Induction d’une hépatite auto-immune induite par des médicaments chez des souris BALB/c pour l’étude de ses mécanismes pathogènes

Summary

Nous décrivons un modèle d’hépatite translationnelle d’immunisation in vivo chez des souris BALB/c qui peut être utilisé pour étudier la pathogenèse de l’hépatite auto-immune induite par les médicaments, y compris les différences entre les sexes observées dans cette maladie. Nous décrirons comment ce modèle démontre des analyses reproductibles à l’aide de techniques expérimentales in vivo et in vitro.

Abstract

L’hépatite auto-immune induite par les médicaments (DIH) est le processus d’hypersensibilisation hépatique induit par les médicaments le plus courant observé chez environ 9 à 12% des patients atteints d’hépatite auto-immune. L’écrasante majorité des patients atteints de DIH sont des femmes. Les mécanismes sous-jacents de ces différences de prévalence entre les sexes ne sont pas clairs en raison de la rareté des modèles animaux qui imitent la maladie humaine. Malgré cela, les mécanismes sous-jacents sont largement considérés comme associés aux haplotypes d’antigènes leucocytaires humains et aux hormones sexuelles. En revanche, en utilisant un modèle murin DIH, nous avons découvert que les lymphocytes T CD4+ initiés par l’IL-4 dirigés contre un épitope du cytochrome P450 2E1 induisent un afflux de neutrophiles, de macrophages et de mastocytes dans le foie de souris BALB/c femelles. En utilisant ce modèle, nous avons également montré que les lymphocytes T FoxP3+ régulateurs induits par l’IL-33 confèrent une protection contre le DIH chez les souris femelles et mâles. Ce modèle DIH est induit par l’immunisation de souris avec un épitope de CYP2E1 qui a été modifié de manière covalente avec un métabolite médicamenteux qui a été associé au DIH. Cet épitope est reconnu par les patients atteints de DIH. Notre méthode induit une hépatite robuste et reproductible et des auto-anticorps qui peuvent être utilisés pour étudier la pathogenèse du DIH. Alors que les études in vivo peuvent causer une douleur et une détresse excessives chez la souris lorsqu’elles sont mal effectuées, l’avantage d’un modèle in vivo est la capacité d’évaluer la pathogenèse de la maladie chez un grand nombre de souris. De plus, les effets biologiques des protéines hépatiques altérées peuvent être étudiés à l’aide de procédures invasives. L’ajout d’études in vitro à la conception expérimentale permet une répétition rapide et une analyse mécaniste au niveau cellulaire. Ainsi, nous démontrerons notre protocole modèle et comment il peut être utilisé pour étudier in vivo et in vitro les mécanismes du DIH.

Introduction

Le but de cette méthode est de décrire un modèle murin d’hépatite auto-immune induite par un médicament qui se développe in vivo et de démontrer comment il peut être utilisé pour étudier les bases moléculaires, immunologiques et génétiques de cette maladie. L’objectif à long terme de nos études est de découvrir les mécanismes responsables du développement de l’inflammation chronique du foie et des lésions en étudiant le DIH chez les patients sensibles. Les maladies du foie et la cirrhose constituent la sixième cause de décès chez les adultes âgés de 25 à 64 ans. Le DILI idiosyncratique, parfois appelé hépatite auto-immune induite par les médicaments (DIH), est la troi....

Protocol

Toutes les procédures ont été approuvées par le comité de soins et d’utilisation des animaux.

1. Trifluoroacétylation de protéines cytosoliques hépatiques S-100 ou d’un épitope CYP2E1

REMARQUE: Tout d’abord, préparez l’épitope trifluoroacétylé S100 (TFA-S100) et trifluoroacétylé CYP2E1 (TFA-JHDN5). Parce que les protéines syngéniques S100 sont nécessaires pour les immunisations, et les souris BALB / c sont nécessaires pour produire l’immunogène. La préparation produit une grande quantité d’immunogène; alors, prévoyez d’effectuer cette portion environ quatre fois par an. Une méthode identique sera utilisée pour fabr....

Results

Le calendrier d’immunisation utilisé pour induire le DIH illustré à la figure 1 représente les deux vaccinations requises à la base du cou (jour 0) et à la base de la queue (jour 7). La figure 2 montre des données représentatives sur la prolifération obtenues au jour 14 en utilisant le CFSE en réponse au CYP2E1, au JHDN5, à l’épitope du CYP2E1 et au métabolite trifluoroacétyle (TFA) des anesthésiques. La figure 3 montre la stratégie.......

Discussion

La force de ce protocole réside dans sa reproductibilité; il est donc essentiel de respecter les étapes suggérées. La formulation de l’immunogène peut être une barrière pour certains; cependant, nous avons reproduit notre modèle en utilisant l’épitope décrit dans notre document, ce qui élimine le besoin d’isoler la fraction S100 du foie. Il est probable que des épitopes ou des protéines supplémentaires peuvent être modifiés et induire une hépatite après les vaccinations; cependant, nous décrivons les protéines que nous a.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,1 % 2,4,6-trinitrobenzène sulfonique (TNBS)	ThermoFisher	28997
AKP Substrate Kit	BioRad	172-1063
souris BALB/c	Jackson
CellTrace&trade ; CFSE Kit de prolifération cellulaire	ThermoFisher	C34554
CFA H37Ra	Becton Dickinson (Difco Bacto)	231131
FcR Réactif bloquant	Milteyi	130-092-575
Complément général	ThermoFisher	HPRG770
HepaRG&trade ; cellules cryoconservées	ThermoFisher	HPR GC10
Live/Dead Fixable Kit de coloration Aqua Dead Cells  ;	ThermoFisher	L34965
NaHC03	Millipore Sigma	S5761
Percoll® ;	Millipore Sigma	P1644-1L
Liste des	toxines de la coqueluche	Produits biologiques 180
Phosphate Tamponné Saline pH 7,4	Divers
Pierce&trade ; Mini comprimés inhibiteurs de protéase, sans EDTA	ThermoFisher	88666
Hydroxyde de potassium	JT Baker	3140-01
S-éthyltrifluorothioacétate (S-ETFA)	Cassettes de dialyse Millipore Sigma	177474
Slide-a-lyzer (10 K, 12 ml)	ThermoFisher	66810
UltraPure&trade ; Solution SDS, 10 %	ThermoFisher	24730020
Williams Media E, sans rouge de phénol	ThermoFisher	A1217601