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Adsorption de spores comme un système d’affichage recombinants pour les Enzymes et les antigènes

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DOI :

10.3791/59102

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19 mars 2019

 ,  , 
1Department of Biology, Federico II University, 2Department of Molecular Medicine and Medical Biotechnology, University of Naples "Federico II"

Dans cet article

Résumé

Ce protocole porte sur l’utilisation des spores bactériennes comme un outil de nanobiotechnological « en direct » pour adsorber les molécules hétérologues avec diverses activités biologiques. Les méthodes pour mesurer l’efficacité d’adsorption sont également indiqués.

Résumé

Les spores bactériennes est une cellule métaboliquement quiescente, formée par une série de couches protectrices entourant un cytoplasme déshydraté. Cette structure particulière rend la spore extrêmement stable et résistant et a suggéré l’utilisation de la spore comme une plate-forme pour afficher des molécules hétérologues. Jusqu’ici, une variété d’antigènes et d’enzymes ont été affichés sur les spores de Bacillus subtilis et de quelques autres espèces, tout d’abord par une approche recombinante et, ensuite, par une méthode simple et efficace de recombinants. Le système d’affichage recombinants repose sur l’adsorption directe de hétérologue molécules sur la surface des spores, en évitant la construction de souches recombinantes et la libération des bactéries génétiquement modifiés dans l’environnement. Molécules adsorbées sont stabilisées et protégés par l’interaction avec les spores, qui limite la dégradation rapide des antigènes et la perte de l’activité enzymatique à des conditions défavorables. Une fois utilisé, spore-adsorbé enzymes peuvent être collectées facilement avec une réduction minimale de l’activité et réutilisés pour tours de réaction supplémentaire. Dans le présent document est montré comment s’adsorber les molécules modèles à spores purifiées de b. subtilis, comment évaluer l’efficacité d’adsorption et la collecte des spores usagés pour les recycler pour nouvelles réactions.

Introduction

Systèmes d’affichage visent à présenter des molécules biologiquement actives sur la surface des micro-organismes et de trouver des applications dans une variété de domaines, des industriels aux biotechnologies médicales et écologiques. En plus des phages1,2 et cellules de divers Gram - positifs et espèces3,4,5,6,7, spores bactériennes ont également été proposé comme systèmes d’affichage par deux approches8,9.

En raison de sa structure particulière, à savoir un cytoplasme déshydraté, entouré par une série de couches protectrices10, la spore offre plusieurs avantages par rapport aux phages et cellule dotés d’écran systèmes8,9. Un premier avantage provient de l’extrême robustesse et stabilité des spores dans des conditions qui seraient préjudiciables à tous les autres cellules10,11. Enzymes et spore-affiche les antigènes sont stables après une conservation à température ambiante12 et protégée de la dégradation à pH faible et des températures élevées,13. Un deuxième avantage des spores est la sécurité de nombreuses espèces sporulées. B. subtilis, b. clausii, b. coagulanset plusieurs autres espèces sont utilisées dans le monde entier comme probiotiques et sont trouvent sur le marché à usage humain ou animal pour des décennies14,15. Cet enregistrement de sécurité exceptionnel est une évidente exigence générale pour un système d’affichage de surface et est particulièrement pertinent lorsque le système est destiné à l’usage humain ou animal,16. Un tiers, un avantage important d’un système d’affichage basé sur spore est qu’il n’a pas de limites pour la taille de la molécule qui doit être exposé. Dans les systèmes phage, une grosse protéine hétérologue peut affecter la structure de la capside, tandis que dans les systèmes basés sur les cellules, il peut affecter la structure de la membrane ou limite/qui risqueraient de la membrane translocation étape17. Les couches protectrices entourant la spore sont composent de plus de 70 différents protéines10 et sont suffisamment souples pour accepter les grosses protéines étrangères sans défaut structurel évident ou une impotence fonctionnelle8. En outre, avec les deux systèmes d’affichage axée sur les spores, la translocation de la membrane de la protéine hétérologue n’est pas requis8,9. En effet, les protéines hétérologues sont soit produites dans le cytoplasme de la cellule-mère et assemblés sur le spore qui se forme dans le même cytoplasme ou adsorbés sur les spores mûres8,9.

Affichage de spore a été initialement obtenu en développant un système génétique pour l’ingénieur de la spore surface18. Ce système génétique reposait sur i) la construction d’une fusion de gènes entre le gène codant pour une protéine de capside de spore (utilisée comme support) et le gène codant pour la protéine d’être affiché - la présence des signaux transcription et traduction de l’endogène gène contrôlera l’expression de la fusion et ii) l’intégration du gène sur le chromosome de b. subtilis d’accorder la stabilité génétique chimérique. Une variété d’antigènes et d’enzymes ont été affichées par cette approche recombinante, à l’aide de diverses protéines de surface des spores comme porteurs et visant à diverses applications possibles, allant de vaccin muqueux à biocatalyseur, biocapteurs, bioremédiation, ou bioanalytiques outil8,13.

Plus récemment, une approche différente de l’affichage de la spore a été développé19. Ce deuxième système est recombinants et repose sur l’adsorption spontanée et extrêmement serrée des molécules sur la surface de spore9. 19,d’antigènes20 et enzymes de13,21 ont été exposés avec efficacité et ont révélé que cette méthode est significativement plus efficace que celui recombinant. Cette approche non permet l’affichage des protéines dans la forme native20 et peut également être utilisée avec autoclave, mort des spores19. Le mécanisme moléculaire de l’adsorption n’a pas été entièrement précisé encore. La charge négative et l’hydrophobicité de la spore ont été proposés en tant que propriétés pertinentes pour l’adsorption13,19,22. Récemment, il a été démontré qu’une protéine de modèle, la protéine auto-fluorescente rouge (RDRF) des coraux Acropora, lorsque adsorbés à la spore, a pu s’infiltrer à travers les couches de surface localisation dans la couche intérieure de23. S’est avéré vrai pour les autres protéines, la localisation interne des protéines hétérologues pourrait expliquer leur stabilité accrue lorsque adsorbé à spores23.

Dans une étude récente, deux enzymes catalysant deux étapes successives de la voie de dégradation de xylan s’affichaient indépendamment sur les spores de b. subtilis et incubés ensemble, ont été en mesure d’effectuer les deux étapes de dégradation21. Spores recueillis après la réaction étaient encore actifs et en mesure de continuer la dégradation xylane lors de l’addition du substrat frais21. Même si une perte d’environ 15 % du produit final a été observée dans la deuxième réaction21, la réutilisabilité des enzymes adsorbés pour unique, ainsi que plusieurs étapes, les réactions constitue un atout important du système d’affichage de la spore.

Pan et al.24 a signalé une approche supplémentaire pour afficher des protéines hétérologues sur la surface des spores : protéines hétérologues (une protéine endoglucanase et une bêta-galactosidase un) produits dans la cellule-mère au cours de la sporulation étaient spontanément enfermé dans le manteau formant des spores, sans avoir besoin d’un transporteur. Ce système d’affichage supplémentaires spore est une combinaison des deux approches décrites jusqu'à présent. En effet, il est recombinant puisque les protéines hétérologues ont été conçus pour être exprimé dans la cellule-mère au cours de la sporulation, tandis que leur Assemblée au sein de la couche a été spontanée et, par conséquent, non24. Cependant, l’efficacité de l’affichage de cette approche supplémentaire reste à être testés et comparés avec les deux autres approches en utilisant les mêmes protéines hétérologues.

Le présent protocole exclut les processus de production de spores et de purification, qui ont été décrits abondamment ailleurs24. Il comprend la réaction d’adsorption, l’évaluation de l’efficacité d’adsorption par microscopie-dot-blot et de fluorescence, et le recyclage des enzymes adsorbés de réaction supplémentaire de tours.

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Protocole

1. réaction d’adsorption

  1. Incuber 2, 5 et 10 µg de RDRF avec 2 x 109 de spores purifiées de b. subtilis sauvage dans 200 µL de liaison tampon, citrate de sodium de 50 mM, pH 4,0 (16,7 mM du citrate de sodium dihydraté ; acide citrique 33,3 mM) pendant 1 h à 25 ° C sur un agitateur basculant (Figure 1) .
  2. Centrifuger les mélanges de liaison (13 000 x g pendant 10 min) pour fractionner les granulés (P2, P5 et P10) et des surnageants (S2, S5 et S10). Stocker les surnageants d’évaluation indirecte de l’efficacité d’adsorption décrite à l’étape 3.2.
  3. Laver les granules 2 x avec 200 µL de tampon et remettre dans 100 µL de liaison de la mémoire tampon et utilisent pour l’analyse suivante contraignants.
    Remarque : La réaction de liaison se produit préférentiellement à un pH plus bas que le point isoélectrique de la protéine ; en général, 1,5 M tampon phosphate salin (PBS), pH 4.0, ou 50 mM du citrate de sodium, pH 4,0, sont utilisés.

2. directe évaluation de l’efficacité d’adsorption

  1. Extraction des protéines de surface et analyse par western blot
    1. Prendre 50 µL de la remise en suspension des spores RDRF-adsorbé (P2, P5 et P10 de l’étape 1.3) et ajouter 50 µL de 2 x dodécylsulfate de sodium (SDS)-le dithiothréitol (DTT) (0,1 M Tris-HCl, pH 6,8 ; 2 % SDS ; 0,1 M TNT) pour solubiliser des protéines de surface de spore.
    2. Utilisez les RDRF gratuit, purifiée et extraits des mêmes quantités de spores qui ne sont pas adsorbés à la protéine comme témoins positifs et négatifs, respectivement.
    3. Après 45 min d’incubation à 65 ° C, centrifuger (13 000 x g pendant 10 min), les mélanges et analyser 10 µL de l’extraits (surnageants) de protéines par western blot avec l’anticorps monoclonal anti-son anticorps reconnaissant son étiquette actuelle du N-terminal de RDRF ( Figure 2A).
  2. Observations de microscopie fluorescente
    Remarque : En utilisant des protéines hétérologues fluorescentes ou effectuer une analyse de l’immunofluorescence, il est possible de localiser et de quantifier les molécules adsorbées par microscopie à fluorescence.
    1. Prenez 5 µL de resuspension des spores adsorbé à l’étape 1.3 et ajouter 95 µL de PBS 1 x, pH 4.0, pour obtenir environ 1 x 106 spores/µL.
    2. Déposer 5 µL de suspension sur une lame de microscope, recouvrir d’un lamelle couvre-objet précédemment traité par poly-l-lysine pour 30 s et l’observe sous un microscope à fluorescence.
    3. Pour chaque champ, enregistrer l’image de microscopie à contraste de phase et l’image de microscopie de fluorescence (Figure 2B).
      Remarque : Vous pouvez également fluorescents spores peuvent être analysés par cytofluorimetry. Remettre un total de 106 spores adsorbé ou non-adsorbé avec la protéine hétérologue dans 1 mL de PBS 1 x, pH 4.0 et analyse la suspension à l’aide d’un cytomètre de flux (Figure 2C).
  3. Analyse de données à l’aide de ImageJ
    1. Ouvrir les images de microscopie de fluorescence avec ImageJ logiciel (http://rsbweb.nih.gov/ij/) et vérifiez que toutes les images sont au format 8 bits (Image | Type | 8 bits).
    2. Ajustez le contraste si nécessaire (Image | Ajuster | Luminosité contraste) et vérifiez que l’échelle de l’image est PIXEL (Image | Définissez l’échelle).
    3. Dans le menu analyser, sélectionnez définir les mesures. Assurez vous d’avoir la zone, la Densité intégréeet Signifie gris valeur sélectionnée.
    4. Tracer une ligne autour de la spore d’intérêt en utilisant les outils de dessin et de sélection (c.-à-d., le cercle, le polygone, ou forme libre) (Figure 3).
    5. Sélectionnez la mesure dans le menu analyser (ou appuyez sur cmd + M). Une boîte de popup avec un stack de valeurs pour cette première spores s’affiche (Figure 3).
    6. Répétez ces deux étapes pour au moins 50 autres spores dans le champ de vision choisis doivent être mesurés.
    7. Sélectionner plusieurs régions sans spores (qui n’ont aucune fluorescence) et recommencez la mesure ; ce sera le fond.
      Remarque : La taille n’est pas importante. Ces contre-valeurs de fluorescence de fond servira à soustraire manuellement l’arrière-plan.
    8. Sélectionnez toutes les données dans la fenêtre de résultats et de copier les résultats dans une feuille de calcul.
    9. Calculer la moyenne de la zone des spores sélectionnés et des valeurs de fluorescence de fond et de Densité intégrée et utilisez-les pour obtenir la fluorescence de total par cellule (FCCT) corrigée à l’aide de la formule : CTCF = moyenne intégrés Densité - (surface moyenne x moyenne fluorescence de fond).
      NOTE : Sinon, si toutes les spores apparaissent bien séparés, il est possible d’analyser toutes les spores du champ image en utilisant la fonction Analyser les particules, suivant les instructions de ImageJ. Pour éviter que le logiciel lit une fluorescence spécifique ou agrégats de spore, la dimension des particules doit être réglé à pixelˆ2 = 50-200 (Figure 4).

3. indirecte évaluation de l’efficacité d’adsorption

  1. Préparer des dilutions successives pour la protéine purifiée.
    1. Préparer un premier tube de 1,5 mL contenant 250 µL de RDRF purifiée à une concentration finale de 0,5 ng/µL, en utilisant le tampon de liaison. Ce volume est suffisant pour charger deux voies.
    2. Effectuer six double série de dilutions de 250 µL (volume final) chacune, en utilisant le tampon de liaison.
  2. Préparer des dilutions en série pour les échantillons de surnageants contenant la fraction RDRF indépendant de la réaction d’adsorption (S2, S5 et S10 de l’étape 1.2) double.
    1. Mettre 100 µL de chaque surnageant dans un tube de 1,5 mL et ajouter 100 µL de tampon de liaison. Effectuer six double série de dilutions de 200 µL (volume final) de chaque, en utilisant le tampon de liaison.
  3. Couper une nitrocellulose membrane (coupure de 0,45 µm), 9 x 10 cm dans la taille, pour couvrir la zone 5 (nombre d’échantillons) x 6 points (nombre de dilutions). La membrane ne doit pas dépasser le bord du joint de l’appareil de dot blot.
  4. Placer la membrane tremper dans l’appareil de la tache de dot. Éliminez les bulles d’air emprisonnés entre la membrane et le joint. Couvrir la fraction inutilisée de l’engin avec le film de ruban ou de la paraffine pour empêcher l’air de se déplacer par le biais de ces puits.
  5. Assembler l’appareil de la tache de dot comme indiqué par le fabricant.
  6. Si le vide est utilisé lors de l’assemblage, réhydrater la membrane avec 100 µL de solution 1 PBS x / puits pour garantir la liaison uniforme de l’antigène et éviter les auréoles ou un signal de détection faible.
  7. Retirez délicatement le tampon des puits par le vide. Dès que la solution tampon s’écoule de tous les puits, arrêter la pompe à vide et débranchez-le.
  8. Charger la norme dans les deux voies plus extérieures et les échantillons au milieu (Figure 5). Remplir les puits appropriés avec 100 µL de chaque dilution. Le même volume utilisé pour chaque puits devrait assurer une filtration homogène de tous les puits de l’échantillon.
  9. Mettre en marche la pompe à vide pendant 2 min, arrêter et ensuite, laisser l’échantillon filtrer à travers la membrane par écoulement gravitaire.
  10. Laver tous les puits avec 100 µL de 1 x PBS et laissez la pompe fonctionner pendant encore 5 min après le tampon de lavage a été entièrement vidangée de l’appareil.
  11. Avec le vide, desserrer les vis et ouvrir avec précaution l’appareil de dot blot.
  12. Éteindre l’aspirateur, prendre la membrane et le traiter selon un protocole de transfert de western.
  13. Effectuer une analyse densitométrique du filtre, à l’aide de logiciels appropriés, tels que ImageJ.
    1. Mesurer la densité intégrée de chaque point de leur expliquant avec un cercle du même espace et en utilisant la commande Analyze/mesure .
    2. Faire une correction de fond de l’image, dessiner un cercle dans une zone vide et sa densité intégrée de mesure ou à l’aide de la commande de Processus/soustraction arrière-plan .
    3. La densité intégrée des points standards en corrélation avec la quantité de protéines chargées et d’obtenir une courbe d’étalonnage (R2 valeurs d’étalonnage courbes doivent être à 0,95).
    4. La courbe d’étalonnage permet d’extrapoler la concentration de RDRF de chaque point de l’échantillon.
    5. Calculer la concentration de la RDRF restant dans les fractions non liées.
      Remarque : Pour assurer la fermeture correcte de l’appareil de dot blot et, par conséquent, au sujet la membrane à une pression uniforme, serrer les vis en suivant un schéma croisé en diagonale et, ensuite, ouvrir la pompe à vide pour serrer les vis plus fortement.

4. la collection des spores et la réutilisation

  1. Pour le recyclage de la spore adsorbée, effectuer deux réactions d’adsorption de 2,0 x 10 spores9 purifié avec 10 µg de purifiée GH10-XA xylanase ou 10 µg de purifiée GH3-XT β-xylosidase, tel que décrit dans les étapes 1.1-1.3 (Figure 6A).
  2. Recueillir des granulés contenant les spores adsorbé à l’enzyme, les remettre en suspension dans 50 µL de la mémoire tampon d’optimale pour l’analyse de la réaction enzymatique (tampon de phosphate de sodium de 50 mM à pH 6,5 ; 2,48689 g/L Na2HPO4, 4,88991 g/L NaH2PO4), et mélanger l’ensemble pour obtenir un mélange de 100 µL de spores adsorber GH10-XA ou GH3-XT.
  3. Ajoutez le substrat (5 mg/mL 4-O-methyl-d-glucuronod-xylan [MGX]) et de laisser les réactions enzymatiques ont lieu pendant 16 h à 65 ° C.
  4. Centrifuger le mélange réactionnel (à 15 min à 13 000 x g) et stocker le liquide surnageant contenant le produit de la réaction enzymatique.
  5. Resuspendre le culot dans 100 µL de tampon de phosphate de sodium frais 50 mM à pH 6,5 en présence d’un nouveau support (MGX) (Figure 6B).
    Remarque : Pour adsorber plus d’une enzyme, il est possible d’adsorber les deux ensemble ou les uns indépendamment. La dernière possibilité facilite l’analyse quantitative de l’efficacité d’adsorption et de l’activité de chaque enzyme, ce qui permet un équilibre stoechiométrique de chaque enzyme nécessaire pour les réactions.

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Résultats

Adsorption réussie peut être évaluée par western Blot. Lors de la réaction, le mélange est fractionné par centrifugation et lavé, et la fraction de pellet (Figure 1) est utilisée pour extraire les protéines de surface. L’extrait est fractionné par électrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS (PAGE), électrotransféré sur une membrane de polyfluorure de vinylidène (PVDF) et a réagi contre les anticorps primaires et secondaires. La présence de protéines de la ta...

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Discussion

Ce protocole d’adsorption de spore est très simple et intuitive. La réaction est strictement dépendante du pH de la mémoire tampon de réaction et l’efficacité d’adsorption est optimale lorsque le pH acide (pH 5,0 ou plus bas). À des conditions de pH neutre, l’efficacité d’adsorption est faible, et à un pH alcalin, adsorption ne peut survenir. Adsorption optimale est obtenue en utilisant un volume de 200 µL dans des tubes de 1,5 mL (ou garder un ratio similaire) sur un agitateur basculant.

L’ad...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par « Finanziamento di Ricerca di Ateneo » à L. Baccigalupi, titre du projet « SP-LAY : des spores bactériennes platefrome direct pour l’affichage des protéines ».

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
solution de poly-L-lysine à 0,1 %SigmaP8920
0,45 & micro ; m Membrane buvardeur nitrocellulosiqueSartoriusM_Blotting_Membranes
 ; objectif UPlanF1  ;de microscopeOlympus
Bacillus subtilis  ; souche NCIB3610Bacillus Genetic Stock Center3A1
BD ACCURI C6 PLUSBDCytomètre
BX51Microscope
Olympus Clarity AppareilBiorad1705060
DP70 unéquipementOlympus
Anticorps secondaire anti-Rabbit IgG (H+L) Adsorbé croisé Anticorps secondaire, FITCThermo fisherF-2754
Chèvre Anti-Lapin IgG H& L (HRP)  ;Abcamab6721
Anti-polyHistidine monoclonale&minus ; Anticorps anti-peroxydaseSigmaA7058-1VLutilisé pour détecter les protéines adsorbées présentant un marqueur 6xhistidine au niveau C- ou N-terminal.
SecureSlip  ; lamelle en verreSigmaS1815-1PAK
Superwhite Lames de microscope non chargéesVWR75836-190
U-CA Magnification Changer  ;de microscopeOlympus
100&foisÉquipement en fluxfluorescent photo numérique de microscope Équipement

Références

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Mots-clés

Spores bact riennesexposition d enzymesexposition d antig nesmicroscopie fluorescenceWestern Blotanalyse par Dot Blotquantification via ImageJrecyclage des spores

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