Isolement et transfert adoptif de sel élevé traités des cellules dendritiques présentatrices d’antigène

Résumé

Nous présentons ici un protocole visant à isoler les cellules dendritiques des rates murins de tri cellulaire magnétique et transfert adoptif en souris naïves de. Le modèle de cellules dendritiques activées de haut-sel a été choisi pour expliquer la procédure étape par étape de transfert adoptif et cytométrie en flux.

Résumé

La prise excessive de sel alimentaire contribue à l’inflammation et joue un rôle essentiel dans le développement de l’hypertension. Précédemment, nous avons constaté que les cellules dendritiques présentatrices d’antigènes (CD) sent élevées de sodium extracellulaire conduisant à l’activation de la NADPH oxydase et la formation d’isolevuglandin (IsoLG)-protéines adduits. Ces IsoLG-protéines adduits réagissent avec le self-protéines et promouvoir un état autoimmun-like et hypertension. Nous avons développé et optimisé state-of-the-art des méthodes pour étudier la fonction DC dans l’hypertension. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour l’isolement, dans vitro traitement avec sodium élevé et transfert adoptif de murin CD11c splénique⁺ des cellules dans des souris destinataires afin d’étudier leur rôle dans l’hypertension.

Introduction

Excès de sel alimentaire est un facteur de risque majeur pour l’hypertension. ^{1 , 2} the American Heart Association recommande un maximum de 2 300 milligrammes (mg) de l’apport en sodium (Na⁺) par jour, cependant ; moins de 10 % de la population américaine observe cette recommandation. ^{3 , 4} réduction modeste apport Na⁺ abaisser la pression artérielle et réduire les nouveaux cas annuels de cardiopathies coronariennes et des accidents vasculaires cérébraux aux Etats-Unis de 20 %. ⁵ un problème majeur avec la consommation excessive de sel est que 50 % de la population hypertendue présente une sensibilité au sel, définie comme une augmentation de 10 mmHg de la tension artérielle après chargement Na⁺ ou une baisse similaire dans la tension artérielle après Na⁺ restriction et la diurèse. ⁶ sensibilité au sel également survient chez 25 % des individus normotendus et est un facteur prédictif indépendant de décès et d’accidents cardiovasculaires. ^{7 , 8} mécanismes de détection de sel dans l’hypertension impliquant le rein ont été abondamment étudiées ; Toutefois, des études récentes suggèrent que les cellules immunitaires peuvent détecter Na⁺. ^{9 , 10}

Récentes indiquent que les changements rénaux Na⁺ de manutention peuvent causer une accumulation de Na⁺ dans l’interstitium et promouvoir l’inflammation. ^{11 , 12} notre laboratoire et autres ont montré que les cellules du système immunitaire inné et adaptatif de contribuent à l’aggravation de l’hypertension. ^{9 , 13 , 14 , 15} divers stimuli hypertensifs, y compris l’angiotensine II, la norépinéphrine et sel cause macrophages, monocytes et lymphocytes T à s’infiltrer dans le rein et le système vasculaire et favorisent la rétention de Na⁺ , vasoconstriction, la pression artérielle élévation et dommages d’extrémité-organe. ^{9 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20} dans les études antérieures, nous avons constaté que les contrôleurs de domaine s’accumulent isolevuglandin (IsoLG)-protéines adduits en réponse à divers stimuli hypertensifs, y compris l’angiotensine II et DOCA-sel de l’hypertension. ¹⁴ IsoLGs sont des produits hautement réactives de la peroxydation lipidique qui rapidement et de façon covalente adduit de lysines des protéines et leur accumulation est associée à l’activation de DC. Formation en murin DCs.⁹ entrée Na⁺ dans DCs est médiée par l’amiloride sensible transporteurs d’adduits ¹⁴ nous avons récemment créé qu’élevée Na⁺ est un puissant stimulus pour IsoLG-protéine. Na⁺ est ensuite échangée pour le calcium (Ca^{2 +}) par l’intermédiaire de l’échangeur^{2 +} /nom de Na⁺. Ca^{2 +} active la protéine kinase C (PKC) qui active la NADPH oxydase, conduisant à une augmentation superoxyde (O₂^{· -}) et la formation d’un adduit IsoLG-protéine. ⁹ transfert adoptif de sel-exposés l’hypertension DCs nombres premiers en réponse à une dose sous presseur d’angiotensine II. ⁹

Identification des CD11c⁺ DCs de tissus a été précédemment limité à l’immunohistochimie et la RT-PCR, et isolement des contrôleurs de domaine a été limitée à la cellule tri par cytométrie en flux. Même si écoulement cytometry cellule tri est une méthode puissante pour l’isolement des cellules immunitaires, il est coûteux et fastidieux et conduit à un rendement faible de cellules viables. Par conséquent, nous avons optimisé un protocole étape par étape pour la digestion des tissus, stimulation in vitro et transfert adoptif de CD11c⁺ DCs pour étudier l’hypertension.

Protocole

De l’Université Vanderbilt animalier institutionnel et Comité d’urbanisme ont approuvé les procédures décrites dans les présentes. Souris sont logés et pris en charge conformément au Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire (National Academies Press. Révisée en 2010).

1. isolement des rates de souris

1. Préparer le RPMI 1640 : 10 % FBS, 0,10 mM HEPES, pyruvate de sodium 1 mM, 50 µM β-mercaptoéthanol et 1 % la pénicilline/streptomycine.
2. Euthanasier 10 – 12 semaines-vieilles souris mâles C57bl/6 par inhalation de CO₂ . Vaporiser la poitrine et les côtés de la souris avec l’éthanol à 70 %. Sur le côté gauche, ouvrir lentement la peau et la cavité péritonéale pour exposer la rate.
3. À l’aide de petites pinces, déplacer avec précaution les intestins et le foie du côté gauche de la souris et en utilisant des ciseaux doucement l’accise la rate.
   Remarque : Cette étape doit être faite avec beaucoup d’attention que les lésions du tractus gastro-intestinal peuvent induire la contamination.
4. Placer chaque rate excisé en tube à fond conique marqué 15 mL contenant 3 mL du milieu RPMI 1640.

2. génération unique des Suspensions de cellules de rate

Remarque : La rate peut être dissociée dans une suspension cellulaire unique en combinant mécanique dissociation plus digestion enzymatique.

1. Préparer la solution de digestion rate en ajoutant collagénase D (1 mg/mL ; 0,29 U/mg lyophilisé) et DNase I (0,1 mg/mL) préparé milieu RPMI 1640 (reportez-vous à l’étape 1.1)
2. Forceps permet de transférer la rate dans une C (tube de dissociation) contenant 3 mL de solution de digestion de rate.
3. Effectuer la dissociation mécanique utilisant un homogénéisateur semi automatique selon les instructions du fabricant.
   1. Placer le tube C sur l’homogénéisateur semi-automatisé, veiller à ce que le tube C est bien placé sur le bras rotatif. Une fois que le tube C est placé, presser le bouton start sur l’homogénéisateur semi-automatisé pour exécuter le protocole rate 04.01 pendant 60 s.
      Remarque : Dissociation mécanique peut aussi être effectuée en plaçant un filtre de 40 μm au sommet d’un tube conique de 50 mL et meuler doucement la rate à travers le filtre. Après le meulage de la rate, grâce à rincer le filtre de 40 µm avec 10 mL de médias RPMI.
4. Après dissociation mécanique, détacher le tube de l’homogénéisateur et effectuer la digestion enzymatique. Incuber les échantillons pendant 15 min à 37 ° C sous rotation continue (20 tr/min).
5. Transférer la solution en pipettant également, dans un tube conique de 50 mL après filtrage à travers un tamis de 40 µm. Lavez le tamis de 40 µm avec 10 mL de PBS de Dulbecco (SPD). Centrifuger les cellules à 300 g pendant 10 min à 4 ° C.
6. Après centrifugation, aspirer le surnageant complètement et laver le culot de resuspendant dans 10 mL de SPD. Centrifuger à 300 x g pendant 10 min à 4 ° C.

3. isolement de CD11c⁺ DCs de Suspension monocellulaire splénique

1. Resuspendre le culot dans 5 mL de SPD et de compter le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre et trypan blue exclusion.
2. Les cellules de granule par centrifugation à 300 x g, pendant 10 min à 4 ° C.
3. Aspirer le surnageant complètement et resuspendre le culot dans 400 µL de tampon de (Mac) de tri cellulaire activé magnétiquement.
4. Ajouter 100 µL de microbilles CD11c (voir Table des matières) par les cellules de 1 x 10⁸ .
5. La suspension cellulaire de vortex et incuber pendant 10 min dans le réfrigérateur à 4 ° C.
6. Ajouter 10 mL de tampon de MACs pour laver les cellules. Centrifuger à 300 x g pendant 10 min à 4 ° C.
7. Aspirer le surnageant complètement et remettre en suspension dans 500 µL de tampon de MACs.

4. magnétique séparation de CD11c⁺ DCs

Remarque : Séparation magnétique se faite manuellement avec un séparateur magnétique (voir Table des matières) équipés de colonnes de LS. Séparation magnétique peut également être faite automatiquement avec un séparateur magnétique automatisé. (voir Table des matières).

1. Placer la colonne LS dans le champ magnétique du séparateur de MACs et un tube conique de 15 mL dans chaque colonne pour recueillir le cheminement.
2. Rincer la colonne LS avec 3 mL de tampon.
3. Placez la suspension cellulaire sur chaque colonne de LS et recueillir le cheminement contenant des cellules non marquées.
4. Laver la colonne LS avec 3 mL de tampon de MACs le prélèvement de cellules sans étiquette qui passent à travers. Laver la colonne LS 2 fois plus.
5. Retirer la colonne LS du séparateur magnétique. Ajouter 5 mL de tampon de MACs dans chaque colonne et rincer immédiatement les cellules magnétiquement étiquetées par plongeant fermement la colonne LS dans un tube conique propre de 15 mL.
   Remarque : Il est important d’effectuer un double isolement des cellules de CD11c pour obtenir une suspension de cellules de haute pureté. Par conséquent, répétez les étapes 3.1 à 4,5. et 4 de la Figure de référence pour les normes de pureté. Cette étape améliore la pureté de CD11c⁺ cellules à 90 – 95 %.
6. Déterminer CD11c⁺ DC numéro sur un hémocytomètre en utilisant le bleu trypan exclusion. Diluer l’échantillon de cellules à une dilution de 1:1 dans une solution de bleu trypan de 0,4 %.
   Remarque : cellules Non viables seront être teintés bleus, tandis que les cellules viables restera sans tache.
   1. Pour ce faire, soigneusement remplir un hémocytomètre avec 10 µL de la dilution des échantillons cellulaires et incuber pendant 1 minute.
   2. Compter les cellules dans 4 carrés de 1 x 1 mm² dans la chambre qui a été chargée pour déterminer le nombre de cellules viables.

5. dans Vitro haut sel traitement de CD11c⁺ DCs

1. Préparer le milieu de culture DC en ajoutant 10 % FBS, 0,1 mM HEPES, pyruvate de sodium 1 mM, 50 µM β-mercaptoéthanol et 1 % la pénicilline/streptomycine à 500 mL 1640 RPMI.
2. Préparer 10 x DC milieux de culture cellulaire sel élevée (400 mM) en pesant 1,17 g de NaCl et de le placer dans un tube stérile de 50 mL à falcon. Ajouter 50 mL stérile DC cellules de milieux de culture (préparé à l’étape 5.1) dans le tube falcon de 50 mL et vortex jusqu'à ce que le NaCl est en solution.
3. Immédiatement, filtrer le sel milieux de culture DC haute à l’aide de filtration sous vide à travers un filtre de 0,2 μm sous une hotte de culture cellulaire.
4. Centrifuger chaque suspension de cellules de la rate à 300 x g pendant 10 min à 4 ° c. Resuspendre chaque culot cellulaire dans les milieux de culture DC à une concentration de 1 x 10⁶ cellules/mL.
5. Distribuer 900 μL (environ 1 x 10⁶ cellules) de la suspension de DC dans un fond plat 24 puits plaque de Falcon. Ajouter 100 µL de haut sel DC culture media dans chaque puits pour une concentration en sodium final de 190 mM. Étiqueter la plaque et le place dans un 37 ° C humifiée incubateur à CO₂ pendant 48 h.

6. adoptif transfert de haut sel traité CD11c⁺ DCs

1. Après stimulation in vitro pendant 48 h, retirer la plaque de la 37 ° C humifiée incubateur à CO₂ .
2. Pipetter les milieux de culture cellulaire vers le haut et vers le bas pour remettre le CD11c⁺ DCs. Pipette tous les CD11c⁺ DC suspension dans un correspondant étiqueté tube 1,6 mL. Répétez cette étape pour chaque personne bien plaqué.
3. Centrifuger chaque CD11c⁺ DC suspension à 300 x g pendant 10 min à 4 ° C. Aspirer le surnageant. Resuspendre le culot de DC avec 100 µL de SPD stérile.
4. Tirage au sort DC suspension dans une seringue de 1 mL équipée d’une aiguille de ½ pouce de 27 G.
5. Placer les naïfs 10 semaines C57bl/6 souris mâles au-dessous de 2 % isoflurane pour réaliser un plan chirurgical stable. Vérifiez le niveau d’anesthésie avec le manque de réflexe de la pédale. Lorsqu’on atteint un plan chirurgical stable, lentement et soigneusement introduire l’aiguille dans l’espace rétro-orbitaire à un angle d’environ 30°.
   Remarque : Le biseau de l’aiguille 27 G doit pointer vers le bas, loin de le œil, pour éviter des lésions oculaires.
6. Lentement et sans à-coup injecter le CD11c⁺ DC suspension (environ 1 x 10⁶ cellules). Une fois l’injection terminée, retirez l’aiguille de l’espace rétro-orbitaire conscient à ne pas endommager le œil.
   Remarque : Après l’injection, il devrait y avoir peu ou pas de saignement. Transfert adoptif de CD11c⁺ DCs peuvent également être effectuées à l’aide d’une méthode I.V. d’injection (p. ex. la veine caudale). Les souris contrôle recevoir CD11c⁺ DCs qui ont été cultivées dans des milieux de sel normal.
7. Retirer les souris de la coiffe et analysez-les pendant environ 30 min au cours de la récupération de l’anesthésie.

7. préparation de 14 jour faible dose l’angiotensine II (140 ng/kg/min)

1. Préparer le tampon de l’angiotensine II en ajoutant 500 μL de 5 M de NaCl et 300 μL d’acide acétique. Quantum Satis (QS) à 30 mL de désionisée H₂0.
2. Dissoudre l’angiotensine II à 5 mg/mL de solution tampon de l’angiotensine II. Diluer la solution mère de l’angiotensine II avec un tampon supplémentaire pour obtenir une concentration finale telle que la minipompe osmotique livrera l’angiotensine II dans un taux de 140 ng/kg/min selon le poids de chaque souris.
   Remarque : Essentielles de l’angiotensine II (mg) = (poids (g) la souris x 0,2 mg / jour x 14 jours) / 1000
   Préparé à l’angiotensine II (mg) = (essentiel angiotensine II x 260 µL) / pompe débit (0,25 μL/h)
   L’angiotensine II Stock Volume (μl) = préparé l’angiotensine II / concentration (5 mg/mL) x 1,000 de stock
   Diluer le volume (μl) = 270 - stock volume de l’angiotensine II
3. Ajouter l’angiotensine II volume stock au diluer (tampon de l’angiotensine II) basé sur les volumes calculés à l’étape 7.2.
4. Sous une hotte de culture de cellules stériles, ouvrez minipompe osmotique.
5. Ajouter dilué de l’angiotensine II solution et expulser tout l’air de la seringue et l’aiguille. Insérez l’aiguille fournie dans la partie inférieure de la minipompe osmotique et injecter lentement la solution de l’angiotensine II tandis que lentement et soigneusement rétracter l’aiguille de la vessie.
6. Insérez la tête minipompe osmotique dans la vessie osmotique entièrement, attention ne pas à entrer de l’air dans la vessie.

8. implantation de 14 jour faible dose l’angiotensine II minipompes osmotiques

1. Dix jours après le transfert adoptif de CD11c⁺ DCs, lieu de souris dans une chambre d’isoflurane pour initier l’anesthésie et puis déplacez les souris au cône de nez continuellement recevoir 2 % isoflurane pour atteindre et maintenir un plan chirurgical approprié.
2. Enlever la fourrure le long de la face dorsale du cou avec une tondeuse pour préparer le site chirurgical. Nettoyer la zone rasée avec de l’éthanol 70 %, suivie de la Bétadine 7,5 % avant le début de la chirurgie.
3. Créer une petite incision (environ 1,5 cm) dans la peau. Insérer une pince hémostatique dans l’incision pour créer une poche sous-cutanée pour le placement de la minipompe osmotique.
4. Insérez la minipompe dans la poche sous-cutanée. Fermer la peau plaie avec 2-3 agrafes chirurgicales et appliquez une autre application de Bétadine de 7,5 % sur la plaie et agrafes pour prévenir l’infection.
5. Surveiller les souris pendant 30 à 60 min lors de la récupération de l’anesthésie avant de les retourner à leurs camps.
   Remarque : Souris a besoin d’être surveillé jusqu'à 3-4 jours après l’implantation de la minipompe osmotique.

9. isolement des rates de souris bénéficiaires pour cytométrie

1. Après 14 jours de perfusion de faible dose l’angiotensine II, isolat rates de souris in vitro haut sel traitement DCs par transfert adoptif. Suivez les étapes précises énumérées ci-dessus (étapes 1 et 2).

10. surface de coloration

1. Transfert des splénocytes qui sont remis en suspension dans la solution 1 PBS x dans un polystyrène tube FACS et centrifuger à 350 x g pendant 8 min à 4 ° C. Aspirer le surnageant après centrifugation. Laver deux fois avec 1 mL de tampon de MACs et centrifugation (350 x g, 8 min, 4 ° C).
   1. Répartissez les splénocytes également sur les tubes de polystyrène de différentes FACS basées sur le nombre de panneaux de cytométrie en flux désiré.
2. Pour effectuer la coloration Live/Dead de viabilité de la cellule, laver les cellules avec 1 x PBS et centrifuger (350 x g, 8 min, 4 ° C). Remettre en suspension dans 1 mL de PBS 1 x puis ajouter 1 µL d’une viabilité cellulaire-tache (voir table des matières). Incuber pendant 15 min à 4 ° C (réfrigérateur ou sur la glace) couvert de papier aluminium pour protéger de la lumière.
3. Durant l’incubation de la tache de la viabilité cellulaire, préparer le cocktail d’anticorps à la surface des cellules coloration dans un volume approprié de tampon de MACS.
4. Laver les cellules avec 1 mL de tampon de MACS, centrifugeuse (350 x g, 8 min, 4 ° C) et remettre en suspension de chaque culot cellulaire avec 100 µL de l’anticorps cocktail. Incuber les protégés de la lumière pendant 30 min à 4 ° C.
   Remarque : Chaque anticorps de cytométrie en flux est unique, et il est très utile et recommandée pour déterminer la quantité optimale d’anticorps nécessaires en effectuant une courbe de titration de dose pour chaque anticorps spécifique.
5. Laver les cellules deux fois avec 1 mL de tampon de MACS et remettre en suspension les splénocytes dans une quantité appropriée de MACS tampon pour analyse en cytométrie en flux.

Résultats

La figure 1 représente une représentation schématique des étapes décrites ci-dessus. Spleens murins isolés sont triés pour CD11c⁺ DCs par cellule magnétique, tri et plaqué dans les médias sels normales (NS ; 150 mmol de NaCl) ou forte media sel (HS ; 190 mmol NaCl) pendant 48 h. CD11c⁺ DCs moutschen acheminés par rétro-orbitaire injection pour les bénéficiaires souris naïves. Dix jours plus tard, les souris sont implantés avec des minipo...

Discussion

Dans le protocole actuel, nous avons optimisé les procédures pour isoler CD11c⁺ DCs des rates de souris et moutschen de transférer dans des animaux naïfs pour étudier le rôle des contrôleurs de domaine dans l’hypertension induite par le sel. Ce protocole peut être adapté pour isoler et transfert moutschen autres sous-ensembles de cellules immunitaires, dont les macrophages, les monocytes et les cellules immunitaires adaptatives dont les lymphocytes T et B. Nous avons optimisé le processus de digestion spléniqu...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
APC/Cy7 anti-souris CD11c Biolegend		117324
tampon de fonctionnement autoMACS  ;	Miltenyi Biotec	130-091-221
CD11c Microbilles Ultrapures  ;	Miltenyi Biotec	130-108-338
Collagénase D	Roche	11088866001
DNase I	Roche	10104159001
DPBS sans calcium et magnésium	Corning	21-031-CV
FcR Réactif bloquant	Miltenyi Biotec	; 130-092-575
FITC anti-souris CD45	Biolegend	103108
GentleMACS C tube	Miltenyi Biotec	130-096-334
Dispositif de dissociation GentleMACS	Miltenyi Biotec	130-093-235	Protocole d’utilisation : Rate 04.01
LIVE/DEAD fixable violet kit de coloration des cellules mortes	violettes Invitrogen	L34964
LS Columns	Miltenyi Séparateur QuadroMACs Biotec	130-042-401
;	Miltenyi Biotec	130-090-976
RPMI 1640 moyen  ;	Gibco	11835-030