Nous présentons ici un protocole visant à construire le laboratoire bulle colonne photobioréacteurs et utilisez-les pour la culture micro-algues. Il fournit également une méthode pour déterminer le taux de croissance de la culture et de la teneur en lipides neutres.
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Article de méthode
Culture de microalgues vertes en bulle colonne photobioréacteurs et un dosage des lipides neutres
Dans cet article
Résumé
Résumé
Il y a des intérêts importants dans l’étude des microalgues pour applications d’ingénierie tels que la production de biocarburants, produits à haute valeur et pour le traitement des déchets. Comme la plupart des nouveaux efforts recherche commencent à l’échelle du laboratoire, on a besoin de méthodes rentables pour la culture des microalgues de façon reproductible. Ici, nous communiquons une approche efficace de la culture de microalgues dans des photobioréacteurs de laboratoire et pour mesurer la croissance et la teneur en lipides neutres de cette algue. Instructions figurent également sur la façon de mettre en place le système Photobioréacteur. Bien que les organismes de l’exemple sont les espèces de Chlorella et Auxenochlorella, ce système peut être adapté pour cultiver une large gamme de microalgues, y compris des cultures d’algues avec des espèces non-algues. Cultures mères sont tout d’abord cultivés dans des bouteilles pour produire l’inoculum pour le système Photobioréacteur. Inoculum algues est concentrée et transféré dans les photobioréacteurs pour la culture en mode batch. Les échantillons sont recueillis pour les lectures de densité optique. À la fin de la culture de lot, les cellules sont récoltées par centrifugeuse, lavé et lyophilisé pour obtenir une concentration finale de poids sec. La concentration en poids sec final sert à créer une corrélation entre la densité optique et la concentration de matière sèche. Une méthode de Folch modifiée est ensuite utilisée pour extraire les lipides totaux de la biomasse lyophilisée et l’extrait est analysé pour sa teneur en lipides neutres à l’aide d’un test de la microplaque. Cet essai a été publié précédemment mais les étapes du protocole ont été inclus ici pour mettre en évidence les étapes critiques de la procédure où les erreurs se produisent fréquemment. Le système de bioréacteur décrit ici comble un créneau entre culture simple fiole et bioréacteurs commerciales entièrement contrôlé. Même avec seulement 3-4 biologique réplicats par traitement, notre approche de la culture d’algues conduit à des écarts serrés dans les essais de croissance et de lipides.
Introduction
L’application des microalgues dans l’ingénierie et de la biotechnologie a suscité un grand intérêt ces dernières années. Les microalgues sont étudiées pour une utilisation dans le traitement des eaux usées traitement1,2,3,4, biofuel production5,6,7,8et le production de nutraceutiques et d’autres produits de haute valeur9,10. Algues sont également génétiquement modifiés à des taux plus élevés dans le but d’améliorer leur condition physique spécifique engineering applications11,12. Par conséquent, il y a beaucoup d’intérêt dans l’expérimentation avec des organismes industriellement pertinentes en milieu contrôlé. Le but de cette méthode est de communiquer une approche efficace de la culture de microalgues dans un environnement de laboratoire contrôlées et de mesurer la croissance et la teneur en lipides neutres de cette algue. Améliorer la croissance taux et teneur en lipides neutres des micro-algues ont été identifiés comme les deux principaux goulets d’étranglement vers la commercialisation des biocarburants algues13.
Un large éventail d’approches ont été utilisés à des algues de culture à des fins expérimentales. En général, ces approches peuvent être divisés entre culture extérieure à grande échelle et de la culture en intérieur à petite échelle. Culture en plein air dans des photobioréacteurs et étangs ouverts est appropriée pour l’expérimentation vise à intensifier les processus qui ont déjà été éprouvées à l’échelle laboratoire (par exemple, pour tester l’intensification d’une nouvelle souche haute-lipide d’algues)14. Cependant, culture en intérieur à petite échelle est appropriée lors du développement de souches d’algues nouveaux ou améliorés ou des expériences visant à comprendre les mécanismes biologiques. Dans ces derniers cas, un haut-niveau de contrôle expérimental est nécessaire pour isoler les changements subtils de comportement biologique. À cette fin, les cultures axéniques doivent souvent afin de minimiser les facteurs biotiques complexes associés avec d’autres organismes (p. ex. bactéries, algues) qui poussent inévitablement dans les systèmes extérieurs à grande échelle. Même lorsque l’étude des interactions entre les algues et autres organismes, nous avons trouvé qu’utilisation des conditions expérimentales très contrôlé est utile lorsqu’on examine les échanges moléculaires entre organismes15,16,17.
Dans la catégorie des cultures d’algues indoor à petite échelle, un éventail d’approches ont été utilisées. Peut-être l’approche la plus courante consiste à cultiver des algues dans des flacons Erlenmeyer sur un tableau de dispositif trembleur sous une lumière banque18,19. Échange d’oxygène et de CO2 se déroule par diffusion passive grâce à un bouchon de mousse dans la partie supérieure du ballon. Certains chercheurs ont amélioré ce set-up une aération active des flacons20. Une autre approche consiste à cultiver des algues dans des bouteilles, mixés par barre de remuer et aération active. Malgré leur simplicité, nous avons trouvé que l’utilisation de flacons et bouteilles conduit souvent à des résultats incohérents entre les réplicats biologiques. C’est sans doute en raison des effets de position - différentes positions reçoivent des quantités différentes de la lumière, qui affectent également les températures internes de réacteur. La rotation quotidienne de réacteurs vers de nouvelles positions peuvent aider mais n’allège pas le problème car certaines étapes de la croissance des algues (par exemple, au début exponentielle) sont plus sensibles aux effets de position que d’autres (par exemple, la phase logarithmique).
À l’opposé du spectre de la sophistication technologique sont photobioréacteurs commercial entièrement contrôlé. Ces systèmes en permanence surveillent et ajuster les conditions dans le réacteur afin d’optimiser la croissance des algues. Ils ont d’éclairage programmable, régulation de température en temps réel et contrôle du pH. Malheureusement, ils sont coûteux et coûtent généralement plusieurs milliers de dollars par réacteur. Plus de revues scientifiques et d’ingénierie nécessitent réplication biologique des résultats, ce qui nécessite l’achat de plusieurs bioréacteurs. Nous présentons ici un système de réacteur de colonne de bulles qui comble le fossé entre les simples (fiole) et sophistiqué (entièrement contrôlée par bioréacteur) s’approche pour la culture d’algues-l’échelle du laboratoire. Colonnes de bulles permet de faciliter les échanges gazeux et de mélanger le réacteur hausse des bulles de gaz. Cette approche fournit un degré de contrôle sur l’éclairage et la température, mais le fait d’une manière peu onéreuse. En outre, nous avons trouvé ce système pour donner des résultats très cohérents entre les réplicats biologiques, réduisant le nombre de réplicats biologiques nécessaires afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs par rapport à l’approche de la fiole ou une bouteille. Nous avons également utilisé ce système pour cultiver avec succès des mélanges d’algues et de bactéries21. En plus de culture d’algues, nous décrivons une procédure pour mesurer la teneur en lipides neutres dans les algues cultivées. Cette dernière méthode a été publiée ailleurs22, mais nous incluons la procédure ici pour fournir des instructions pour savoir comment employer avec succès.
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Protocole
1. installation de bulle colonne photobioréacteurs
- Construire un jeu de couvercles ventilés des couvercles en plastique fourni avec les bouteilles de verre de 1 L et les tubes d’hybridation (voir Figure 1 schéma et photos). Construire des couvercles pour l’humidificateur, piège, chaque air lift Photobioréacteur et chaque réacteur bouteille de mélange.
- ¼" trous dans le couvercle : 2 trous sont nécessaires pour les couvercles bioréacteur et humidificateur ; 3 trous sont nécessaires pour le mélange de piège.
- Glisser un ¼" o-ring sur le filetage d’un raccord Luer de montage de panneau 1/8" et cela glisser dans le trou de ¼" foré dans le couvercle (Figure 1 a).
- Glisser un deuxième ¼" o-ring sur les filets afin que le couvercle est pris en sandwich entre les deux joints toriques. Glisser un écrou de blocage sur le filetage et serrer pour fixer le panneau Montage Luer en place.
- Emboîter les anneaux de verrouillage sur le projetant Luer mâle exposé du couvercle. Répétez les étapes 1.1.2-1.1.4 pour chaque trou dans le couvercle.
- Pour les couvercles qui seront utilisées pour des réacteurs de colonne et bouteille bulle, joignez 1/8" femelle Luer pour raccords cannelés à 1.5" morceaux de 1/8" tube PVC ID. Fixer à chacun des raccords Luer mâles exposés sur le couvercle.
- Connecter un clapet anti-retour (pointant à l’écart du couvercle) à l’extrémité libre de l’un des 1/8" morceaux.
NOTE : Ceci servira de l’orifice d’échappement pour le bioréacteur. - Connecter un Luer mâle à laissé sur le raccord à la deuxième pièce de 1/8" tube saillie sur le couvercle. Cliquez sur la bague rotative de la serrure en place et fixer un filtre à air 0,2 mm pour cela.
NOTE : Ceci servira de l’orifice d’entrée du réacteur.
Figure 1. Schéma et photos pour construire des bioréacteurs. Schéma (A) pour la construction du bioréacteur couvercles (B) photo du couvercle assemblé bioréacteur et (C) photo du couvercle assemblé utilisé pour l’humidificateur. Notez que les raccords de l’humidificateur doivent revêtir en silicone imperméable à l’eau pour assurer un joint étanche avec le couvercle. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
- Monter le système de livraison air (voir Figure 2 a et 2 b pour un schéma et la photo).
- Attacher 1/8" NPT filetée pour raccords cannelés pour les entrées et sorties à l’arrière de chaque rotamètre.
NOTE : 200-2 500 cm3/min rotamètres pour moduler la pression air en amont de l’humidificateur, 100-1 000 cm3/min rotamètres sont pour les réacteurs de la bouteille, de 50 à 500 cm3/min rotamètres sont pour air lift bioréacteurs et 5-50 cm3/ min rotemeters sont pour la régulation du débit CO2 . Il est recommandé de Mont rotamètres à une surface fixe (par exemple feuille de plastique) afin qu’ils ne tombent pas au cours de l’opération. - Couper la source d’air comprimé, puis connecter ¼" ID PVC tuyau flexible à la source d’air comprimé avec un collier de serrage. Descendez le diamètre de tuyau de 1/8" tuyau flexible PVC ID en utilisant un ¼" femelle pour raccord cannelé et une mâle-raccord cannelé 1/8".
- Raccorder l’extrémité libre du tuyau ID 1/8" à l’entrée de rotamètre 200-2 500 cm3/min.
Remarque : La sortie de cette rotamètre nourrira la bouteille humidificateur via 1/8" tube ID. - Connecter le tuyau à une entrée à un couvercle ventilé (utilisez un raccord Luer femelle à barb raccord pour établir la connexion) 1/8". Connectez ensuite un deuxième morceau de 1/8" tube à l’intérieur de la monture du panneau montage.
NOTE : Cette pièce va pendre dans l’humidificateur et l’air des bulles dans l’eau. - Attacher 1/8" femelle Luer à barb raccords à chaque extrémité d’un morceau de 1/8" tube ID et utiliser ce morceau pour raccorder la sortie de l’humidificateur à l’entrée du piège du mélange.
- De la même manière que 1.2.5, raccorder la sortie du régulateur2 CO à une deuxième voie le piège de mélange.
- Construire un collecteur à l’aide de 1/8" tube et 1/8" barb multiport (voir Figure 2 C) pour alimenter l’air dans les banques de rotamètre.
Remarque : Ces rotamètres serviront à fournir les bioréacteurs. Éviter la construction de plus de 6 rotamètres de série. Utilisez plutôt des bords parallèles de rotamètres pour étendre le système. S’assurer que la demande de débit total de tous les réacteurs est inférieur à 2 500 cm3/min (ou sinon il faudra un rotamètre plu en amont de l’humidificateur). - Raccorder la sortie (3rd port) du piège du mélange aux banques rotamètre nouvellement construit à l’aide de 1/8" tube et un 1/8" femelle à barb Luer.
- Se connecter suffisamment longue 1/8" tube sur les prises de chaque rotamètre dans la banque de rotamètre pour alimenter en air les bioréacteurs. Étiqueter les extrémités de la tuyauterie ainsi que les rotamètres dans la banque.
- Appliquer du silicone imperméable à l’eau autour de tous les ports sur l’humidificateur et le brassage des couvercles de piège pour s’assurer qu’ils sont étanche à l’air.
- Attacher 1/8" NPT filetée pour raccords cannelés pour les entrées et sorties à l’arrière de chaque rotamètre.
Figure 2. Schéma et photos pour le montage de système de colonne de bulles. Schéma (A) de la photo de système (B) d’aération de l’humidificateur, mélange de piège et banque de rotamètre et (C) photo des collecteurs utilisés pour relier les rives rotamètre. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
- Mettre en place les réservoirs à poisson, remuer les plaques et les lumières (Figure 3).
Attention : Ce système requiert un grand nombre de points de vente et de la capacité du circuit suffisante à l’appui de tous les composants. Évitez les enchaînant plusieurs multiprises et rallonges de façon guirlande parce qu’il s’agit d’un danger électrique. Utilisation du type sorties de GFI et multiprises est fortement encouragée en raison de la présence d’eau dans le système.- Organiser les agitateurs magnétiques de profil bas sur une surface plane qui est assez fort pour supporter le poids des aquariums remplis d’eau.
- Placer des petits en bois ou en plastique blocs (qui sont légèrement plus grands que les plaques de remuer) autour du périmètre des plaques remuer pour supporter le poids des citernes à poisson.
Attention : Évitez les réservoirs à poisson directement sur les plaques de remuer comme le poids va les écraser. - Placez les réservoirs à poisson sur les plaques de remuer et soutenir les blocs et remplir les réservoirs d’eau.
- Couper un morceau d’une feuille de plastique rigide pour s’adapter sur le dessus de l’aquarium comme un couvercle. Couper des trous dans ce couvercle pour glisser les tubes d’hybridation dedans et dehors. Également un trou pour le chauffage de réservoir de poissons.
- Organiser les banques lumière fluorescentes à côté de l’aquarium pour fournir un éclairage horizontal de bioréacteurs. Branchez la banque léger dans une lumière minuterie pour programmer un cycle jour/nuit.
Figure 3. Système schématique pour les bioréacteurs de bouteille (à gauche) et la bulle colonne photobioréacteurs (à droite). Ce chiffre a été modifié par Higgins et al. 17. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
2. préparation de l’Inoculum de microalgues
- Microalgues inoculum provenir d’une culture cryoconservés, plaquée ou liquide.
Remarque : Il est recommandé que les organismes cryoconservés être plaqué avant l’utilisation comme inoculum pour s’assurer que les cellules sont viables et que la culture qui en résulte est axénique. Milieu gélosé (e.g., ATCC #5 sporulants agar)21 est un milieu riche qui fonctionne bien pour faire revivre des espèces de Chlorella et Auxenochlorella de cryo-stockage. - Préparer 2.4 L de milieu minéral qui est approprié pour les espèces de microalgues particulière.
NOTE : Exemples incluent N8 moyen23 espèces de Chlorella, N8-NH4 moyenne21 espèces de Auxenochlorella. Utilisation d’un support approprié pour la souche d’algues est une des étapes plus importantes pour assurer la croissance des algues robuste. - Aliquote 2,4 L de milieu minéral également dans trois bouteilles de verre de 1 L, ajouter remuer les barres pour chaque bouteille et assembler les couvercles ventilés (Figure 1) pour chaque bouteille. Vérifier que le tube d’aération est sur le côté de l’entrée et chaque bouteille dispose d’un bar de remuer en elle.
- Autoclave les flacons à l’aide d’une stérilisation liquide cycle (121 ° C) pour 30 min. Autoclave 100 mL d’eau désionisée (dH2O) et quelques tubes de 1,5 mL à la fois, qui sera plus tard utilisée pour le placage. Laisser le milieu refroidir jusqu’au lendemain. Vous pouvez refroidir le réacteur à la température ambiante et ensuite aérer pendant 2 h avant l’inoculation.
- Dans une armoire biosafety (BSC), ensemencer microalgues d’une plaque ou une culture axénique de liquide dans les bouteilles en stock. Technique stérile permet de maintenir les cultures axéniques dans les étapes suivantes.
- Ajouter 20 mL d’autoclave dH2O dans un tube à centrifuger stérile de 50 mL. Utilisez une boucle jetable stérile de 10 µL de choisir plusieurs colonies individuelles de la plaque à l’étape 2.1. Trempez la boucle dans le tube de 50 mL et rincer les cellules d’algues dans le 20 mL d’autoclave dH2O. secouez le tube de 50 mL pour faire une solution homogène de microalgues.
- Pipetter 6 mL de solution de microalgues dans chaque solution concentrée avec une pipette sérologique stérile de 10 mL. Agiter le flacon pour mélanger les microalgues uniformément dans le milieu.
- Utiliser une pipette sérologique stériles de 2 mL pour dessiner des échantillons de 1 mL de chaque solution concentrée et le transfert dans des tubes stériles de 1,5 mL.
Remarque : Micropipettes ne sont pas recommandés pour cette étape en raison du risque de contamination. Serrez le couvercle ventilé sur les flacons. - Placer les flacons sur plaques de remuer (~ 150 tr/min) et ajuster le débit d’air, CO2et niveaux d’éclairage en fonction de l’espèce. Tourner la position de solution concentrée de tous les jours.
- Diluer les échantillons de 1 mL obtenus au cours de l’étape 2.6 (100 fois dilution dans l’eau stérile fonctionne généralement bien) et la propagation de la plaque sur un milieu gélosé riche.
Remarque : Ces plaques peuvent être utilisés pour rechercher les cas de contamination, ainsi que servir de source d’inoculum algues futures pour plus expérimente. - Prélever des échantillons des bouteilles (dans la GCS) tous les deux jours pour vérifier la croissance des microalgues.
Placer les échantillons dans une microplaque 96 puits en triple exemplaire (200 µL) et mesurer la densité optique (Do) à 550 nm et 680 nm tous les deux jours jusqu'à OD atteint 0,2-0,3 (ce qui nécessite généralement de 5 à 7 jours). - Arrêter l’incubation et placer les flacons sur un banc pendant 24 à 48 heures permettre à des cellules d’algues à régler par gravité.
Remarque : Les cellules sédentarisés servira ensuite pour ensemencer les photobioréacteurs colonne de bulles. Si vous souhaitez un prélèvement de cellules plus rapide, les cellules peuvent être centrifugés à pas plus de 1 000 x g à prélever des cellules.
3. la culture des microalgues dans bulle colonne photobioréacteurs
- La veille de l’inoculation de bioréacteur, préparer un milieu approprié et transfert 200 mL (ou volume désiré) à la bulle colonne Photobioréacteur tubes (tubes d’hybridation). Tubes d’autoclave avec les médias et les couvercles ventilés en place.
Remarque : Si vous utilisez des eaux usées comme un milieu de croissance, autoclave vide bioréacteurs et ajouter stérile filtré des eaux usées (si la culture axénique est souhaitée). - Concentrer le stock de microalgues sédentarisés en enlevant le surnageant à l’aide d’une pompe à vide. Laissez moins de 100 mL de milieu dans chaque bouteille, mais éviter de retirer les algues sédentarisés.
NOTE : Mener cette procédure à l’intérieur d’un BSC et suivre une technique stérile. Un simple appareil sous vide peut être construit à l’aide d’une fiole à vide ou une bouteille. Monter une pipette stérile sérologique à l’extrémité de la tubulure. - Suspendre et transférer la boue d’algues à tubes à centrifuger stérile de 50 mL. Centrifuger à 1 000 x g pendant 5 min à concentrer davantage les algues.
- Dans la GCS, retirez suffisamment surnageant pour obtenir un volume total d’environ 80 mL de concentré d’algues pour 12 photobioreacters. Évitez de passer l’aspirateur sur le culot. Transférer le concentré d’algues dans un récipient stérile (ou la solution concentrée d’algues utilisées).
- Ajouter 6 mL de boue d’algues dans chaque Photobioréacteur avec une pipette sérologique stérile de 10 mL.
- Filtres stériles (filtre de seringue ou passer l’aspirateur de 0,2 mm) et ajouter une quantité appropriée de tout autres composés (par exemple les stocks de vitamine) qui ne peuvent pas être stérilisés à l’autoclave.
- Agiter pour mélanger les algues dans le milieu des bioréacteurs.
- Obtenir un échantillon de 2 mL de chaque bioréacteur à l’aide d’une pipette sérologique et transférez dans un tube de 2 mL. Prélever un échantillon de 2 mL (dans un BSC) toutes les 24 h pour surveiller la progression de la culture. Vérifiez l’échantillon pour le pH à l’aide de bandelettes de test, puis ajustez le réacteur requis avec soit 3 NaOH M ou 3 M HCl.
- Serrer les couvercles de bioréacteur et placer tous les bioréacteurs dans le bain d’eau de réservoir poisson. Régler l’aération, CO2et éclairage au niveau approprié pour les espèces. Tourner la position de bioréacteur chaque jour après le prélèvement (étape 3.8).
- Appliquer 200 µL de chaque échantillon de culture en triple exemplaire aux puits d’une microplaque 96 puits. Mesurer la densité optique (Do) à 550 nm et 680 nm.
- Le dernier jour de la période de culture, mesurer OD sous facteurs de dilution différent (par exemple, un 1 x, x 2, 4 x, 8 x, 16 x et 32 x) à établir une corrélation entre le diamètre extérieur et le poids sec après la récolte (étape 4).
- Centrifuger le tube d’échantillon de 2 mL à 12 000 x g pendant 5 min.
- Filtrer le liquide surnageant par filtre de seringue non stérile 0,2 µm et stocker le liquide surnageant (et pellet si nécessaire) sans aucun supérieure à-20 ° C pour le stockage à long terme et des analyses postérieures de changements dans la composition des médias.
4. récolter et lyophilisation de biomasse de microalgues
- Mesurer un volume fixe de la culture d’algues de chaque bioréacteur avec une éprouvette graduée (p. ex., 160 mL d’un bioréacteur qu’initialement confinée 200 mL du milieu) et transvaser dans des bouteilles de centrifugeuse. Rincer l’éprouvette graduée avec dH2O entre chaque mesure.
- Centrifuger à 4 696 x g pendant 5 min. éliminer le surnageant en passant l’aspirateur soigneusement dehors.
- Transférer les boulettes à tubes étiquetés 50 mL. Rincer les bouteilles de centrifugeuse avec dH2O et transfert de contenu aux tubes de 50 mL. S’assurer que le volume total de tube ne dépasse pas 45 mL.
- Laver les pellets algues avec dH2O pour enlever les sels.
- Centrifuger les tubes de 50 mL à 4 696 x g pendant 5 min et éliminer le surnageant.
- Ajouter 40 mL dH2O dans chaque tube de 50 mL ; vortex pour mélanger. Centrifuger à nouveau à 4 696 x g pendant 5 min et jeter le surnageant.
- Répétez l’étape 4.4.2 à nouveau.
- Étiqueter et peser des tubes à centrifuger vide 15 mL sur une balance de 4 décimales (le couvercle et le tube de l’étiquette et pesez-les ensemble). Peser un tube par la culture d’algues. Peser chaque tube de 15 mL deux fois pour minimiser l’erreur.
- Après le dernier lavage, éliminer le surnageant et ajouter 7,5 mL de dH2O dans chaque tube de 50 mL. Vortex et transfert les coulis d’algues dans le pré-pesés 15 mL tubes. Rincer les tubes de 50 mL avec supplémentaires dH2O et transférer le liquide sur les tubes de 15 mL. Éviter de dépasser 12 mL de volume total dans les tubes de 15 mL.
- Centrifuger les tubes de 15 mL à 4 696 x g pendant 5 min et éliminer le surnageant. Geler les tubes avec des boulettes à-80 ° C pendant au moins 30 min en préparation pour la lyophilisation.
- Gel sécher pendant la nuit ou jusqu'à ce que séché.
- Pesez et consignez les tubes de 15 mL lyophilisé avec des algues.
5. lipid Extraction à l’aide d’une méthode de Folch modifiée24
- Peser de 20 mg de la biomasse algale lyophilisée dans un tube en polypropylène à bouchon à vis 2 mL (étiquette de fabricant de vérification pour s’assurer que le produit est approprié pour les extractions de perle).
- Ajouter 1,5 mL de solvant Folch (chloroforme/méthanol de 2:1) dans chaque tube de 2 mL (qui contient 20 mg d’algues lyophilisées). Versez ~0.5 perles de zircone/silice mL (0,5 mm) dans chaque tube jusqu'à ce que le niveau de liquide dans le tube s’élève à 2 mL.
Attention : Gérez chloroforme / méthanol sous une hotte et éviter de respirer les vapeurs ou contact avec la peau. - Homogénéiser les échantillons d’algues dans un moulin de perle pour 20 s à une vitesse de tuyaux de transfert 6,5 m/s. à la glace pendant 30 s pour refroidir les échantillons. Répéter cinq fois plus d’extraire complètement les lipides.
- Filtrer l’homogénat au moyen d’une seringue de 5 mL contenant un disque de maille de fil d’acier inoxydable (#60 mesh) à souche sur les perles, en recueillant le filtrat dans un tube de 15 mL.
- Laver les billes avec 1,5 mL de solvant Folch, poussant le liquide à travers avec la seringue si nécessaire. Répétez ce laver deux fois plus et recueillir le filtrat tous dans le tube de 15 mL, ce qui donne un volume final d’environ 6 mL.
- Ajouter 1,2 mL de 0,9 % (p/v) solution de NaCl à l’extrait de Folch dans le tube de 15 mL et vortex pour bien mélanger.
Remarque : Si nécessaire, plus Folch solvant peut servir à laver les perles (utilisation de 0,2 x le volume total de lavage de la solution de NaCl à 0,9 % pour induire la séparation des phases). - Centrifuger les tubes de 15 mL à 6 000 x g pendant 5 min. Record le volume de phase (vert) de chloroforme inférieur à 0,1 mL près à l’aide de lignes sur le côté du tube de 15 mL. Transférer la phase inférieure un flacon en verre (avec le couvercle) à l’aide d’une pipette Pasteur en verre.
- Stocker les lipides à-20 ° C ou -80 ° C s’il est prévu d’utiliser cet extrait pour l’analyse des acides gras.
6. dosage de lipide neutre en utilisant une méthode de microplaque (adapté de Higgins et coll. 201422)
- Préparer les solutions. Préparer l’étalon de 10 mL 1 mg/mL d’huile végétale dans le chloroforme et conserver à-20 ° C.
Remarque : N’importe quelle huile végétale peut servir dans ce test parce qu’il n’est pas sensible aux types d’acides gras. 10 mL de 200 µg/mL de solution de rouge de Nil dans le diméthylsulfoxyde (DMSO) de préparer et stocker dans l’obscurité à température ambiante. - Microplaque sec de préchauffage du bloc à 55 ° C sous une hotte. Pendant que cela chauffe, diluer les extraits lipidiques et huile végétale standard 3 fois avec du méthanol.
Remarque : Cette dilution peut être modifiée en fonction de la teneur en lipides des algues, mais ce niveau fonctionne bien pour la plupart Chlorella. - Pour chaque échantillon dilué, ajouter 80 µL dans une microplaque 96 bien en polypropylène en quatre exemplaires.
Attention : Utiliser des contenants de plastique polystyrène n’est pas recommandé pour une utilisation avec des solvants organiques. - Pour le blanc de solvant, appliquer 80 µL du méthanol de 2:1 / chloroforme en quatre exemplaires. Pour les normes, ajouter 10, 30, 60, 90 et 120 µL de l’huile végétale diluée standard en quatre exemplaires.
- Placer la microplaque dans un chauffe-bloc sec à 55 ° C pendant 20-30 min jusqu'à ce que tous les solvant s’est évaporée. Alors que le solvant s’évapore, préparer le travail solution rouge Nil (nécessité 200 µL de solution de 1 µg/ml par plaque bien). À titre d’exemple, douze échantillons et un ensemble complet de normes nécessite 16 mL de 1,0 µg/mL de solution ; préparer en dissolvant 80 µL du stock 200 µg/mL (dans le DMSO) dans 16 mL dH2O.
- Retirer le bloc de chauffage de la microplaque et laisser refroidir à température ambiante. Ajouter 30 µL de l’alcool isopropylique dans chaque puits et mélanger par pipetage de haut en bas. S’assurer que tous les canaux de pipette sont la solution de mélange et resuspendant les lipides, ce qui donne un liquide vert homogène.
- Ajouter 200 µL de solution de rouge de Nil (1 µg/mL) à chaque puits, pipette montée/descente 10 fois pour mélanger. Incuber la plaque pendant 5 min à température ambiante. En attendant, préparer une solution de 50 % eau de Javel en mélangeant l’eau de Javel (hypochlorite de 6 %) avec dH2O. 20 µL / puits sont nécessaires. Préparation de 3 mL d’eau de Javel de 50 % est suffisante pour 12 échantillons et un ensemble complet de normes.
- Ajouter 20 µL de solution d’eau de Javel à chaque microplaque bien et pipeter monter et descendre 5 fois pour bien mélanger. Incuber 30 min à température ambiante.
- Après 30 min, lu fluorescence dans les échantillons toutes les 5-10 min à émission 530 nm à excitation/575 nm avec coupure automatique définie à 570 nm jusqu'à ce que le signal provenant d’échantillons d’algues se stabilise. 60 min d’incubation totale est généralement suffisante.
- Créer une courbe d’étalonnage pour les normes de l’huile végétale (de l’ordre de 0 à 40 ng/puits de pétrole).
Nota : Si placer un linéaire fonctionne bien pour basse (< 30 ng/puits) concentration de l’huile et un polynôme d’ajustement peuvent être utilisés si la norme est supérieur à 30 ng/puits. Cette corrélation permet de quantifier les lipides neutres dans les puits de l’échantillon.
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Résultats
Cette procédure donne une évolution temporelle des données de densité optique algues à OD 550 nm (Figure 4 a). La densité optique et le poids sec concentration les données peuvent être corrélés (Figure 4 b). Ceci est accompli en premier calcul de la concentration d’algues poids sec final après l’étape de lyophilisation. Ensuite, la densité optique de la dilution en série culture (effectuée le dernier jour de l’échantillonnage) et...
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Discussion
Le facteur le plus important lorsque la culture d’algues est une compréhension des besoins spécifiques de l’organisme ou groupe d’organismes. Les algues, système de culture décrite ici peut être utilisé pour un large éventail d’algues mais des facteurs abiotiques (température, médias, pH, intensité lumineuse, teneur en CO2 , taux d’aération) la culture doivent être ajustés aux besoins de l’organisme. Notez les paramètres décrits ici ont été utilisés pour la culture de la Chlorella et Auxenochlorel...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Dans cette recherche, a appuyé par USDA National Institute of Food, Agriculture Hatch projet ALA0HIGGINS et les bureaux de l’Université Auburn de la prévôté, vice-président pour la recherche et le Samuel Ginn College of Engineering. A également appuyé par la NSF accorder CBET-1438211.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Supplies pour la configuration du photobioréacteur airlift | |||
| 1 L Bouteilles en Pyrex | Corning | 16157-191 | Pour réacteurs à bouteilles, humidificateurs |
| 1/2 » collier de serrage | Home Depot | UC953A | ou équivalent |
| 1/4 » femelle luer à ardillon | Nordson biomédical Nordson | FTLL360-6005 | 1/4 » ID, PP |
| 1/4 » ID, 3/8 » OD Tube en PVC autoclavable | Thermo-Nalgene | 63013-244 | 50'1 |
| /4 » dans les joints toriques | Grainger | 1REC5 | #010 Joint torique en silicone moyennement dur, 0.239 » I.D., 0.379"O.D. |
| 1/8 » Femelle luer à barbe | Nordson biomedical | FTLL230-6005 | |
| 1/8 » ID, 1/4 » OD tube en PVC autoclavable | Thermo-Nalgene | 63013-608 | 250'1 |
| /8 » mâle filant luer à barbe | Nordson biomedical | MLRL013-6005 | |
| 1/8 » barbe multiport | Nordson biomedical | 4PLL230-6005 | 1/8 » cannelé multiport |
| 1/8 « NPT à barbelé | Nordson biomedical | 18230-6005 | 1/8 » 200 série barbée |
| 1/8 » montage sur panneau luer | Nordson biomedical | Nordson MLRLB230-6005 | 1/8 », PP |
| 10 gallon aquarium | Walmart | 802262 | Peut contenir jusqu’à 8 bioréacteurs selon la disposition |
| Débitmètre 100-1000 ccm | Dwyer | RMA-13-SSV | Pour réacteurs à bouteille |
| 2 pieds banque de lumière fluorescente | Agrobrite | FLT24 T5 | |
| Débitmètre 200-2500 ccm | Dwyer | RMA-14-SSV | Pour la régulation de l’air en amont de l’humidificateur |
| 250 mL Bouteilles en pyrex | Corning | 16157-136 | Pour le mélange de gaz après humidificateur |
| Débitmètre 50-500 ccm | Dwyer | RMA-12-SSV | Pour réacteurs à tubes d’hybridation |
| Débitmètre 5-50 ccm | Dwyer | RMA-151-SSV | Pour le contrôle du débit de CO2 |
| Filtres à air 0,2 & micro ; m | Whatman/ Fisher | 09-745-1A | Polyvent, 28 mm, 0,2 & micro ; m, PTFE, paquet de 50 |
| Clapets anti-retour | VWR | 89094-714 | |
| Couvercles Corning pour bouteilles en pyrex | VWR | 89000-233 | 10 couvercles GL45 |
| Embout Luer femelle | Nordson biomédical | Nordson FTLLP-6005 | PP stable femelle |
| Tubes d’hybridation | Corning | 32645-030 | 35x300 mm, paquet de 2 |
| Minuterie légère | Walmart | 556393626 | |
| Contre-écrous | Nordson biomedical | Nordson LNS-3 | 1/4", nylon rouge |
| Agitateur magnétique à profil bas | VWR | 10153-690 | Agitateur magnétique à profil bas |
| Embout Luer mâle | Nordson biomedical | Nordson LP4-6005 | Mâle Plug PP |
| Bague de verrouillage Luer tournante | Nordson biomedical | Nordson FSLLR-6005 | |
| Barres d’agitation - VWR longues | 58949-040 | 38,1 mm, pour réacteurs à bouteilles | |
| Barres d’agitation - moyennes | VWR | 58949-034 | 25 mm, pour tubes d’hyridisation |
| Fournitures et réactifs pour l’élevage d’algues | |||
| 0.2 & micro ; Filtres m | VWR | 28145-491 | 13 mm, PTFE, pour filtrer les milieux épuisés des prélèvements quotidiens en |
| cultures Seringues de 1 mL | Air-tite | 89215-216 | Pour filtrer les milieux en culture quotidienne |
| Tubes de 1,5 mL | VWR | 87003-294 | Stériles (ou équivalent) |
| 10 mL Pipettes sérologiques | Greiner Bio-One | 82050-482 | Stériles (ou équivalent) |
| 100 mm plaques | VWR | 25384-342 | Boîtes de Pétri empilables 100x15 mm, stériles |
| Tubes de 15 mL | Greiner Bio-One | 82050-276 | Stérile (ou équivalent), polypropylène |
| 2 mL Pointes sérologiques de pipette | Greiner Bio-One | 82051-584 | Stérile (ou équivalent) |
| Tubes de 2 mL | VWR | 87003-298 | Stérile (ou équivalent) |
| Tubes de 50 mL | Greiner Bio-One | 82050-348 | Stérile (ou équivalent), polypropylène |
| Microplaque à 96 puits | Greiner Bio-One | 89089-578 | Polystyrène avec couvercle, fond plat |
| Boucles d’inocculation | VWR | 80094-478 | Stérile (ou équivalent) |
| Réservoir et régulateur de dioxyde de carbone liquide | Airgas | CD-50 | |
| Fournitures et réactifs pour l’extraction des lipides et le dosage des lipides neutres | |||
| 2 mL | VWR | 10158-556 | Tube en polypropylène avec couvercle |
| Microplaques à 96 puits | Greiner Bio-One | 82050-774 | Polypropylène, fond plat |
| Eau de Javel | Walmart | 550646751 N’utilisez | que de l’eau de Javel ordinaire, pas d’eau de Javel |
| nettoyante Chloroforme | BDH | BDH1109-4LG | |
| Diméthyl sulfoxyde | BDH | BDH1115-1LP | |
| Alcool isopropylique | BDH | BDH1133-1LP | |
| Méthanol | BDH | BDH20864.400 | |
| Rouge du Nil | VWR | TCN0659-5G | |
| Pointes de pipette Pasteur | VWR | 14673-010 | |
| Chlorure de sodium | BDH | BDH9286-500G | |
| Huile végétale | Walmart | 9276383 | Toute huile végétale doit fonctionner tant qu’elle est fraîche |
| Billes de zircone/silice (0,5 mm de diamètre) | Produits Biospec | 11079105z | |
| Equipment | |||
| Balance analytique | Mettler-Toledo | XS205DU | Capable d’une précision d’au moins 4 décimales |
| Homogénéisateur de billes | Omni | 19-040E | |
| Microcentrifugeuse de paillasse | Thermo | Heraeus Fresco 21 avec 24x2 | Avec rotor capable de manipuler des tubes de 1,5 et 2 mL |
| Chauffe-bloc sec | VWR | 75838-282 | Y compris bloc sec pour |
| microplaque Lyophilisateur | Labconco | 7670520 | 2,5L Système de lyophilisation |
| Grande centrifugeuse de paillasse | Thermo | Heraeus Megafuge 16R Tissue | Y compris les rotors capables de traiter des bouteilles de 400 ml, des tubes de 50 ml et des tubes de 15 ml |
| Lecteur de microplaques | Dispositifs moléculaires | SpectraMax M2 | Capable de lire l’absorbance et la fluorescence |
| Mélangeur vortex | VWR | 10153-838 |
Références
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