Imagerie confocale d’ARN bicaténaire et récepteurs de reconnaissance de modèle dans l’infection par le Virus ARN de polarité négative

L’étape initiale de l’induction de la réponse immune innée est reconnaissance hôte de double-brin (ds) RNA par les récepteurs de reconnaissance de modèle (SDRP) tels que l’acide rétinoïque (RIG-je) comme des récepteurs (SRRL) RIG-I et mélanome associée à la différenciation protéine obligatoire 5 (MDA-5)¹. Pour les virus ARN de polarité positive, dsRNA habituellement facilement repérables à l’aide de la J2 ou K1 anti-dsRNA anticorps monoclonaux (ACM)². Interaction entre dsRNA et rer dans les virus à ARN brin positif, comme les picornavirus, a été caractérisée à l’aide de la microscopie confocale³. Toutefois, pour les virus à ARN sens négatif, visualisation et la caractérisation de l’interaction PRR et dsRNA a été entravée par l’absence d’anticorps sensibles d’Arndb. Hybridation in situ fluorescente (FISH) de RNA a été appliquée à la visualisation de viral RNA et PRRs⁴. Néanmoins, la méthodologie de poisson nécessite la connaissance de l’objectif de la séquence d’ARN et ne peut-être pas être compatible avec PRR conjointement la coloration. Récemment, le 5 de 9 Mab, qui a été initialement développé pour le diagnostic de l’infection à entérovirus-pan, s’est avéré être plus sensible que le Mab J2 et peut facilement détecter les Arndb en sens négatif infection de virus à ARN^5,6. Ainsi, Mab 9 5 est un outil utile pour étudier la réplication virale et l’interaction entre le PRR et l’ARN viral pour les virus à ARN de polarité négative et novateur.

Arenavirus sont une famille de virus à ARN monocaténaire, polarité négative, qui comprennent plusieurs pathogènes humains, tels que les virus de Lassa (LASV), le virus Junin (JUNV) et le virus de Machupo (MACV), qui provoquent des maladies de fièvre hémorragique sévère chez les humains,⁷. Les données cliniques de cas graves et mortels de Argentine fièvre hémorragique causée par le nouveau monde arénavirus JUNV présentent des niveaux anormalement élevés de sérum IFN-α^8,9. Nous avons montré que le pathogène arénavirus NW (JUNV et MACV), mais pas les pathogènes du vieux monde arénavirus, LASV, induisent un type j’ai réponse interféron (IFN) dans les cellules dendritiques humaines macrophages dérivés de monocytes,¹⁰. En outre, RIG-I est un des capteurs médiant de type I réponse IFN dans les cellules infectées par le JUNV¹¹. Nous avons également constaté que le R (PKR) récepteur kinase, qui est traditionnellement connu pour la reconnaissance de l’Arndb, est activé en pathogènes NW arénavirus infection¹². Pour mieux comprendre le mécanisme de réponse IFN spécifiques du virus pendant l’infection arénavirus, visait à élaborer un protocole pour visualiser l’interaction entre l’Arndb virale et le SDRP cytoplasmique.

Expériences d’infection pathogène JUNV, MACV et LASV doivent être réalisées dans la biosécurité de niveau 4 installations (BSL-4). Ainsi, en plus du niveau présumée faible d’Arndb formé en infection arénavirus, satisfaisant aux prescriptions de prévention des risques biotechnologiques est un autre défi technique lors de l’exécution des études d’imagerie pour ces virus hautement pathogènes. En utilisant les 5 9 anticorps et la souche du vaccin Candid1 # de JUNV, un protocole basé sur la microscopie confocal est décrit dans le présent rapport, qui a été utilisé avec succès pour visualiser l’Arndb, protéine virale et PRR simultanément dans les cellules infectées par arénavirus dans Laboratoires BSL2. Le protocole est également adapté pour la visualisation de la distribution intracellulaire de l’Arndb et PRR pendant l’infection pathogène arénavirus dans BSL4 installations.

1. préparation des cellules A549 et infection JUNV

1. Graine 2 x 10⁵ cellules épithéliales pulmonaires humaines A549 sur poly-D-lysine (PDL) enduit lamelles de verre en plaques à puits 12 à 24 heures avant l’infection.
2. Préparer des aliquots de 150 mL de JUNV¹³ à une multiplication d’infection (MOI) de 1,0 plaque formant unité par cellule dilué dans les médias de médium (DMEM) de l’aigle de la modification de Dulbecco additionnés de 2 % sérum fœtal (SVF) et 1 % la pénicilline et la streptomycine (P/S ).
3. Retirez les supports de culture cellulaire. Ajouter l’inoculum de virus sur chaque lamelle bien contenant et laisser incuber pendant 1,5 h à 37 ° C. Secouez les plaques toutes les 15 min.
4. Supprimer l’inoculum de virus, ajouter 1 mL de DMEM supplémenté avec 5 % de SVF et 1 % P/S. incuber les plaques à 37 ° C, pour le moment souhaité.

2. fixation et immunostaining

1. Aspirer les médias. Rincer les cellules en ajoutant 1 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS), additionnée de calcium et de magnésium dans chaque puits.
2. Supprimer les PBS. Ajouter 1 mL de méthanol (MeOH) préalablement refroidi à-20 ° C et laisser incuber à-20 ° C ou sur la glace sèche pendant 15 min.
3. Retirez le MeOH.
4. Ajouter 1 mL de PBS dans chaque puits et lavage des échantillons à 4 ° C, avec un balancement doux pendant 5 min. répéter le lavage pour 4 fois au total.
5. Laver les cellules fixes sur les lamelles dans 1 mL de 0,2 % t-octylphenoxypolyethoxyethanol pendant 5 min à 4 ° C, avec le doux balancement.
6. Ajouter 1 mL de PBS dans chaque puits. Laver les échantillons à 4 ° C pendant 5 min avec le doux balancement. Répétez l’étape de lavage pour 4 fois au total.
7. Pour détecter l’Arndb et MDA5, incuber les échantillons dans 200 mL d’anticorps primaires dilué à 3 % d’albumine sérique bovine (BSA). Diluer l’anticorps anti-dsRNA 9 5 à une dilution de 1 / 2 et diluer l’anticorps anti-MDA-5 à 1/250. Incubez avec doux balancement à 4 ° C durant la nuit.
8. Ôter les anticorps primaires et laver chaque bien avec 1 mL de PBS pendant 5 min avec doux balancement à RT. répéter ce lavage quatre fois plus.
9. Ajouter 200 mL d’anticorps secondaires (1:2, 000 dilution) dilué à 3 % de BSA et incuber à RT pendant 1 h.
10. Ôter les anticorps secondaires et laver chaque bien avec 1 mL de PBS pendant 5 min avec doux balancement à RT. répéter ce lavage quatre fois plus.
11. Pour détecter la nucléoprotéine (NP) de la JUNV et RIG-I, ajouter 200 mL d’anticorps conjugués dilué à 3 % de BSA. Diluer le conjugué anti-JUNV NP (AG-12) à 1 : 1 000 et incuber les échantillons pendant 2 h à RT avec doux balancement. Diluer les conjugués anticorps anti-RIG-j’à 1/500 et incuber à 4 ° C durant la nuit avec le doux balancement.
12. Ôter les anticorps conjugués et laver chaque bien avec 1 mL de PBS pendant 5 min avec doux balancement à RT. répéter ce lavage quatre fois plus.
13. Contre-coloration les lamelles au DAPI (1:1, 000) pendant 3 min avec balancement doux à température ambiante.
14. Laver les lamelles 3 fois, chaque fois pendant 5 min dans 1 mL de 0,5 % t-octylphenoxypolyethoxyethanol avec balancement doux à température ambiante.
15. Laver deux fois dans 1 mL de PBS pendant 5 min à chaque fois avec un balancement doux à température ambiante.
16. Laver une fois dans 1 mL de ddH₂O pendant 1 min à ta, berçant doucement.
17. Monter des lamelles couvre-objet sur lames de verre à l’aide de supports de montage. Laisser guérir du jour au lendemain.
18. Sceller les lames avec des vernis à ongles et laisser sécher pendant 1 h.
19. Image sur un microscope confocal avec le x 60 / 1,42 numérique ouverture huile d’immersion de l’objectif en utilisant les mêmes émissions laser pour chaque échantillon.
20. Lorsqu’on analyse les données, si nécessaire, faire des ajustements pour la luminosité et le contraste en utilisant le même ajustement linéaire pour tous les échantillons.

Ce protocole a été appliqué à l’étude de la distribution et la colocalisation entre les SRRL (RIG-I et MDA-5) et Arndb dans les cellules infectées par le JUNV. Comme le montre la Figure 1 et Figure 2, l’accumulation de dsRNA augmente au fil du temps à mesure que progresse l’infection virale. Concentré de MDA-5 (Figure 1) et RIG-I (Figure 2) signaux trouvées colocalisé avec les structures ponctuées de la NP et l’Arndb.

Figure 1 : évolution temporelle de l’Arndb et formation JUNV NP et la distribution de MDA-5. JUNV-infectés et infectés par le simulacre des cellules A549 étaient fixes, colorées et imagés selon le protocole à 24, 36 et 48 heures après l’infection (HPI). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : évolution temporelle de l’Arndb et formation JUNV NP et la distribution de RIG-I. JUNV-infectés et infectés par le simulacre des cellules A549 étaient fixes, colorées et imagés selon le protocole à 24, 36 et 48 HPI. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.