœtal (SVF) 100 UI/mL de pénicilline G et 100 μg/mL de streptomycine.
  2. Euthanasier la souris C57Bl/6J par inhalation d’une dose létale d’isoflurane 5 %.
  3. Fixez la souris dans une position couchée à l’aide de goupilles percés à travers les paumes et les pieds et les vaporiser avec de l’éthanol à 70 %.
  4. Faire une incision de la peau à l’aide de pinces et ciseaux chirurgicaux stériles au niveau de la hanche et étendez-le descendant jusqu’aux pieds, exposant ainsi les muscles.
  5. Couper le tendon y attacher le muscle quadriceps et le tendon d’y attacher le muscle ischio-jambiers à l’os. Décollez les muscles exposant les articulations des hanches et des genoux. Localiser ces tendons facilitera la libérant les deux muscles de leurs pièces jointes sans laisser les balises des tissus mous. Ne pas couper dans l’os.
  6. Positionner les ciseaux entre la tête du fémur et de l’espace commun et couper en libérant du fémur mais conservant l’os. Cela permettra de détachement des os sans le risque d’exposer la moelle osseuse.
  7. De même couper les muscles attachant sur le tibia. Couper le tibia exempt de son attachement à l’articulation de la cheville en conservant l’OS pour éviter la contamination.
  8. Grattez tout autres tissus mous du fémur et du tibia en utilisant les lames des ciseaux et kimwipe et placez-le dans une assiette avec α-MEM mis dans la glace.

2. isolement de la moelle osseuse du membre postérieur murin

  1. Remplissez une seringue à aiguille 30 G de α-MEM.
  2. Déconnectez le tibia et le fémur de l’articulation du genou.
  3. Couper les extrémités de l’OS long des deux côtés à l’aide de ciseaux.
  4. Tenez l’os de l’arbre à l’aide de pinces à épiler, introduire l’aiguille dans l’espace de la moelle de l’os et rincer doucement le contenu de la moelle dans une boîte de Petri de 6 cm. L’OS apparaît blanche, indiquant l’extraction de tous les contenus de la moelle osseuse. Répétez pour tous les os.
  5. Extrait de la souche de la moelle osseuse à l’aide d’une passoire de cellule 40 μm en nylon dans un tube à centrifuger conique de 50 mL et centrifuger à 300 x g pendant 5 min.
  6. Jeter le surnageant, laver avec 5 mL de α-MEM et centrifuger à 300 x g pendant 5 min. lavage de répétition pour un total de 2 fois.
  7. Resuspendre le culot dans 10 mL de α-MEM et effectuer un nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre comme suit :
    1. Réaliser une dilution au 1:1 de suspension cellulaire en ajoutant 10 μL de la suspension cellulaire à 10 μL de 0,4 % trypan bleu dans un tube de 1,5 mL et pipeter une fois.
    2. Couvrir la chambre hémocytomètre avec un couvercle coulissant et transférer la suspension de colorant à l’hémocytomètre. Il est important de ne pas trop remplir ou sous-classement de la chambre et laisser la suspension remplir la chambre par capillarité.
    3. Placez l’hémocytomètre sur une platine du microscope. À l’aide d’objectif 10 x, se concentrer sur la place du centre. Compter toutes les cellules liées par 3 lignes. Pour s’assurer que les cellules ne sont pas comptées deux fois, compter les coins en haut et à droite de chaque carré. Les cellules mortes apparaîtront bleu foncé, ceux-ci sont exclus de la comte.
  8. Selon l’application en aval, les cellules des graines dans un récipient de culture approprié. Pour cette expérience particulière, suivez la section 3.

3. génération de BMM

  1. Semences 1 x 107 cellules/10 mL dans un 10 cm culture plat et ajouter le M-CSF 100 ng/mL. La concentration finale de M-CSF est 100 ng/mL de milieu de culture. Incuber la culture à 37 ° C, 5 % CO2 pendant 3 jours.
  2. Après 3 jours, retirez le milieu de culture, laver les cellules vigoureusement avec 10 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) deux fois pour enlever les cellules non adhérentes, ajouter 5 mL de température ambiante 0,02 % trypsine-EDTA dans du PBS et incuber à 37 ° C, 5 % CO2 pendant 5 min.
  3. Détacher les cellules par pipetage approfondie. Assurez-vous que les cellules ont été détachées en observant la culture sous un microscope (les cellules apparaît arrondie et flottant dans les médias). Si les cellules restent attachées, répétez pipetage soigneusement pour détacher. Lorsque les cellules ont été détachés, ajouter 5 mL de α-MEM pour inactiver la réaction.
  4. Recueillir les cellules dans un tube conique de 50 mL et centrifuger à 300 x g pendant 5 min. jeter le surnageant et laver avec 5 mL de α-MEM.
  5. Centrifuger à 300 x g pendant 5 min et resuspendre le culot dans 10 mL de α-MEM.
  6. Effectuez un comptage cellulaire comme décrit dans l’étape 2.7.1.
  7. Semences 1 x 106 cellules/10 mL dans un 10 cm culture plat et ajouter le M-CSF 100 ng/mL. La concentration finale de M-CSF est 100 ng/mL de milieu de culture. Incuber la culture à 37 ° C, 5 % CO2 pendant 3 jours.

4. génération des ostéoclastes de BMM comme précurseurs Ostéoclastiques

  1. Après 3 jours, récolter les cellules attachées qui représentent BMM comme précurseurs ostéoclastiques, suivant les étapes de 3,2 à 3,7.
  2. BMM semence à 5 x 104 cellules/200 μL de α-MEM dans une plaque 96 puits. Ajouter RANKL pour une concentration finale de 50 ng/mL ou TNF-α pour une concentration finale de 100 ng/mL. Ajouter M-CSF pour une concentration finale de 100 ng/mL dans chaque puits.
  3. Ajoutez l’anticorps anti-c-fms (la concentration finale de 0, 1, 10, 100, 1000 ng/mL) dans chaque puits.
  4. Incuber à 37 ° C, 5 % CO2 pendant 4 jours. Modifier les médias tous les deux jours pendant 4 jours.

5. tache de phosphatases acides tartrate-résistantes (TRAP)

  1. Après 4 jours d’incubation, aspirer doucement le milieu de culture de chaque puits. Laver chaque bien une fois avec 200 μl de PBS 1 x température ambiante.
  2. Ajouter 200 μl de 10 % de formol dans chaque puits de fixation et incuber pendant 1 heure à température ambiante. Aspirer le formol et laver chaque puits 3 fois avec de l’eau désionisée.
  3. Ajouter 200 μl de 0,2 % Triton X-100 dans du PBS à chaque bien de perméabilisation et incuber pendant 1 heure à température ambiante. Aspirer le Triton X-100 et laver chaque puits 3 fois avec de l’eau désionisée.
  4. Ajouter 200 μl de solution de tache de piège à chaque puits. Visualiser la tache sous le microscope. Il faudra de 10 à 30 min pour la tache pour se développer correctement.
  5. Aspirer la tache et laver chacun bien avec l’eau désionisée 3 fois et sécher à l’air. Conserver à température ambiante à utiliser en observation supplémentaires.

6. essai de prolifération

  1. BMM semence comme précurseurs d’ostéoclastes à 5 x 103 cellules/200 μL de α-MEM dans une plaque 96 puits. Ajouter M-CSF pour une concentration finale de 100 ng/mL dans chaque puits.
  2. Ajoutez l’anticorps anti-c-fms (la concentration finale de 0, 1, 10, 100, 1 000 ng/mL) et incuber à 37 ° C, 5 % CO2 pendant 3 jours sans changement médiatique.
  3. Après 3 jours, laver les cellules avec du PBS 1 x. Ajouter 100 μL de α-MEM dans chaque puits.
  4. Ajouter 10 μL de solution kit de comptage de cellule et incuber à 37 ° C, 5 % de CO2 pendant 2 h et déterminer l’absorbance de chaque puits à 450 nm en utilisant un lecteur de microplaques.

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Résultats

Ce protocole vise à évaluer l’effet des anticorps anti-c-fms sur la formation des ostéoclastes en présence de RANKL ou TNF-α et de déterminer l’effet du M-CSF sur la prolifération des précurseurs ostéoclastiques. Dans ce protocole, nous avons fourni un procédé fiable par laquelle de grandes quantités de cultures d’ostéoclastes pure sont générées. Nous fournissons aussi un moyen de tester la concentration appropriée d’anticorps anti-c-fms pour inhiber la formation des ostéoclastes dans des...

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Discussion

Dans cette étude, nous avons étudié l’effet des anticorps anti-c-fms sur la formation des ostéoclastes induite par le RANKL, formation des ostéoclastes induite par la TNF-α et prolifération des précurseurs des ostéoclastes induite par la M-CSF. Nous avons constaté que le montant effectif des anticorps anti-c-fms pour l’inhibition de l’osteoclastogenesis entre la formation des ostéoclastes induite par le RANKL, formation d’ostéoclastes induite de TNF-α et M-CSF-induit la prolifération des précurseurs ostéoclastiques est d...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu en partie par un JSPS KAKENHI don de la société japonaise pour la Promotion de la Science (n ° 16K 11776 à K., n ° 17K 17306 K. S., n ° 16K 20637 à K. K., n ° 16K 20636 à M. S., n ° 18K 09862 à I. M.).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
anti-c-FmsAFS98, un anticorps monoclonal, antimurin, c-Fms (IgG2a)
TNF-&alpha ;Des souris recombinantes TNF-&alpha ; préparées dans notre laboratoire. TNF-&alpha ; Fragment d’ADNc cloné par RT-PCR et cloné dans un pGEX-6P-I (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) pour générer une protéine de fusion GST. GST-TNF-&alpha ; a été exprimé dans les cellules d’Escherichia coli BL21 (Stratagene, La Jolla, CA). Les cellules ont été lysées dans des conditions non dénaturantes et GST-TNF-&alpha ; a été purifié sur une colonne de glutathion-sépharose. GST a été scindé par PreScission Protease (Amersham Biosciences) par le fabricant. et a été éliminé par une colonne glutathion-sépharose.
RANKLPEPROTECH315-11Ligand murin recombinant sRANK, Source : E. coli
M-CSFHumain recombinant M-CSF. 1/10 vol de CMG14&ndash ; 12 surnageants de culture cellulaire à 5 x 106 cellules dans une boîte de culture en suspension de 10 cm.
&alpha ;-MEMWakoavec L-Glutamine et rouge phénol Sérum
de veau fœtalBiowests1820-500Sérum de veau fœtal Origine française Plat
de cultureCorningPlat de style
Plaque à 96 puitsThermofischer ScientificNun clon Delta
surface Kit de comptage cellulaire-8Dojindo, Kumamoto, Japon
Lecteur de microplaquesSunrise REMOTE ; Tekan Japan, Kawasaki, Japon
Crépine cellulaireCorning40 &mu ; m Tube
à centrifugerCorning50 mL Bouchon CentriStar
Triton X-100WakoPolyoxyéthylène (10) Octyphényléther
Anticorps Corning 100 mm x 20 mm en nylon

Références

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