Préparation des tissus et immunostaining des tissus craniofacial de souris et de l'os non décalcifié

Summary

Ici, nous présentons un protocole détaillé pour détecter et quantifier des niveaux de protéine pendant la morphogénèse/pathogénie craniofacial par immunostaining utilisant des tissus craniofacial de souris comme exemples. En outre, nous décrivons une méthode pour la préparation et la cryosectioning des tissus durs non décalcifiés des jeunes souris pour immunostaining.

Abstract

L'immunostaining tissulaire fournit la détection très spécifique et fiable des protéines d'intérêt dans un tissu donné. Ici nous décrivons un protocole complet et simple pour détecter l'expression de protéine pendant la morphogenèse/pathogénie craniofacial utilisant des tissus craniofacial de souris comme exemples. Le protocole consiste en la préparation et la cryosection des tissus, l'immunofluorescence indirecte, l'acquisition d'images et la quantification. En outre, une méthode pour la préparation et la cryosectioning des tissus durs non décalcifiés pour immunostaining est décrite, utilisant des tissus craniofacial et des os longs comme exemples. Ces méthodes sont essentielles pour déterminer l'expression des protéines et les changements morphologiques/anatomiques dans divers tissus pendant la morphogénèse craniofaciale/pathogénie. Ils sont également applicables à d'autres tissus avec des modifications appropriées. La connaissance de l'histologie et la haute qualité des sections sont essentielles pour tirer des conclusions scientifiques à partir des résultats expérimentaux. Les limites potentielles de cette méthodologie comprennent, sans s'y limiter, la spécificité des anticorps et les difficultés de quantification, qui sont également discutées ici.

Introduction

Le visage est un élément clé de l'identité humaine, et est composé de plusieurs types de tissus, tels que l'épithélium, muscle, os, cartilage, dent. Ces tissus sont dérivés des trois couches germinales: ectoderm, endoderm, et mesoderm^1,2. Pour le bon modelage et le développement des tissus craniofacial, la prolifération cellulaire, la mort et la différenciation doivent être fortement coordonnées et réglées par des voies de signalisation spécifiques, telles que Wnt, Fgf, Hh et Bmp voies^{3,4 ,5}. Les défauts dans la prol....

Protocol

Toutes les expériences sur la souris ont été menées conformément aux lignes directrices de l'Université du Michigan concernant les soins et l'utilisation des animaux dans la recherche. Toutes les procédures animales utilisées dans cette étude ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (IACUC) de l'Université du Michigan (Protocole #PRO00007715).

1. Préparation des tissus

1. Préparation des tissus embryonnaires
   1. Préparer un plat de 10 cm et plusieurs plats de 3,5 cm contenant de la saline tamponnée en phosphate (PBS), et une plaque de culture de 12 puits contenant 2....

Results

Sections embryonnaires de tissu craniofacial
Après les étapes ci-dessus, les têtes ont été disséquées du contrôle (P0-Cre) ou mutant (bmpr1a activé de façon constitutive dans les cellules de crête neurale, P0-Cre; caBmpr1a) embryons au jour embryonnaire (E) 16.5 ou 18.5. Après fixation dans 4% PFA pendant 4 h, les échantillons ont été incorporés dans OCT et coronally cryosectionné. Les sections obtenues étaient immunostained avec des anticorps contre .......

Discussion

Ici nous fournissons un protocole détaillé pour la préparation de la tête de souris et des tissus osseux non décalcifiés, et la cryosection ingation pour l'immunostaining de la prolifération cellulaire, de la mort cellulaire, et des marqueurs de signalisation de BMP. Nous détaillons également la stratégie d'obtention de données quantitatives à partir d'images immunofluorescentes. Ces méthodes peuvent également s'appliquer à d'autres tissus avec des modifications appropriées.

Les conditions de .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ruban adhésif	Leica	#39475214
Alexa fluor 488-goat anti-Rabbit anticorps secondaire	Invitrogen	A-11034
Antifade Mountant avec DAPI	Invitrogen	P36931
Bovin serum albumin	Sigma	A2153
Coverslips	Fisher Brand	12-545-E
Cryostat	Leica	CM1850
EDTA	Sigma	E6758
Microscope à fluorescence	Olympus	BX51
Gelatin	Sigma	G1890
In Situ. Kit de détection de la mort cellulaire	Millipore	S7165
Lames de microscope	Fisher Brand	12-550-15
OCT Compound	Fisher Healthcare	23-730-571
Paraformaldéhyde (PFA)	Sigma	P6148  ;
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)	Sigma	P4417
Polyéthylène glycol  ; tert-octylphényléther	Sigma	T9284	Triton X-100
Protéinase K	Invitrogen	AM2542
Anticorps anti-Ki67 de lapin	Technologie de signalisation cellulaire	9129	Lot# :3 ; RRID :AB_2687446
Lapin anti-pSmad1/5/9	anticorps Technologie de signalisation cellulaire	13820	Lot# :3 ; RRID :AB_2493181
Citrate de sodium	Sigma	1613859
Saccharose	Sigma	S9378
Tris	Sigma	10708976001