Imagerie confocale d’ARN bicaténaire et récepteurs de reconnaissance de modèle dans l’infection par le Virus ARN de polarité négative

Résumé

ARN bicaténaire produite lors de la réplication des virus à ARN sont reconnaissables par les récepteurs de reconnaissance de modèle pour induire une réponse immunitaire innée. Pour les virus à ARN sens négatif, l’interaction entre l’Arndb à basse altitude et PRRs reste floue. Nous avons développé une méthode de microscopie confocale afin de visualiser les arénavirus dsRNA et PRR dans des cellules individuelles.

Résumé

Double-brin (ds) RNA est produit comme intermédiaire réplicatif pendant l’infection de virus à ARN. Reconnaissance de dsRNA de récepteurs de reconnaissance modèle hôte (SDRP) tels que l’acide rétinoïque (RIG-je) comme des récepteurs (SRRL) RIG-I et mélanome protéine associée à la différenciation 5 (MDA-5) conduit à l’induction de la réponse immunitaire innée. La formation et la distribution intracellulaire de l’Arndb dans l’infection de virus à ARN de polarité positive a été bien caractérisées par microscopie. Plusieurs virus à ARN sens négatif, y compris certains arénavirus, déclenchent la réponse immunitaire innée au cours de l’infection. Toutefois, les virus à ARN sens négatif étaient censés produire de faibles niveaux d’Arndb, qui fait obstacle à l’étude d’imagerie de la reconnaissance de la PRR d’Arndb virale. En outre, des expériences d’infection avec arénavirus hautement pathogène doivent être effectuées dans les installations de niveau de biosécurité de confinement élevé (BSL-4). L’interaction viral RNA / EREP hautement pathogène du virus ARN ignore en grande partie en raison des défis techniques supplémentaires que les chercheurs doivent faire face dans les installations de BSL-4. Récemment, un anticorps monoclonal (ACM) (clone 9 5) initialement utilisé pour la détection de pan-entérovirus s’est avéré de détecter spécifiquement dsRNA avec une sensibilité plus élevée que les anticorps d’anti-dsRNA J2 ou K1 traditionnels. Dans les présentes, en utilisant les 5 9 anticorps, les auteurs décrivent un protocole de microscopie confocale qui a été utilisé avec succès pour visualiser l’Arndb, protéine virale et PRR simultanément dans les cellules infectées par des arénavirus. Le protocole est également adapté aux études de dsRNA et distribution de PRR dans les cellules pathogènes arénavirus infectés dans BSL4 installations d’imagerie.

Introduction

L’étape initiale de l’induction de la réponse immune innée est reconnaissance hôte de double-brin (ds) RNA par les récepteurs de reconnaissance de modèle (SDRP) tels que l’acide rétinoïque (RIG-je) comme des récepteurs (SRRL) RIG-I et mélanome associée à la différenciation protéine obligatoire 5 (MDA-5)¹. Pour les virus ARN de polarité positive, dsRNA habituellement facilement repérables à l’aide de la J2 ou K1 anti-dsRNA anticorps monoclonaux (ACM)². Interaction entre dsRNA et rer dans les virus à ARN brin positif, comme les picornavirus, a été caractérisée à l’aide de la microscopie confocale³. Toutefois, pour les virus à ARN sens négatif, visualisation et la caractérisation de l’interaction PRR et dsRNA a été entravée par l’absence d’anticorps sensibles d’Arndb. Hybridation in situ fluorescente (FISH) de RNA a été appliquée à la visualisation de viral RNA et PRRs⁴. Néanmoins, la méthodologie de poisson nécessite la connaissance de l’objectif de la séquence d’ARN et ne peut-être pas être compatible avec PRR conjointement la coloration. Récemment, le 5 de 9 Mab, qui a été initialement développé pour le diagnostic de l’infection à entérovirus-pan, s’est avéré être plus sensible que le Mab J2 et peut facilement détecter les Arndb en sens négatif infection de virus à ARN^5,6. Ainsi, Mab 9 5 est un outil utile pour étudier la réplication virale et l’interaction entre le PRR et l’ARN viral pour les virus à ARN de polarité négative et novateur.

Arenavirus sont une famille de virus à ARN monocaténaire, polarité négative, qui comprennent plusieurs pathogènes humains, tels que les virus de Lassa (LASV), le virus Junin (JUNV) et le virus de Machupo (MACV), qui provoquent des maladies de fièvre hémorragique sévère chez les humains,⁷. Les données cliniques de cas graves et mortels de Argentine fièvre hémorragique causée par le nouveau monde arénavirus JUNV présentent des niveaux anormalement élevés de sérum IFN-α^8,9. Nous avons montré que le pathogène arénavirus NW (JUNV et MACV), mais pas les pathogènes du vieux monde arénavirus, LASV, induisent un type j’ai réponse interféron (IFN) dans les cellules dendritiques humaines macrophages dérivés de monocytes,¹⁰. En outre, RIG-I est un des capteurs médiant de type I réponse IFN dans les cellules infectées par le JUNV¹¹. Nous avons également constaté que le R (PKR) récepteur kinase, qui est traditionnellement connu pour la reconnaissance de l’Arndb, est activé en pathogènes NW arénavirus infection¹². Pour mieux comprendre le mécanisme de réponse IFN spécifiques du virus pendant l’infection arénavirus, visait à élaborer un protocole pour visualiser l’interaction entre l’Arndb virale et le SDRP cytoplasmique.

Expériences d’infection pathogène JUNV, MACV et LASV doivent être réalisées dans la biosécurité de niveau 4 installations (BSL-4). Ainsi, en plus du niveau présumée faible d’Arndb formé en infection arénavirus, satisfaisant aux prescriptions de prévention des risques biotechnologiques est un autre défi technique lors de l’exécution des études d’imagerie pour ces virus hautement pathogènes. En utilisant les 5 9 anticorps et la souche du vaccin Candid1 # de JUNV, un protocole basé sur la microscopie confocal est décrit dans le présent rapport, qui a été utilisé avec succès pour visualiser l’Arndb, protéine virale et PRR simultanément dans les cellules infectées par arénavirus dans Laboratoires BSL2. Le protocole est également adapté pour la visualisation de la distribution intracellulaire de l’Arndb et PRR pendant l’infection pathogène arénavirus dans BSL4 installations.

Protocole

1. préparation des cellules A549 et infection JUNV

1. Graine 2 x 10⁵ cellules épithéliales pulmonaires humaines A549 sur poly-D-lysine (PDL) enduit lamelles de verre en plaques à puits 12 à 24 heures avant l’infection.
2. Préparer des aliquots de 150 mL de JUNV¹³ à une multiplication d’infection (MOI) de 1,0 plaque formant unité par cellule dilué dans les médias de médium (DMEM) de l’aigle de la modification de Dulbecco additionnés de 2 % sérum fœtal (SVF) et 1 % la pénicilline et la streptomycine (P/S ).
3. Retirez les supports de culture cellulaire. Ajouter l’inoculum de virus sur chaque lamelle bien contenant et laisser incuber pendant 1,5 h à 37 ° C. Secouez les plaques toutes les 15 min.
4. Supprimer l’inoculum de virus, ajouter 1 mL de DMEM supplémenté avec 5 % de SVF et 1 % P/S. incuber les plaques à 37 ° C, pour le moment souhaité.

2. fixation et immunostaining

1. Aspirer les médias. Rincer les cellules en ajoutant 1 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS), additionnée de calcium et de magnésium dans chaque puits.
2. Supprimer les PBS. Ajouter 1 mL de méthanol (MeOH) préalablement refroidi à-20 ° C et laisser incuber à-20 ° C ou sur la glace sèche pendant 15 min.
3. Retirez le MeOH.
4. Ajouter 1 mL de PBS dans chaque puits et lavage des échantillons à 4 ° C, avec un balancement doux pendant 5 min. répéter le lavage pour 4 fois au total.
5. Laver les cellules fixes sur les lamelles dans 1 mL de 0,2 % t-octylphenoxypolyethoxyethanol pendant 5 min à 4 ° C, avec le doux balancement.
6. Ajouter 1 mL de PBS dans chaque puits. Laver les échantillons à 4 ° C pendant 5 min avec le doux balancement. Répétez l’étape de lavage pour 4 fois au total.
7. Pour détecter l’Arndb et MDA5, incuber les échantillons dans 200 mL d’anticorps primaires dilué à 3 % d’albumine sérique bovine (BSA). Diluer l’anticorps anti-dsRNA 9 5 à une dilution de 1 / 2 et diluer l’anticorps anti-MDA-5 à 1/250. Incubez avec doux balancement à 4 ° C durant la nuit.
8. Ôter les anticorps primaires et laver chaque bien avec 1 mL de PBS pendant 5 min avec doux balancement à RT. répéter ce lavage quatre fois plus.
9. Ajouter 200 mL d’anticorps secondaires (1:2, 000 dilution) dilué à 3 % de BSA et incuber à RT pendant 1 h.
10. Ôter les anticorps secondaires et laver chaque bien avec 1 mL de PBS pendant 5 min avec doux balancement à RT. répéter ce lavage quatre fois plus.
11. Pour détecter la nucléoprotéine (NP) de la JUNV et RIG-I, ajouter 200 mL d’anticorps conjugués dilué à 3 % de BSA. Diluer le conjugué anti-JUNV NP (AG-12) à 1 : 1 000 et incuber les échantillons pendant 2 h à RT avec doux balancement. Diluer les conjugués anticorps anti-RIG-j’à 1/500 et incuber à 4 ° C durant la nuit avec le doux balancement.
12. Ôter les anticorps conjugués et laver chaque bien avec 1 mL de PBS pendant 5 min avec doux balancement à RT. répéter ce lavage quatre fois plus.
13. Contre-coloration les lamelles au DAPI (1:1, 000) pendant 3 min avec balancement doux à température ambiante.
14. Laver les lamelles 3 fois, chaque fois pendant 5 min dans 1 mL de 0,5 % t-octylphenoxypolyethoxyethanol avec balancement doux à température ambiante.
15. Laver deux fois dans 1 mL de PBS pendant 5 min à chaque fois avec un balancement doux à température ambiante.
16. Laver une fois dans 1 mL de ddH₂O pendant 1 min à ta, berçant doucement.
17. Monter des lamelles couvre-objet sur lames de verre à l’aide de supports de montage. Laisser guérir du jour au lendemain.
18. Sceller les lames avec des vernis à ongles et laisser sécher pendant 1 h.
19. Image sur un microscope confocal avec le x 60 / 1,42 numérique ouverture huile d’immersion de l’objectif en utilisant les mêmes émissions laser pour chaque échantillon.
20. Lorsqu’on analyse les données, si nécessaire, faire des ajustements pour la luminosité et le contraste en utilisant le même ajustement linéaire pour tous les échantillons.

Résultats

Ce protocole a été appliqué à l’étude de la distribution et la colocalisation entre les SRRL (RIG-I et MDA-5) et Arndb dans les cellules infectées par le JUNV. Comme le montre la Figure 1 et Figure 2, l’accumulation de dsRNA augmente au fil du temps à mesure que progresse l’infection virale. Concentré de MDA-5 (Figure 1) et RIG-I (Figure 2) signaux trouvées colocalisé av...

Discussion

Pour les virus ARN à polarité positive et virus dsDNA, dsRNA est facilement détectable avec l’anticorps d’anti-dsRNA J2 largement utilisé. Toutefois, les virus à ARN sens négatif sont censés produire dsRNA faible ou au-dessous du niveau de détection en utilisant le même anticorps². Ainsi, beaucoup d’aspects de l’interaction ARN et PRR virale est en grande partie floue pour les virus à ARN sens négatif. Nous avons tenté de tache de dsRNA arénavirus infection à l’aide de l’anticorps J2, mais les sig...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
APEX Alexa Fluor 647 kit de marquage d’anticorps	Invitrogen	A10475
BSA	Sigma Aldrich	A4503
DAPI	Cell Signaling	4083	dilution 1:1 000
Donkey-anti rabbit Alexa Fluor 594	Invitrogen	A-11058	dilution 1:2 000 ; Lot # : 1454437
Dulbecco’s modified Eagle’s medium	Corning	10-013-CV
Fetal Bovine Serum	Atlanta Bio	S11150
Lames de microscope en verre	Fisher	12-550-15
Goat-anti mouse Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11029	dilution 1:2000 ; Lot # : 1874804
Cellules épithéliales pulmonaires humaines A549	ATCC	CCL-185
Méthanol	Fisher	A412	Stocké à -20 ° ; C
Souris MAb anti-JUNV NP	BEI	NA05-AG12	Conjugué à Alexa-647 à une dilution de 1:1 000
Souris MAb pan-Enterovirus 9D5 Réactif	Millipore Sigma	3361	prêt à l’emploi ; dilué à 1:2 ; Lot # : 3067445
PBS complété par Ca et Mg	Corning	21-030-CV
PDL Lamelles enrobées	Neuvitro	H-12-1.5-pdl
ProLong Gold anti-décoloration	Invitrogen	P10144
Rabbit MAb MDA-5	Abcam	ab126630	dilution 1:250 ; Lot # : GR97758-7
souche Candid#1 recombiante de JUNV	générée en laboratoire	Comme	décrit précédemment dans la référence 13.
MAb de souris RIG-I conjuguée à Alexa-594	Santa Cruz	sc-376845	dilution 1:1000 ; Lot # : AO218
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787  ;