Induction et notation de la maladie de graft-Versus-Host dans un modèle xénogéné de murine et quantification des cellules t humaines dans des tissus de souris utilisant PCR numérique

La greffe de cellules souches hématopoïétiques allogéniques (HSCT) est devenue un traitement de routine pour les patients souffrant de malignités hématologiques telles que la leucémie avec un pronostic médiocre. Une complication significative de HSCT est la maladie aigue de greffe-contre-hôte (GVHD). Une étude de 2012 a rapporté que le GVHD aigu s'est développé dans 39% de patients deHSCT recevant des greffes des donateurs de frère et 59% de patients recevant des greffes des donateurs non apparentés 1. Le GVHD aigu se produit quand les lymphocytes T d'origine donneuse attaquent les organes du receveur. La seule thérapie réussie pour GVHD estle traitement avec les drogues fortement immunosuppressives 2, qui sont fortement toxiques et augmentent le risque d'infection et de répétition de tumeur. Ainsi, en dépit des améliorations qui ont été apportées dans la survie aigue de GVHD ces dernières années^3,4,5, il y a toujours un besoin critique pour des thérapies améliorées de GVHD avec la toxicité minimale qui favorisent la remise à long terme.

L'objectif global des méthodes suivantes est d'induire et de marquer le GVHD xénogénique (xenoGVHD). Le modèle xenoGVHD a été développé comme un outil pour induire le GVHD aigu avec des cellules humaines plutôt que des cellules murines permettant une traduction plus directe de la recherche préclinique GVHD aux essais cliniques⁶. Ce modèle consiste à injecter par voie intraveineuse des cellules mononucléaires sanguines périphériques humaines (PBMC) dans des souris NOD-SCID IL-2Rnull (NSG) qui sont irradiées sublethalment. Les lymphocytes T humains injectés sont activés par les cellules de présentation d'antigènes humains (APC) présentant l'antigène murine et les lymphocytes T activés migrent vers les tissus éloignés ayant pour résultat l'inflammation systémique et finalement la mort^{6,7, 8 Annonces , 9} (en) ^{, 10}. Pathologie et progression de la maladie dans le modèle de xénoGVHD imitent étroitement le GVHD aigu humain. Plus précisément, les lymphocytes T humains pathogènes sont réactifs aux protéines du complexe d'histocompatibilité majeur murine (MHC), qui est similaire à l'alloréactivité des lymphocytes T dans l'homme GVHD^6,9. Le principal avantage du modèle xenoGVHD sur le modèle de souris MHC-inmatch, l'autre modèle GVHD largement utilisé, est qu'il permet de tester des thérapies sur les cellules humaines plutôt que les cellules murines. Cela permet de tester des produits qui peuvent être directement traduits à la clinique sans aucune modification, car ils sont faits pour cibler les cellules humaines. Récemment, ce modèle a été utilisé pour tester un anticorps humain anti-IL-2¹¹, les cellules T de régulation thymique humaine (Tregs)¹² et les cellules souches mésenchymales humaines¹³ comme traitements potentiels pour le GVHD aigu. Dans un contexte plus large, ce modèle peut être utilisé comme un test de suppression in vivo pour tout médicament ou type de cellule qui peut supprimer l'activité des lymphocytes T humains. Par exemple, Stockis et coll.¹⁴ ont utilisé le modèle xenoGVHD pour étudier l'effet du blocage de l'intégrine v'8 sur l'activité suppressive de Treg in vivo. Ainsi, le modèle xenoGVHD peut fournir un aperçu du mécanisme de toute thérapie ciblant les lymphocytes T dans un cadre in vivo.

Une méthode supplémentaire décrite dans ce protocole est la façon de détecter les lymphocytes T humains dans les tissus de souris à l'aide de la réaction numérique en chaîne de polymérase (dPCR). L'objectif de cette méthode est d'offrir un outil pour quantifier la migration et la prolifération des lymphocytes T dans les tissus cibles, qui mesurent l'efficacité des thérapies immunosuppressives testées dans ce modèle. dPCR est une méthode relativement nouvelle pour la quantification des acides nucléiques¹⁵. En bref, le mélange de réaction PCR est divisé en partitions qui contiennent de petits nombres de la séquence cible ou pas de cible du tout. La séquence cible est ensuite amplifiée et détectée à l'aide de colorants intercalés d'ADN ou de sondes fluorescentes spécifiques à la cible. dPCR quantifie le nombre de copies de séquence cible en fonction de la fraction des partitions positives et des statistiques de Poisson^15,16. La détection des lymphocytes T avec dPCR nécessite beaucoup moins de tissu par rapport à d'autres méthodes alternatives, y compris la cytométrie du débit et l'histologie, et peut être effectuée sur des tissus congelés ou fixes. dPCR n'a pas besoin d'une courbe standard pour déterminer les numéros de copie, et les répliques techniques ne sont pas requises. Cela réduit la quantité d'ADN réactif et modèle nécessaire pour dPCR par rapport à pcR quantitatif traditionnel (qPCR)¹⁶. La partition de la réaction pcR en sous-réactions dans dPCR concentre efficacement les cibles¹⁷. Ainsi, dPCR est principalement un outil pour la détection de cibles rares dans une grande quantité d'ADN non-cible. Par exemple, dPCR est utilisé pour détecter la contamination bactérienne dans le lait¹⁸, identifier les mutations rares dans le gène récepteur d'oestrogène¹⁹, et de détecter l'ADN tumoral circulant dans le sang des patients²⁰. Dans ce protocole, dPCR sert d'outil efficace pour détecter et quantifier les lymphocytes T humains dans les tissus des souris atteintes de xénoGVHD.

Toutes les expériences de souris ont été effectuées dans la conformité, et avec l'approbation de l'Université du Kansas Medical Center Institutional Animal Care and Use Committee. Tous les échantillons de sang humain en bonne santé ont été obtenus avec le consentement éclairé et avec l'approbation de la Commission d'examen institutionnel du Centre médical de l'Université du Kansas.

1. Irradiation des souris NSG

1. Un jour avant l'injection de PBMC, irradier les souris NSG de 8 à 12 semaines (l'un ou l'autre sexe peut être utilisé). Dans une armoire de biosécurité stérile, placez les souris dans une cage à tarte stérilisée ou un microisolateur. Irradier les souris dans une source Cs¹³⁷ ou un irradiateur de petits animaux (p. ex. RS 2000) avec une dose totale de 150 cGy avec rotation lente pour assurer même l'irradiation.
2. Placer les souris dans des cages propres dans une armoire de biosécurité stérile.

2. Préparation de l'homme PBMC pour l'injection

1. Recueillir suffisamment de sang humain sain pour isoler 1,1 x 10⁷ PBMC par souris. Diluer le sang héparinisé dans un volume égal de 2% de sérum bovin fœtal (FBS) dans le phosphate tamponné salin (PBS).
   REMARQUE : Avec ce protocole, le rendement de PMBC est généralement de 0,5 à 1 x 10⁷ par 10 ml de sang entier. Chaque souris recevra 10⁷ PBMC dans 100 L de PBS. Le supplément de 1 x 10⁶ sur 10 L par souris garantit que chaque souris reçoit la dose complète de PBMC, s'il y a des problèmes avec les seringues de remplissage.
2. Ajouter 15 ml de densité de séparation des lymphocytes par le milieu (p. ex. Ficoll) à un tube conique de 50 ml, puis reconss soigneusement jusqu'à 25 ml de sang dilué au-dessus du gradient de densité. Centrifuger le tube contenant un gradient de densité et du sang dilué à 400 x g pendant 40 min à température ambiante sans frein.
3. Récoltez l'interface PBMC en 10 ml de PBS dans un tube conique de 50 ml. Centrifuger les cellules à 400 x g pendant 10 min. Retirez le supernatant.
4. Loosen granule en faisant glisser le tube et resuspendre dans 10 mL PBS pour laver le PBMC. Centrifuger les cellules à 400 x g pendant 5 min.
5. (Facultatif) Jetez le supernatant et lysez les globules rouges (RBC) dans la pastille cellulaire en ajoutant un volume de tampon de lyse Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) qui est égal au volume de granulés. Resuspendre doucement la pastille et faire tourbillonner le tube pendant 30 à 60 s. Remplissez le tube avec un support RPMI sans sérum et centrifugeuse le tube à 400 x g pendant 5 min.
6. Retirez le supernatant et suspendez à nouveau le granule cellulaire en 5 ml de PBS. Comptez les cellules à l'aide de l'exclusion trypan bleu avec un hémocytomètre et un microscope.
7. Centrifuger les cellules à 400 x g pendant 5 min. Enlevez le supernatant et resuspendles les cellules à 1 x 10⁸ cellules/mL en PBS.

3. Injection rétro-orbitale de PBMC humain chez des souris²¹

1. Placez une chambre d'anesthésie dans une hotte à débit laminaire pour maintenir la stérilité. Pré-chargez la chambre d'anesthésie avec 5% d'isoflurane et 1 L/min de débit d'oxygène pendant 5 min.
2. Réduire l'isoflurane à 2% et mettre les souris de la même cage dans la chambre d'anesthésie. Une fois que les souris perdent le droit, anesthésiez les souris pendant 5 min dans la chambre. Pendant ce temps, pré-remplir la seringue avec 100 l (1 x 10⁷ cellules) de suspension cellulaire.
3. Placer la souris sur un coussin chauffant avec son nez dans un cône nasal pour maintenir l'anesthésie. Vérifiez la perte de conscience en pinçant un coussinet et en vérifiant le manque de réflexe.
4. Retenir la souris avec le pouce et le majeur. Insérer le 28 G 1/2 dans l'aiguille avec le léfon vers le bas latérale ment au canthus médial, à travers la membrane conjonctive jusqu'à ce que l'arrière de l'œil est atteint. Retirez légèrement l'aiguille et injectez lentement 100 l de cellules (1 x 10⁷ cellules).
5. Retirez complètement l'aiguille et jetez-la correctement de la seringue et de l'aiguille. Fermez la paupière et appliquez une légère pression sur le site d'injection à l'effile de gaze.
6. Examiner le site d'injection pour déceler un gonflement ou un autre traumatisme visible. Laissez la souris reprendre conscience dans une cage stérile bordée de serviettes en papier pour empêcher l'aspiration de la literie avant de se déplacer à la cage à la maison. Après que n'importe quel saignement ait cessé, appliquez une seule goutte de proparacaïne à l'oeil pour l'analgésie.
   REMARQUE : L'injection de veine de queue est une méthode alternative d'injection intraveineuse de PBMC pour ce protocole tel que décrit par Macholz et autres^22.

4. Notation clinique du GVHD aigu chez les souris (figure 1)²³

1. Mesurer le score GVHD tous les deux jours jusqu'à ce que les souris atteignent un score d'un 2, puis tous les jours jusqu'au jour du sacrifice.
   1. Placez la cage dans une hotte à écoulement laminaire, retirez la nourriture et l'eau et remettez le couvercle. Score activité en observant les souris pendant 5 min et d'attribuer des scores comme suit: 0 - souris commence à marcher dans quelques minutes et continue à marcher autour de la cage, 1 souris prend plus de quelques minutes pour se lever et se promène lentement autour de la cage, 2 souris ne se lève pas dans 5 min et ne marche que lorsqu'on le touche.
2. Peser chaque souris dans un bécher en verre et donner un score de perte de poids: 0 'lt;10% de changement, 1 '10'25% de changement et 2 '25% de changement.
3. Pendant que la souris est encore dans le bécher, inspectez la posture: 0 , normal, 1 poching au repos, 2 ' se chingching altère le mouvement ; texturede la fourrure : 0 , normal, 1 à ébouriffer léger à modéré, 2 à ébouriffage sévère et intégrité de la peau : 0 , normal, 1 ' mise à l'échelle des pattes/queue, 2 - zones évidentes de peau dénudée (regardez les oreilles, la queue et les pattes pour la mise à l'échelle).
4. Avec cinq catégories et un score de 0 à 2 pour chaque catégorie, une souris peut atteindre un score maximum de 10. Lorsqu'une souris atteint un score de 7 ou plus ou atteint 42 jours après l'injection, euthanasiez la souris par l'euthanasie co₂ ou toute autre méthode approuvée par le Comité local de soins et d'utilisation des animaux en établissement.
   REMARQUE : Pour assurer l'exactitude des résultats, la notation est effectuée par un chercheur qui est aveuglé par les groupes de traitement²⁴. En outre, bien que la perte de poids corporel soit le critère d'évaluation humain recommandé pour de nombreux protocoles de l'IACUC, avec une justification supplémentaire, l'approbation de ce protocole par l'IACUC peut être obtenue.

5. Récolte de tissus pour l'ADN génomique de souris euthanasiées et isolage de l'ADN génomique

1. Disséquer les souris à l'aide d'outils chirurgicaux stériles. Couper un petit morceau de tissu d'environ 3 mm x 0,5 mm de taille à partir d'un organe d'intérêt, par exemple, poumon, foie ou rate. Peser l'échantillon de tissu et placer le morceau de tissu dans un tube stérile de 1,5 ml. Si vous collectez plusieurs tissus, lavez les outils à l'éthanol entre la coupe de chaque organe.
2. Congeler les tissus en submergeant les tubes contenant le tissu dans l'azote liquide jusqu'à ce qu'il cesse de bouillonner et stocker dans -80 oC pendant la nuit. Décongelez les échantillons de tissus et lysez-les selon une trousse d'isolement de l'ADN génomique (gDNA).
3. Isoler l'ADN génomique selon les instructions du fabricant telles que décrites dans le kit. Assurez-vous de noter la quantité de tissu qui a été traitée par microlitre d'ADNc eluted (mg/L).
   REMARQUE : Les tissus congelés peuvent être entreposés à -80 oC pour le traitement à une date ultérieure.

6. Quantification des lymphocytes T humains à l'aide de PCR numérique (Figure 2)

1. Préparer les réactions PCR numériques selon le protocole pour les colorants de liaison d'ADN pour la machine PCR numérique utilisée. Utilisez les amorces suivantes spécifiques pour l'ADN génomique cD3 epsilon humain (Séquence de référence NCBI : NG-007383.1); Primer avant: AGGCTGCCTTAACTCCCAAG, Reverse Primer: GCCCTACCAGCTGTGGAAAAC. Ces amorces donneront une seule bande de 105 bp.
   REMARQUE : Ajoutez 0,5 L d'une enzyme de restriction, comme HindIII, à chaque réaction pour digérer l'ADN génomique. Assurez-vous de tester différentes dilutions d'ADNc pour optimiser la séparation des gouttelettes positives et négatives. En outre, un sous-ensemble de lymphocytes T infiltrants peut être des lymphocytes T régulateurs non pathogènes. Ces cellules peuvent être quantifiées à l'aide d'amorces supplémentaires pour les marqueurs de cellules T réglementaires.
2. Effectuer la réaction PCR numérique dans les conditions suivantes : Couvercle à 105 oC, 95 oC pendant 10 min (1 cycle); 95 oC pour 30 s, rampe 2 oC/s et 55 oC pour 1 min, rampe de 2 oC/s (40 cycles); 72 oC pendant 10 min, 12 oC de cale.
   REMARQUE : Ces paramètres peuvent devoir être ajustés en fonction de l'équipement PCR numérique.
3. Acquérir des données PCR numériques avec un logiciel d'analyse. Signaler les données sous forme de nombre de copies par mg de tissu à l'aide de l'équation suivante : (nombre de copies/L) x (L de gDNA en réaction) x (facteur de dilution)/(mg de tissu/L de gDNA total)

Des souris NSG de 8 à 12 semaines de 8 à 12 semaines qui ont reçu du PBMC humain ont commencé à montrer des signes cliniques de GVHD vers le jour 10 après injection par rapport aux souris témoins négatives qui n'ont reçu que du PBS (Figure 1A). Les souris XenoGVHD avaient une survie médiane de 23,5 jours (figure1B). Avec PCR numérique, Les lymphocytes T humains positifs d'epsilon de CD3 pourraient être détectés dans les échantillons de poumon et de foie des souris qui ont reçu le PBMC humain. Des échantillons de tissus provenant de souris injectées avec du PBS ont été utilisés comme témoins (figure 2).

Figure 1 : Progression de la maladie de GVHD. Des souris mâles et femelles de NSG de 8-12 semaines sublétalement irradiées ont été rétro-orbitalement injectées avec 1 x 107 PBMC humain (n - 6) ou PBS (n - 4) comme un contrôle négatif. Les données présentées sont les résultats combinés de trois expériences indépendantes. (A) LE score de GVHD a été mesuré tous les deux jours jusqu'à ce que les souris atteignent un score de 2, puis tous les jours jusqu'au jour du sacrifice. Les données rapportées à chaque moment pour le score de GVHD est le score moyen de SEM des souris vivantes combiné avec les derniers scores de toutes les souris décédées dans chaque groupe. p 'lt; 0.05 tel que déterminé par le test Mann Whitney U. (B) Courbe kaplan-Meier de survie. La mort a été marquée lorsque le score de GVHD était de 7. p 'lt; 0.05 tel que déterminé par l'essai de log-rank. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2 : Détection des lymphocytes T humains à l'aide d'un PCR numérique. Des échantillons de poumon et de foie ont été prélevés sur des souris qui ont été injectées rétro-orbitalement avec pbS (n - 3) ou 1 x 107 PBMC humain (n - 3) lorsque les souris ont atteint un score GVHD de 7 ou 42 jours après injection. Les données ont été recueillies à partir de 3 expériences indépendantes. GDNA a été isolé et PCR numérique a été employé pour déterminer les copies de l'epsilon humain de CD3 par milligramme de tissu. (A) Parcelle pcR numérique représentative d'échantillons de poumon et de foie d'une souris injectée avec PBS ou PBMC. (B) Quantification des copies de l'epsilon CD3 humain par meugramme de tissu provenant de souris injectées avec PBS ou PBMC. p 0,05 selon le test Mann Whitney U. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Aucun conflit d'intérêts n'a été déclaré.