Ici, nous fournissons un protocole détaillé afin d’isoler les petites vésicules extracellulaires (EVs) de tissus entiers, y compris des échantillons de cerveau et la tumeur. Cette méthode offre une technique reproductible pour extraire les EVs de tissu plein pour approfondir les analyses en aval.
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Article de méthode
Extraction des vésicules extracellulaires du tissu entier
Dans cet article
Résumé
Résumé
Circulation et interstitielles petits extracellulaires vésicules membranaires (EVs) représentent des cibles prometteuses pour le développement de tests de nouveaux biomarqueurs diagnostiques et pronostiques et probablement servent comme des acteurs importants dans la progression d’un vaste éventail de maladies. La recherche actuelle est axée sur la caractérisation des vésicules sécrétées par les cellules multiples et les types de tissus afin de mieux comprennent le rôle des véhicules électriques dans la pathogenèse de conditions, y compris la neurodégénérescence, l’inflammation et le cancer. Cependant, les techniques à l’échelle mondiale cohérentes et reproductibles pour isoler et purifier les vésicules demeurent en cours. En outre, méthodes d’extraction d’EVs de tissu solide ex vivo sont guère décrits. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour extraire l’EVs petits intérêt de tissus entiers frais ou congelés, y compris des échantillons de cerveau et tumeur, pour davantage de caractérisation. Nous avons démontré la capacité d’adaptation de cette méthode pour plusieurs analyses en aval, y compris la microscopie électronique et immunophénotypiques caractérisation des vésicules, ainsi que la spectrométrie de masse quantitative des protéines EV.
Introduction
Petites vésicules extracellulaires (EVs) incluent exosomes dérivés endosomale et petite membrane-hangar microvésicules qui sont d’intérêt biomédical en général. Petits EVs sont composées d’une population hétérogène de 50 à 250 nm membranaires vésicules contenant des protéines biologiquement actives, des lipides et des acides nucléiques qui sont censés collectivement jouent un rôle important dans une multitude de processus morbides. Faire avancer la recherche a impliqué notamment ces vésicules neurodégénératives et maladies à prions, processus infectieux, conditions autoimmunes ou inflammatoires et la croissance tumorale et métastase1,
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Protocole
Cerveau entier ont été obtenus avec l’approbation de l’Institutional Animal Use et soin Comité (IACUC) de l’Université d’Etat de Floride. Un total de douze cerveaux de souris (3 cerveaux de chaque groupe d’âge : 2, 4, 6 et 8 mois) d’un J C57BL/6 fond ont été utilisés pour l’extraction de EV, comme précédemment décrit16. Les échantillons de tumeur pulmonaire ont été généreusement donnés par Dr Mandip Sachdeva sous approbation de la Florida Agricultural and IACUC mécanique de l’université. Tumeurs pulmonaires ont été dérivées de la lignée de cellules d’adénocarcinome humain H1975 cultivé en Balb/c nu/nu nue des souris immunodéficientes. Données p....
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Résultats
Un aperçu schématique de la dissociation tissulaire, centrifugation différentielle et gradient purification des vésicules est affiché à la Figure 1. La confirmation morphologique et immunophénotypiques des EVs purifiés par gradient est mis en évidence dans la Figure 2. Un schéma des densités reproductibles après ultracentrifugation du gradient iodixanol 10 à 30 % est donné, avec deux populations distinctes de vésicules migrent ve.......
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Discussion
Intérêt scientifique s’est dégagé en ce qui concerne les rôles Qu'evs petits jouent dans le microenvironnement de la tumeur, ainsi que dans la fonction, la maturation et le développement de l’orgue. Dans l’ensemble, cette étude fournit un flux de travail optimisé pour l’extraction du SVE intact du cerveau entier ou les échantillons de tumeur. Alors qu’ici nous avons tout simplement démontrer l’applicabilité de cette technique au poumon dérivées de tumeurs SVE, cette méthode pourrait facilement être adaptée pour des trava.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Les auteurs remercient Dr Richard Nowakowski et la Floride état Université laboratoire Animal ressources pour fournir et prendre soin des animaux utilisés afin d’élaborer ce protocole, respectueusement. Nous remercions Liu Xia, Dr Rakesh Singh et la Florida State University translationnelle Science Laboratory d’assistance avec le œuvre de spectrométrie de masse utilisée pour la caractérisation de la vésicule en aval, ainsi que la facilité aus Biological Sciences Imaging Resource l’utilisation du microscope électronique à transmission dans cette étude. Enfin, nous remercions le Dr Mandip Sachdeva (Florida A & M University) pour don des spécimens tumeur utilisés dans le....
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 0,45 et micro ; Filtre m | VWR | 28145-505 | |
| 12 mL tubes à ultracentrifuger | Beckman Coulter | 331372 | |
| 5,5 mL Beckman | Coulter | 344057 | |
| anticorps anti-Alix | Santa Cruz | sc-7129 | |
| anticorps anti-Calnexin | Santa Cruz | sc-11397 | |
| anticorps anti-CD63 | Abcam | ab59479 | |
| anticorps anti-CD81 | Santa Cruz | sc-9158 | |
| anticorps anti-flottilline 2 | Santa Cruz | sc-25507 | |
| anticorps anti-HSC70 | Santa Cruz | sc-7298 | |
| anticorps anti-synténine-1 | Santa Cruz | sc-100336 | |
| anticorps anti-TSG101 | Santa Cruz | sc-7964 | |
| EZQ kit de quantification des protéines | ThermoFisher Scientific | R33200 | |
| FA-45-6-30 rotor ; | Eppendorf | 5820715006 | |
| FEI CM120 Microscope électronique | TSS Microscopie | ||
| chèvre anti-lapin IgG (fragment Fab) | Genetex | 27171 | |
| HALT inhibiteur de phosphatase (solution 100x) | ThermoFisher Scientific | 78420 | |
| Inhibiteur de protéase HALT (solution 100x) | ThermoFisher Scientific | 78438 | |
| Hibernate E medium | ThermoFisher Scientific | A1247601 | |
| MLS-50 rotor à godet oscillant | Beckman Coulter | 367280 | |
| NanoSight LM10 | Malvern | ||
| Optima MAX-XP Ultracentrifugeuse de paillasse ; | Beckman Coulter | 393315 | |
| Optima XE-100 ultracentrifugeuse | Beckman Coulter | A94516 | |
| Optiprep | Sigma | D1556 | 60 % iodixanol en solution d’eau stérile |
| Q Exactive HF Mass Spectrometer ThermoFisher | Scientific | ||
| rabbit anti-goat IgG | Genetex | 26741 | |
| rabbit anti-mouse IgG | Genetex | 26728 | |
| Refracto 30PX (réfractomètre) | Mettler Toledo | 51324650 | |
| S-4-104 rotor | Eppendorf | 5820759003 | |
| SW 41 Ti swinging-bucket Rotor | Beckman Coulter | 333790 | |
| Centrifugeuse de table 5804R | Eppendorf | 22623508 |
Références
- Bobrie, A., Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. Exosome secretion: molecular mechanisms and roles in immune responses. Traffic. 12 (12), 1659-1668 (2011).
- Théry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews Immunology.
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Réimpressions et autorisations
