Article de méthode

Préparation des tissus et immunostaining des tissus craniofacial de souris et de l'os non décalcifié

DOI :

10.3791/59113

⸱

10 mai 2019

 ,  , 
1The State Key Laboratory Breeding Base of Basic Science of Stomatology (Hubei-MOST) & Key Laboratory for Oral Biomedicine of Ministry of Education, School and Hospital of Stomatology, Wuhan University, 2Department of Biologic and Materials Sciences, School of Dentistry, University of Michigan

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ici, nous présentons un protocole détaillé pour détecter et quantifier des niveaux de protéine pendant la morphogénèse/pathogénie craniofacial par immunostaining utilisant des tissus craniofacial de souris comme exemples. En outre, nous décrivons une méthode pour la préparation et la cryosectioning des tissus durs non décalcifiés des jeunes souris pour immunostaining.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'immunostaining tissulaire fournit la détection très spécifique et fiable des protéines d'intérêt dans un tissu donné. Ici nous décrivons un protocole complet et simple pour détecter l'expression de protéine pendant la morphogenèse/pathogénie craniofacial utilisant des tissus craniofacial de souris comme exemples. Le protocole consiste en la préparation et la cryosection des tissus, l'immunofluorescence indirecte, l'acquisition d'images et la quantification. En outre, une méthode pour la préparation et la cryosectioning des tissus durs non décalcifiés pour immunostaining est décrite, utilisant des tissus craniofacial et des os longs comme exemples. Ces méthodes sont essentielles pour déterminer l'expression des protéines et les changements morphologiques/anatomiques dans divers tissus pendant la morphogénèse craniofaciale/pathogénie. Ils sont également applicables à d'autres tissus avec des modifications appropriées. La connaissance de l'histologie et la haute qualité des sections sont essentielles pour tirer des conclusions scientifiques à partir des résultats expérimentaux. Les limites potentielles de cette méthodologie comprennent, sans s'y limiter, la spécificité des anticorps et les difficultés de quantification, qui sont également discutées ici.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le visage est un élément clé de l'identité humaine, et est composé de plusieurs types de tissus, tels que l'épithélium, muscle, os, cartilage, dent. Ces tissus sont dérivés des trois couches germinales: ectoderm, endoderm, et mesoderm1,2. Pour le bon modelage et le développement des tissus craniofacial, la prolifération cellulaire, la mort et la différenciation doivent être fortement coordonnées et réglées par des voies de signalisation spécifiques, telles que Wnt, Fgf, Hh et Bmp voies3,4 ,5. Les défauts dans la prolifération, la survie ou la différenciation des cellules mèneront aux malformations craniofacial, qui sont parmi les défauts congénitaux les plus fréquents de naissance. Les souris transgéniques sont des outils utiles pour étudier les mécanismes de la morphogénèse craniofaciale et de la pathogénie1,2,3,4,5. Comprendre les changements dans les structures craniofaciales au cours du développement et de la pathogénie aidera à clarifier les principes clés du développement ainsi que les mécanismes des malformations craniofaciales1,2,3 ,4,5.

La coloration de monture entière ou de tissus sectionnés avec des anticorps spécifiques est une technique inestimable pour déterminer la distribution spatiale des protéines d'intérêt 6. Formellement, l'immunostaining de tissu peut compter sur l'immunohistochimie (IHC) ou l'immunofluorescence (IF). Par rapport au produit de réaction opaque produit avec un substrat chromogénique tel que 3,3'-Diaminobenzidine (DAB) par IHC, IF implique l'utilisation de conjugués fluorescents visibles par microscopie fluorescence. Par conséquent, IF peut clairement différencier les cellules positives du bruit de fond, et permet aux images d'être quantitativement analysées et améliorées d'une manière simple par des logiciels tels que ImageJ et Adobe Photoshop7,8. L'approche de coloration de montage entier fonctionne sur de petits blocs de tissu (moins de 5 mm d'épaisseur), qui peuvent fournir des informations tridimensionnelles sur l'emplacement des protéines/antigènes sans avoir besoin de reconstruction des sections9,10 . Cependant, par rapport aux sections de tissu, l'immunostaining de montage entier prend le temps et exige de grands volumes de solutions d'anticorps. Tous les anticorps ne sont pas compatibles avec l'approche de base de la monture entière. En outre, la pénétration incomplète des anticorps entraînera une coloration inégale ou une fausse coloration négative. Ici, nous nous concentrerons sur la détection d'immunofluorescence des protéines/antigènes sur les tissus sectionnés. Pour les tissus durs (par exemple, tête, dent, os long), le dépôt de calcium pendant le développement/pathogénie rend l'échantillon difficile à sectionner et facilement rincé pendant le traitement immunostaining11,12. La plupart des protocoles actuellement disponibles décalciment les tissus durs avant l'intégration pour faciliter la section, ce qui prend du temps et peut détruire la morphologie et les antigènes des échantillons s'ils sont manipulés de façon inappropriée11,12. Pour surmonter les problèmes, nous avons optimisé une approche pour la cryosection des tissus durs sans décalcification, conduisant à une meilleure visualisation de leur morphologie et la distribution des protéines de signalisation.

Le protocole décrit ici est utilisé pour déterminer les changements morphométriques et histologiques dans les tissus craniofacial des souris transgéniques BMP. Plus précisément, le protocole comprend (1) la récolte et la disséquement des tissus crâniens, (2) la section et l'immunostaining des marqueurs expérimentaux (Ki67, pSmad1/5/9) ainsi que la coloration TUNEL, (3) l'imagerie des sections à l'aide du microscope à fluorescence, et enfin (4) l'analyse et la quantification des résultats. Le protocole pour préparer et cryosection tissus durs sans décalcification est également décrit13. Ces méthodes sont optimisées pour les tissus craniofacial. Ils sont également applicables à d'autres tissus de différents âges d'échantillons avec des modifications appropriées.

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Protocole

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Toutes les expériences sur la souris ont été menées conformément aux lignes directrices de l'Université du Michigan concernant les soins et l'utilisation des animaux dans la recherche. Toutes les procédures animales utilisées dans cette étude ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (IACUC) de l'Université du Michigan (Protocole #PRO00007715).

1. Préparation des tissus

  1. Préparation des tissus embryonnaires
    1. Préparer un plat de 10 cm et plusieurs plats de 3,5 cm contenant de la saline tamponnée en phosphate (PBS), et une plaque de culture de 12 puits contenant 2 mL 4 % de paraformaldéhyde (PFA) en PBS dans chaque puits pour chaque souris enceinte. Déposer tous les plats Petri et l'assiette sur la glace.
      REMARQUE: Manipulez 4% de PFA dans une hotte de fumée.
    2. Disséquer les embryons de souris enceintes dans le PBS glacé avec des forceps et des ciseaux comme décrit précédemment14.
      1. En bref, euthanasier une souris enceinte avec CO2, saisir la peau sous le centre du ventre avec des forceps et couper à travers la peau seulement, puis tirez doucement sur la peau pour la séparer de la paroi musculaire abdominale sous-jacente.
      2. Ensuite, couper dans la cavité abdominale en suivant la même ligne de l'incision de la peau. Enlever l'utérus contenant une chaîne d'embryons et enlever les embryons en coupant doucement la paroi utérine. Les tissus extraembryonnaires tels que le sac jaune et l'amnion seront enlevés.
      3. Couper et isoler la tête de chaque embryon.
    3. Transférer chaque tête dans chaque puits d'une plaque de 12 puits contenant 4% de PFA avec une pipette de transfert en plastique ou des forceps. Fixer les échantillons dans 4 % de PFA à 4 oC pendant 4 h. Rincer les échantillons en PBS à 4 oC avec une secousse douce pendant 12 h.
      REMARQUE: Pour les embryons de moins de 16,5 (E16.5) embryonnaires, fixez les têtes d'embryon avec 4 % de PFA directement après l'isolement. Pour les embryons à E16.5 ou plus tard, retirer pour jeter la peau et le tissu adipeux des têtes et rincer plusieurs fois dans le PBS froid de glace avant la fixation.
    4. Cryoprotect têtes.
      1. Transférer chaque tête dans une nouvelle plaque de 12 puits contenant 2 ml de 30 % de saccharose en PBS à l'aide d'une pipette ou de forceps de transfert en plastique. Agiter doucement à 4 oC jusqu'à ce que la tête s'enfonce au fond du plat.
    5. Enclenché des têtes.
      1. Transférer la tête cryoprotégée dans un moule contenant un composé optimal de température de coupe (OCT). Equilibrate échantillons en OCT pendant plusieurs minutes. Ajuster l'emplacement et la direction des échantillons avec des forceps.
      2. Placer le moule sur de la glace sèche pour congeler. Conserver les cryomolds qui en résultent dans un sac en plastique à -80 oC jusqu'à ce qu'ils soient prêts à être cryosectionné.
        REMARQUE: Le côté taillé des échantillons doit faire face au fond du moule d'encastrement.
  2. Préparation des tissus durs non décalcifiés postnatals
    1. Euthanasier à 3 semaines ou 3 mois souris avec CO2. Enlever la peau et les tissus adipeux. Couper et isoler la tête ou les os longs de la souris.
    2. Fixer et cryoprotéger la tête ou le long os des souris tel que décrit dans les étapes 1.1.3-1.1.4.
    3. Encastré dans 8% de gélatine de la même manière que l'étape 1.1.5. Conserver les cryomolds dans un sac en plastique à -80 oC jusqu'à ce que la cryosection soit cryosection.
      REMARQUE: La décalcification n'est pas nécessaire ici. Pour préparer 8 % de gélatine, mélanger 8 g de gélatine avec 100 ml de PBS et faire bouillir à l'aide d'un micro-ondes. Sachez que le mélange bout facilement.

2. Cryosectioning

  1. Fixer la température du cryostat à -18 oC pour les tissus mous incorporés dans l'OCT ou à -25 oC et plus bas pour les tissus durs non décalcifiés incorporés dans la gélatine. Conserver les échantillons dans la chambre cryostat pendant environ 30 min pour l'équilibre à la température du cryostat.
  2. Expulser le bloc du cryomold. Congelez le bloc sur le mandrin de spécimen (porte de tissu) par le montage avec une baisse d'OCT. Gardez le côté paré de l'échantillon le plus éloigné du mandrin (face à l'opérateur).
  3. Chargez le mandrin monté sur le support de l'objet cryostat. Ajustez le support de la lame pour que l'angle de la lame soit de 3 à 5 degrés par rapport à l'échantillon.
  4. Recueillir des sections de 10 m sur des lames de microscope enduites. Sécher complètement les sections à RT, puis les stocker à -80 oC.

3. Staining histologique et imagerie microscopique

  1. Coloration d'immunofluorescence
    1. Sortez les toboggans à partir de -80 oC. Gardez les diapositives à RT pendant 1 h pour les sections de dry. Rincer les diapositives dans 0,1 % de PBST (0,1 % D'éthylène glycol tert-octylyl dans PBS; voir Table of Materials) trois fois pendant 5 min chacun pour laver les sections OCT et perméabilize.
    2. Optionnellement, effectuer la récupération d'antigène (facultatif).
      1. Préchauffer le tampon de citrate (10 mM de citrate de sodium pH 6) dans le plat de coloration avec vapeur ou bain d'eau à 95 à 100 oC. Immerger les glissières dans le tampon de citrate, couver pendant 10 min.
      2. Sortez le plat de coloration du vapeur ou du bain d'eau pour RT. Refroidir les toboggans à RT pendant 20 min ouplus 15.
        REMARQUE: Comme alternatives, utilisez le tampon Tris-EDTA (base Tris 10 mM, 1mM EDTA, 0,05% Tween 20, pH 9.0) ou edTA buffer (1 mM EDTA, 0.05% Tween 20, pH 8.0) pour la récupération d'antigène induite par la chaleur. Utilisez un autocuiseur, un four à micro-ondes ou un bain d'eau pour la récupération d'antigènes induits par la chaleur, en plus du vapeur chaud. Une récupération d'antigène induite par l'enzyme à l'aide de trypsine ou de pepsine est une autre alternative. Optimiser la concentration et le temps de traitement de la récupération enzymatique pour éviter les sections dommageables. Optimisez la méthode de récupération d'antigène pour chaque combinaison anticorps/antigène.
    3. Incuber chaque diapositive avec 200 l de solution de blocage (5% de sérum d'âne dilué en 0,1% DepBST) à RT pendant 30 min, puis retirer la solution de blocage sans rincer.
    4. Incuber chaque diapositive avec 100 oL d'anticorps primaires ou d'anticorps dilués dans la solution de blocage pendant 1 h à RT ou O/N à 4 oC. Rincer les diapositives avec PBS trois fois pendant 10 min chacune à RT.
    5. Incuber chaque diapositive avec 100 l d'anticorps secondaires dilués dans la solution de blocage pendant 1 h à RT. Rinse glisse en PBS trois fois pendant 10 min chacun à RT. Protégez les diapositives de la lumière.
    6. Monts coulis.
      1. Ajouter deux gouttes de milieu anti-fade avec DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) sur la diapositive. Ensuite, couvrez-le d'un bordereau.
      2. Conserver à 4 oC dans l'obscurité jusqu'à ce qu'il soit prêt à l'image.
        REMARQUE: Comme alternative, étiquetez les noyaux avec DAPI ou Hoechst 33324 colorant dilué 1:2,000 dans PBS à RT d'abord, puis monter avec du glycérol.
  2. Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling (TUNEL) coloration.
    REMARQUE: L'ADN à double brin avec 3'-hydroxyl termini (3'OH DNA termini) se formera pendant l'apoptose dans la cellule. Ici, nous fournissons un protocole qui étiquete le termini d'ADN 3'OH gratuit in situ via l'étiquetage des fragments d'ADN avec la digoxinine-nucléotide en utilisant terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) par coloration spécifique à l'aide d'un kit commercial (voir Tableau des matériaux ).
    1. Optionnellement, les sections de tache avec les anticorps secondaires primaires et Alexa Fluor-488 étiquetés avant la coloration de TUNEL. Rincer les diapositives en PBS trois fois pendant 10 min chacune.
      REMARQUE: Cette étape est facultative pour une double coloration d'une protéine et TUNEL dans la même diapositive.
    2. Incuber chaque diapositive avec 100 L Proteinase K (10 g/mL en 10 mM Tris pH 7,5 et 5 mM EDTA) pendant 5 min à RT. Rinse glisse avec PBS trois fois pendant 10 min chacun à RT.
      REMARQUE: Ajuster le temps d'incubation et la température de Proteinase K pour chaque type de tissu. Pour 10 sections de têtes d'embryons fixées en 4% PFA, incuber pendant 5 min à RT. En plus de la méthode utilisant Proteinase K, utiliser des traitements alternatifs au besoin, y compris (1) fraîchement préparé 0,1% Polyéthylène glycol tert-octylyl éther, 0,1% de citrate de sodium, 10 min à 37 oC; (2) 0,25 % à 0,5 % de Pepsin en HCl (pH 2) ou 0,25 % de trypsine, 10 min à 37 oC; et (3) irradiation micro-ondes avec tampon de citrate de 0,1 M (pH 6).
    3. Appliquer 200 l de solution de blocage (5 % de sérum d'âne dilué en 0,1 % de PBST) sur chaque diapositive, incuber à RT pendant 30 min, appuyez sur la solution de blocage sans rincer.
    4. Appliquer 50 ll du tampon d'équilibre fourni par le kit sur chaque diapositive à RT pendant au moins 10 s. Appuyez sur le tampon sans rinçant.
    5. Préparer le mélange de réaction (enzyme TdT de force de travail) en mélangeant TdT Enzyme avec le tampon de réaction fourni par le kit au rapport de 3:7. Appliquer 50 ll du mélange de réaction sur chaque diapositive et incuber à 37 oC pendant 1 h. Appuyez sur le tampon sans rincer.
    6. Appliquer 200 l l de la mémoire tampon d'arrêt (1:30 diluée en ddH2O) fournie par le kit à chaque diapositive, puis incuber à RT pendant 10 min. Rincer les diapositives avec PBS trois fois pendant 10 min chacune.
    7. Étiquette avec anticorps Rhodamine.
      1. Appliquer 50 ll de conjugué anti-digoxigenine (rhodamine) (1:1 dilué dans la solution de blocage) à chaque diapositive. Incuber à RT pendant 30 min dans l'obscurité.
      2. Rincer les diapositives avec PBS trois fois pendant 10 min chacune. Le mont glisse comme étape 3.1.6.

4. Acquisition d'imagerie

  1. Utiliser des contrôles positifs (tissus positifs pour l'antigène cible) pour vérifier l'étiquetage du signal et les contrôles négatifs (omettre l'anticorps primaire, contrôle de l'isotype ou des tissus négatifs pour l'antigène cible) pour évaluer l'arrière-plan des images sous le fluorescent microscope.
  2. Définir les conditions de l'équipement et de la caméra (expositions et autres paramètres généraux) pour l'imagerie en fonction de l'intensité du signal des contrôles négatifs et positifs.
    REMARQUE: Ces conditions varient par (1) caméras et microscopes utilisés pour l'imagerie, (2) anticorps et (3) tissus pour chaque expérience. Les conditions courantes utilisées pour les tissus craniofacial sont ISO 200 avec un temps d'exposition allant de 1/100 s à 1 s dépendent de la qualité et la spécificité des anticorps. Les grossissements appropriés varient selon la taille des échantillons et le but des expériences.
  3. Acquérir des images avec un microscope épifluorescence classique ou un microscope confocal. Acquérir des images (y compris celles des contrôles correspondants) dans les mêmes conditions pour chaque canal couleur. Enregistrer des images avec le même format (tiff est le meilleur pour préserver l'information).

5. Quantification de la fluorescence

REMARQUE: Dans de nombreux cas, la comparaison statistique des taches entre les différents groupes sera plus instructive. Avec les images d'immunofluorescence, quantifiez le niveau relatif de la protéine en mesurant la densité du signal, en comptant les cellules positives ou en calculant les zones positives. Pour l'analyse statistique, le nombre minimum d'échantillons biologiquement indépendants est de 3. Une méthode typique consiste à générer au moins trois sections de chaque échantillon et à prendre des images pour au moins trois zones représentatives dans chaque section.

  1. Quantification de l'intensité de la fluorescence à l'aide d'ImageJ
    1. Ouvrez le logiciel, et utilisez Analyze 'gt; Set Measurements pour vérifier que seule la zone et la densité intégrée sont sélectionnées. Utilisez le Fichier 'gt; Ouvrez pour ouvrir les images à analyser.
    2. Utilisez la barre d'outils pour sélectionner l'icône carrée ou circulaire à l'extrême gauche. Sélectionnez la zone à analyser sur l'image à l'aide de l'outil de sélection. Utilisez Analyze 'gt; Mesure pour obtenir la lecture de la zone sélectionnée et la densité intégrée dans la fenêtre Résultats. Sélectionnez une région à côté d'une cellule positive qui n'a pas de fluorescence pour lire l'arrière-plan.
    3. Répétez l'étape 5.1.2 pour analyser d'autres images. Ajusté la zone à analyser pour correspondre à celle de la première image.
    4. Copiez toutes les données de la fenêtre Résultats et collez dans une feuille de calcul une fois terminée sa mise en analyse.
    5. Calculer l'intensité de fluorescence corrigée (CTCF) comme densité intégrée — (Zone de cellule sélectionnée x Fluorescence moyenne des lectures de fond). Comparez la différence de fluorescence cellulaire totale corrigée entre les échantillons et faites un graphique.
  2. Quantification du nombre de cellules positives d'images fluorescentes à l'aide d'ImageJ
    1. Comptage manuel des cellules.
      1. Utilisez ImageJ 'gt; Plugins 'gt; Analyse pour installer le plugin Cell Counter.
      2. Utilisez le Fichier 'gt; Ouvrez pour ouvrir les images à analyser. Utilisez Plugins et Analyse pour ouvrir la fenêtre Counter et la fenêtre Résultats.
        REMARQUE: Le compteur cellulaire ne fonctionne pas sur les piles. Pour compter les piles, plugin Plot Z Axis Profile, puis utilisez image 'gt; Stacks 'gt; Plot Z Axis Profile pour surveiller l'intensité d'un retour sur investissement en mouvement à l'aide d'un outil de suivi des particules. Cet outil peut être manuel ou automatique.
      3. En cliquant sur l'un des boutons au bas de la fenêtre Counter pour initier le comptage. Cliquez directement sur une cellule/objet à compter jusqu'à la fin.
      4. Cliquez sur le bouton Résultats dans la fenêtre Compter. Le nombre total de cellules comptées sera indiqué dans la fenêtre Résultats. Enregistrez le journal des résultats sous forme de feuille de calcul et analysez.
    2. Comptage automatisé des cellules.
      1. Utilisez le Fichier 'gt; Ouvrez pour ouvrir les images à analyser. Convertissez l'image RGB en une image à l'échelle grise avant de procéder.
      2. Utilisez l'Image 'gt; Ajuster 'gt; Seuil pour sélectionner toutes les zones qui doivent être comptées.
      3. Utilisez Analyze 'gt; Analyser les particules pour obtenir le nombre de cellules / particules. Définir une plage de la taille de particules valides (par exemple, 100-Infinity) au lieu de la valeur par défaut de 0-Infinity pour compter les cellules/particules dans une plage spécifique. Enregistrez le journal des résultats sous forme de feuille de calcul et analysez.
        REMARQUE:         Pour obtenir d'autres informations de l'image, en plus de la zone, allez à analyser les mesures et définir les mesures et sélectionnez la boîte à côté de l'information nécessaire.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sections embryonnaires de tissu craniofacial
Après les étapes ci-dessus, les têtes ont été disséquées du contrôle (P0-Cre) ou mutant (bmpr1a activé de façon constitutive dans les cellules de crête neurale, P0-Cre; caBmpr1a) embryons au jour embryonnaire (E) 16.5 ou 18.5. Après fixation dans 4% PFA pendant 4 h, les échantillons ont été incorporés dans OCT et coronally cryosectionné. Les sections obtenues étaient immunostained avec des anticorps contre ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ici nous fournissons un protocole détaillé pour la préparation de la tête de souris et des tissus osseux non décalcifiés, et la cryosection ingation pour l'immunostaining de la prolifération cellulaire, de la mort cellulaire, et des marqueurs de signalisation de BMP. Nous détaillons également la stratégie d'obtention de données quantitatives à partir d'images immunofluorescentes. Ces méthodes peuvent également s'appliquer à d'autres tissus avec des modifications appropriées.

Les conditions de ...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health (R01DE020843 à Y.M.), l'International FOP Association (Y.M.) et une subvention de la National Natural Science Foundation of China (31500788 à J.Y.).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Ruban adhésifLeica#39475214
Alexa fluor 488-goat anti-Rabbit anticorps secondaireInvitrogenA-11034
Antifade Mountant avec DAPIInvitrogenP36931
Bovin serum albuminSigmaA2153
CoverslipsFisher Brand12-545-E
CryostatLeicaCM1850
EDTASigmaE6758
Microscope à fluorescenceOlympusBX51
GelatinSigmaG1890
In Situ. Kit de détection de la mort cellulaireMilliporeS7165
Lames de microscopeFisher Brand12-550-15
OCT CompoundFisher Healthcare23-730-571
Paraformaldéhyde (PFA)SigmaP6148  ;
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)SigmaP4417
Polyéthylène glycol  ; tert-octylphénylétherSigmaT9284Triton X-100
Protéinase KInvitrogenAM2542
Anticorps anti-Ki67 de lapinTechnologie de signalisation cellulaire9129Lot# :3 ; RRID :AB_2687446
Lapin anti-pSmad1/5/9anticorps Technologie de signalisation cellulaire13820Lot# :3 ; RRID :AB_2493181
Citrate de sodiumSigma1613859
SaccharoseSigmaS9378
TrisSigma10708976001

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Mots-clés

Tissue PreparationImmunostainingMouse CraniofacialUndecalcified BoneCryosectioningImmunofluorescenceProtein DetectionGelatin EmbeddingAntibody StainingFluorescence Quantification

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