Article de méthode

Construction et utilisation d’une chambre de Stimulation électrique pour renforcer la différenciation ostéogénique dans les cellules souches mésenchymateuses/stromales In Vitro

DOI :

10.3791/59127

⸱

31 janvier 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Frankfurt Initiative for Regenerative Medicine, Johann Wolfgang Goethe-University, 2J. Crayton Pruitt Family Department of Biomedical Engineering, University of Florida

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous présentons ici un protocole pour la construction d’une chambre de culture cellulaire conçue pour exposer les cellules de différents types de stimulation électrique et son utilisation dans le traitement des cellules souches mésenchymateuses afin d’améliorer la différenciation ostéogénique.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cellules souches/stromales mésenchymateuses (CSM) ont été largement utilisés pour promouvoir la guérison osseuse dans les approches en génie tissulaire. Stimulation électrique (EStim) a été démontrée pour augmenter la différenciation ostéogénique MSC in vitro et promouvoir OS guérison en milieu clinique. Nous décrivons ici la construction d’une chambre de culture de cellules EStim et son utilisation dans le traitement de rat MSC OS-moelle osseuse afin d’améliorer la différenciation ostéogénique. Nous avons constaté que traitant MSCs avec EStim pendant 7 jours se traduit par une augmentation significative de la différenciation ostéogénique, et surtout, cet effet pro-ostéogénique persiste longtemps après que (7 jours) EStim est discontinué. Cette approche de pré-traitement MSCs avec EStim afin d’améliorer la différenciation ostéogénique pourrait être utilisée pour optimiser le tissu osseux, ingénierie des résultats du traitement et, ainsi, les aider à réaliser leur potentiel thérapeutique complet. En plus de cette application, cette chambre de culture de cellules EStim et protocole permet également d’enquêter sur d’autres comportements de cellule EStim sensibles, tels que de la migration, prolifération, apoptose et fixation de l’échafaudage.

Introduction

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Une augmentation des traumatismes et/ou défauts osseux induite par la maladie sont traitées à l’aide de différentes combinaisons de thérapie cellulaire et les technologies de la médecine régénérative. MSCs sont la cellule de choix dans ces traitements, en raison de leur activité ostéogénique relativement élevée, isolement et expansion efficacité et sécurité1. Pour optimiser leur activité ostéogénique et, par conséquent, optimiser leur efficacité thérapeutique, plusieurs méthodes ont été introduites pour manipuler les MSCs avant leur utilisation dans ces traitements (tel qu’il est examiné par Mauney Al.2). Une de ces méthodes est EStim, qui a été montré pour améliorer la différenciation ostéogénique MSC in vitro3 et promouvoir OS in vivo4de guérison. Malgré le nombre croissant d’études qui portent sur le traitement de MSCs avec EStim, un régime optimal pour maximiser l’effet pro-ostéogénique de EStim doit encore être défini.

Autres méthodes in vitro à l’aide d’EStim utilisent des ponts salins immergés dans le milieu de culture, qui sépare les cellules des électrodes métalliques5. L’avantage de ceci est que livraison estimée par l’intermédiaire de ponts salins élimine l’introduction de sous-produits chimiques (p. ex., la corrosion des électrodes métalliques) qui peuvent être cytotoxiques. Malgré cet avantage, ponts salins sont difficiles à travailler avec, et l’EStim ils livrent diffère de celui livré en modèles in vivo, compliquant la corrélation entre les résultats obtenus en utilisant les deux systèmes. Configurations qui offrent EStim via des électrodes métalliques ou de carbone fixés à l’intérieur des puits de culture cellulaire (tel que revu par Hronik-Tupaj et Kaplan6) mieux simulent appareils utilisés in vivo ; Cependant, ces dispositifs sont difficiles à nettoyer/stériliser entre chaque utilisation et le nombre de cellules qui peuvent être étudiés par l’expérience est limité. Nous avons conçu la chambre EStim présentée ici spécifiquement pour pallier les lacunes de ces autres configurations. Alors que la majeure partie de notre expérience dans l’utilisation de cette chambre EStim travaille chez 2D et 3D cultures contenant de la moelle osseuse et adipeux tissu-dérivés - MSCs3,4, est un avantage majeur de cette chambre, qui il est polyvalent et, avec relativement mineur changements, peut être adapté pour étudier d’autres types de cellules dans une variété de différentes conditions.

Nous décrivons ici la construction d’une chambre de culture de cellules EStim ; Ensuite, nous montrons l’utilisation de MSCs traitants avec différents schémas d’EStim et mesurant l’effet qui en résulte sur la différenciation ostéogénique. Différenciation ostéogénique MSC est évaluée par le dépôt de calcium, l’activité phosphatase alcaline et expression du gène marqueur ostéogénique. Ce qui est important, dans passé des expériences qui ont utilisé cette configuration, nous avons observé que ces effets pro-ostéogénique persistent longtemps après que le traitement EStim a été interrompu.

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Protocole

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1. construction de la chambre de culture de cellules stimulation électrique

  1. Pour construire la chambre EStim, recueillir deux couvercles de plaques de culture cellulaire standard de 6 puits ; fil de platine à 99,99 %, 60 cm de long avec un diamètre de 0,5 à 1 mm ; fil de cuivre argenté, 70 cm de long avec un diamètre de 0,6 mm ; pinces coupantes ; kit fer à souder ; un tube de colle supraconducteur ; un seul fil terminal de connexion, six petites 2,2 V LED (en option) ; un tube de colle silicone non corrosive revêtement (facultatif) ; un rouleau de ruban électrique noir ; norme, flexible, isolation câble électrique en cuivre (0,14 mm2), 2 m de long (Table des matières).
  2. Dans un couvercle de plaque 6 puits, mark et puis Percez deux trous (d’un diamètre de ~ 1 mm), 25 millimètres, près du bord extérieur de chacun des six puits (12 trous au total), comme illustré à la Figure 1 a, B.
  3. Coupez douze longueurs de 5 cm de fil de platine avec la pince coupante. Plier chacun des fils manuellement en forme de L, laissant une extrémité 3 cm de long et l’autre 2 cm. Coupez le fil argenté en deux longueurs de 35 cm.
  4. Insérez l’extrémité coudée de long (3 cm) d’un fil de platine (de l’intérieur vers l’extérieur) dans chaque trou percé, laissant dépasser 1 à 2 mm par l’extérieur de la paupière, le plier avec une pincette. Fixez les fils de platine dans les trous du couvercle avec de la colle supraconducteur et laisser sécher pendant environ 6 h.
  5. Souder les bouts de tous les six fils de platine (qui sera plus tard servir de cathodes, voir Figure 1 a) qui dépasse les couvercles à l’un des fils argenté. Répétez la même procédure, souder les fils de platine six restants (qui serviront plus tard comme anodes) à l’autre fil argenté.
    1. Ajouter des LEDs dans le circuit entre chacune des six anode-cathode électrode de platine paires, pour confirmer la fonctionnalité au cours des expériences (en option). Placez un morceau de ruban isolant noir sous chaque LED afin d’éviter d’exposer les cellules dans les plaques de culture à la lumière de LED (Figure 1).
  6. Coller le fil terminal de connexion pour le coin supérieur gauche du couvercle plaque 6 puits et raccorder les deux fils argenté aux bornes d’entrées, comme illustré à la Figure 1.
  7. Découper une section de 20 x 20 mm depuis le coin supérieur gauche d’un deuxième couvercle plaque 6 puits (Figure 1 b, couvercle Nr. 2) pour accueillir le terminal de connexion sur le couvercle du premier. Couvrir le premier couvercle, équipé d’électrodes, le second couvercle et avec du ruban adhésif avec du ruban adhésif.
    1. Pour améliorer la liaison des deux couvercles, utilisez adhésif siliconé enduit (en option). Pour ce faire, couvrir le couvercle avec des électrodes d’argent avec une couche de 3 à 5 mm de colle silicone et recouvrir avec l’autre couvercle, permettant à 12 h pour la colle sécher.
  8. Branchez une extrémité des deux fils de cuivre isolés standards aux bornes de sortie du connecteur de fil et les autres extrémités de connecteurs mâles de banane (4 mm).
    Remarque : La longueur de ces fils dépend de la distance de la tablette dans l’incubateur, où les cellules seront conservés, à l’alimentation, en dehors de l’incubateur (Figure 1).
  9. Ajuster la posologie (tension) et régime d’EStim livrés aux cellules en réglant l’alimentation DC.
    1. Allumez l’alimentation en appuyant sur le bouton ON/OFF sur le panneau avant. Activer le canal 1 en appuyant sur le bouton 1.
    2. Appuyez sur bouton Nr. 4 (V-set) pour régler la tension. Appuyez sur boutons 2, . et 5 pour régler la sortie de charge à 2,5 V. Appuyez sur Enter.
    3. Faire en sorte que la sortie de charge de 2,5 V (2 500 mV) correspond à un budget de 100 mV/mm, selon l’équation suivante, simplifiée.
      V EStim = figure-protocol-1 ; ou
      V = VEStim × d
      Ici, V = la tension d’alimentation de sortie en millivolts ; d = la distance entre les électrodes en millimètres ; V EStim = la tension de stimulation en millivolts par millimètre.
      Remarque : Cette simplification s’applique seulement en cas de tension constante. La résistance entre les cellules et le milieu est négligeable comme électrodes ne sont pas en contact direct avec les cellules ; Alors, EStim est remis dans les cellules par l’intermédiaire.

2. mesenchymal stem cell culture dans un milieu ostéogénique

  1. Acheter et stocker MSCs rat disponibles dans le commerce (voir Table des matières) dans l’azote liquide jusqu’au jour de l’expérience. Par ailleurs, isolat MSCs provenant d’autres animaux selon les protocoles publiés ailleurs7,,8 , conformément aux règlements institutionnels locaux pour l’utilisation des animaux d’expérimentation.
  2. Le jour de l’expérience, retirer un flacon (1 x 106 cellules) de MSCs dans le stockage de l’azote liquide et rapidement (en moins de 1 min) décongeler les cellules dans un bain-marie chauffé à 37 ° C.
    1. Dans des conditions stériles dans une hotte à flux laminaire, distribuer le contenu du flacon dans un tube falcon de 50 mL et ajouter 9 mL de milieu normal (NM) préchauffé à 37 ° C, consistant en support de l’aigle modifié de Dulbecco (DMEM ; 1 x) avec 10 % inactivés par la chaleur bovine sérum fœtal (SVF) et 1 % solution de pénicilline/streptomycine. Les cellules pendant 5 min à pellets par centrifugation à 300 x g.
    2. Dans une hotte à flux laminaire, éliminer le surnageant et soigneusement resuspendre le culot dans 12 mL de NM préchauffé à 37 ° C. Transférer les cellules resuspendues dans un flacon de culture cellulaire T-75.
  3. La culture des cellules à 37 ° C, 5 % de CO2, 5 % O2 jusqu'à ce qu’ils atteignent une confluence de 80 à 90 % (après environ 3 à 5 jours).
  4. Le passage des cellules.
    Remarque : Effectuez toutes les opérations sauf la centrifugation et l’incubation dans des conditions stériles dans une hotte à flux laminaire.
    1. Après avoir atteint une confluence de 80 à 90 %, récupérer les cellules avec la solution de détachement cellulaire. Aspirez le milieu de culture cellulaire, laver 2 x avec 1 x tampon phosphate salin (PBS), ajouter 5 mL de solution de détachement cellulaire 1 x et remettez les cellules dans l’incubateur pendant 5 min.
    2. Une fois que les cellules sont détachent, ajouter une quantité égale de milieu de culture pour inactiver la solution de détachement. Recueillir les cellules dans un tube falcon de 50 mL et leur filer à 300 x g pendant 5 min.
    3. Jeter le milieu et remettre en suspension des cellules dans 1 mL de milieu normal frais. Évaluer le nombre de cellules viables avec tache bleu trypan.
    4. Graines de 1 x 106 cellules dans une fiole de nouveau T-75 avec 12 mL de NM préchauffée. La culture des cellules à 37 ° C, 5 % de CO2, 5 % O2 jusqu'à ce qu’ils atteignent une confluence de 80 à 90 %.
      NOTE : Cellule passage (mesures 2.4.1–2.4.4) peut être répétée plusieurs fois, jusqu'à ce que le nombre de cellules requis est obtenu. Ne pas utiliser plus de passage 8 cellules.
  5. Graine de 9 x 104 cellules dans 3 mL de NM (10 % sérum de veau fœtal inactivés par la chaleur, 1 % pénicilline/streptomycine, DMEM) dans chaque puits d’une plaque de 6 puits culture. Incuber les cellules 1 nuit à 37 ° C, 5 % de CO2, 5 % O2.
  6. Le lendemain, aspirer le milieu de culture et d’appliquer 3 mL de milieu de différenciation ostéogénique (OM ; normal additionné à 10-7 M dexaméthasone, β-glycérophosphate de 10 mM et 0,05 mM d’acide ascorbique-2-phosphate).
  7. Placer la plaque de 6 puits avec des cellules dans un incubateur et incuber à 37 ° C, 5 % de CO2, 5 % O2 pendant la nuit.

3. traitement MSCs avec EStim

  1. Le jour, que les cellules sont traitées avec EStim, stériliser les électrodes dans la solution d’éthanol 70 % pendant 30 min ; Ensuite, faites-les sécher sous ultraviolets dans une armoire de sécurité pour un 30 min supplémentaire.
  2. Dans une hotte à flux laminaire, couvrir la plaque de 6 puits contenant les MSCs cultivées avec le couvercle avec des électrodes, en veillant à ce que les électrodes soient complètement immergés dans le milieu (si nécessaire, ajouter moyen). Placer la plaque de 6 puits couverte (EStim chambre) avec les cellules dans l’étuve et brancher son fils à l’alimentation.
  3. Prévoyez l’alimentation à la sortie de charge 2,5 V et traiter les cellules avec EStim pour 1 h3,9.
  4. Après stimulation, couper l’alimentation et retirez la chambre EStim de l’incubateur. Dans des conditions stériles, échanger le couvercle muni d’électrodes avec un couvercle standard des plaques 6 puits.
  5. Remettez les cellules dans l’incubateur et les laisser toute la nuit. Nettoyer les électrodes, tout d’abord avec du PBS, puis avec la solution d’éthanol à 70 %. Nettoyer les produits accumulés à la corrosion de la surface de l’électrode avec papier abrasif fin.
  6. Répétez les étapes 3.1 – 3,5 pour 6 jours consécutifs. Jour 4, avant l’application EStim et dans des conditions stériles, changer le milieu de culture par aspiration 1,5 mL de milieu et son remplacement par 1,5 mL de l’OM préchauffée fraîche.
  7. Après avoir appliqué EStim pendant 7 jours consécutifs, maintenir les cellules en culture pour 7 jours supplémentaires, échangeant le milieu tous les 3-4 jours.

4. des mesures de différenciation ostéogénique

  1. Analyser les changements de morphologie des cellules au microscope.
  2. Afin d’évaluer l’effet de EStim sur MSC différenciation ostéogénique, mesure le dépôt de calcium, phosphatase alcaline et expression du gène marqueur ostéogénique, comme décrits ailleurs3,9.

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Résultats

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Pour évaluer l’effet de 100 mV/mm de EStim sur la différenciation ostéogénique de MSCs, les cellules traitées avec EStim pour 3, 7 et 14 jours ou non-traitées (contrôle) ont été analysées à 14 jours de culture en évaluant les changements morphologiques et le dépôt de calcium (Figure 2 ). Cela a été fait par imagerie de cellules à l’aide de la microscopie lumineuse (changements de morphologie) ou par fixation des cellules en solution à 4 % paraformaldéhyde, le...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous décrivons ici la construction d’une chambre et une méthode pour le traitement des cellules souches mésenchymateuses EStim qui entraîne une différenciation ostéogénique.

L’installation d’EStim présentée ne nécessite pas d’équipement/connaissances particulières et peut être effectuée dans un laboratoire de biologie/biochimie des cellules souches standard de chercheurs débutants. Toutefois, lorsque la construction et à l’aide de la chambre EStim, spécial il faut en quelques étapes critiques....

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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Ce travail a été soutenu en partie par une subvention de démarrage de la Fondation AO (S-14-03 H) et la fondation de Friedrichsheim (Stiftung Friedrichsheim) basé à Francfort/Main, Allemagne.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Estim fabrication
Connecteur banane/Adaptateur JackPoppstars10085542 pièces
Pince coupanteKnipex78 03 125
Alimentation DC (0-30V/0-3A)B& K PrecisionModel 9130BN’importe quel modèle similaire peut être utilisé
Fils flexibles isolés (0,14 mm2)Conrad Electronic International604794, 6040932 pièces
Caoutchouc de silicone non corrosifDow Corning3140 RTV*pourrait être acheté par de nombreux magasins
Platinum Wire (999,5/1000 ; 1mm ø ;)Junker Edelmetalle00D-30100,6 m nécessaire pour 1 chambre Estim
Solution d’éthanol à 70 %toutestérilisation de la chambre Estim Fil de
cuivre revêtu d’argent (0,6 mm ø ;)Conrad Electronic International409334 - 62&asymp ; 70 cm nécessaires pour 1 appareil Estim
Fer à souderSet Conrad Electronic International1611410 - 62N’importe quel modèle similaire peut être utilisé
Couvercle à plaque TPP à 6 puitsSigma-AldrichZ707759-126EA2 couvercles pour chambre Estim
LED circulaires câblées 2,2VConrad Electronic International599525 - 626 pièces
UHU Super colle UHUGmbH & Co. KGn/a*peut être acheté dans de nombreux magasins
MSC culture
&beta ;-Glycérophosphate disodium sel hydrateSigma-AldrichG9422culture cellulaire ostéogénique
DMEM, faible teneur en glucose, supplément GlutaMAX, pyruvateThermo-Fischer Scientific21885025culture cellulaire
DPBS, sans calcium, sans magnésiumThermo-Fischer Culture cellulaire scientifique14190144
DexaméthasoneSigma-AldrichD4902Culture cellulaire ostéogénique
Sérum de bovin fœtalThermo-Fischer Scientific10500064culture cellulaire
50 ml Tube de fauconSarstedt62,547,004culture cellulaire
Acide L-ascorbique Sigma-AldrichA4544culture
Pénicilline/StreptomycinecellulaireThermo-Fischer Scientific15140122
Sprague-Dawley (SD) Cellules souches mésenchymateuses de rat, origine moelle osseuseCyagenRASMX-01001Culture cellulaire
de détachementThermo-Fischer ScientificA1110501culture cellulaire, détachement de cellules
TC Flask, T75Sarstedt833911302culture cellulaire
Plaques TPP 6 puitsSigma-AldrichZ707759-126EAculture cellulaire
Trypan Blue Dye, solution à 0,4Bio-Rad1450021numération cellulaire
cellulaire ostéogénique Culture Solution cellulaire  %

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Mots-clés

Cellules souches m senchymateusesIng nierie du tissu osseuxTraitement par stimulation lectriqueAnalyse du d p t de calciumActivit de la phosphatase alcalineExpression des g nes marqueurs ost og niquesExpression de RunX2Expression d Osterix

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