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Article de méthode

Induction d’une hépatite auto-immune induite par des médicaments chez des souris BALB/c pour l’étude de ses mécanismes pathogènes

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DOI :

10.3791/59174

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29 mai 2020

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1Department of Anesthesiology and Critical Care Medicine, Johns Hopkins University, 2Department of Pediatrics and Pathology, Johns Hopkins University

Dans cet article

Résumé

Nous décrivons un modèle d’hépatite translationnelle d’immunisation in vivo chez des souris BALB/c qui peut être utilisé pour étudier la pathogenèse de l’hépatite auto-immune induite par les médicaments, y compris les différences entre les sexes observées dans cette maladie. Nous décrirons comment ce modèle démontre des analyses reproductibles à l’aide de techniques expérimentales in vivo et in vitro.

Résumé

L’hépatite auto-immune induite par les médicaments (DIH) est le processus d’hypersensibilisation hépatique induit par les médicaments le plus courant observé chez environ 9 à 12% des patients atteints d’hépatite auto-immune. L’écrasante majorité des patients atteints de DIH sont des femmes. Les mécanismes sous-jacents de ces différences de prévalence entre les sexes ne sont pas clairs en raison de la rareté des modèles animaux qui imitent la maladie humaine. Malgré cela, les mécanismes sous-jacents sont largement considérés comme associés aux haplotypes d’antigènes leucocytaires humains et aux hormones sexuelles. En revanche, en utilisant un modèle murin DIH, nous avons découvert que les lymphocytes T CD4+ initiés par l’IL-4 dirigés contre un épitope du cytochrome P450 2E1 induisent un afflux de neutrophiles, de macrophages et de mastocytes dans le foie de souris BALB/c femelles. En utilisant ce modèle, nous avons également montré que les lymphocytes T FoxP3+ régulateurs induits par l’IL-33 confèrent une protection contre le DIH chez les souris femelles et mâles. Ce modèle DIH est induit par l’immunisation de souris avec un épitope de CYP2E1 qui a été modifié de manière covalente avec un métabolite médicamenteux qui a été associé au DIH. Cet épitope est reconnu par les patients atteints de DIH. Notre méthode induit une hépatite robuste et reproductible et des auto-anticorps qui peuvent être utilisés pour étudier la pathogenèse du DIH. Alors que les études in vivo peuvent causer une douleur et une détresse excessives chez la souris lorsqu’elles sont mal effectuées, l’avantage d’un modèle in vivo est la capacité d’évaluer la pathogenèse de la maladie chez un grand nombre de souris. De plus, les effets biologiques des protéines hépatiques altérées peuvent être étudiés à l’aide de procédures invasives. L’ajout d’études in vitro à la conception expérimentale permet une répétition rapide et une analyse mécaniste au niveau cellulaire. Ainsi, nous démontrerons notre protocole modèle et comment il peut être utilisé pour étudier in vivo et in vitro les mécanismes du DIH.

Introduction

Le but de cette méthode est de décrire un modèle murin d’hépatite auto-immune induite par un médicament qui se développe in vivo et de démontrer comment il peut être utilisé pour étudier les bases moléculaires, immunologiques et génétiques de cette maladie. L’objectif à long terme de nos études est de découvrir les mécanismes responsables du développement de l’inflammation chronique du foie et des lésions en étudiant le DIH chez les patients sensibles. Les maladies du foie et la cirrhose constituent la sixième cause de décès chez les adultes âgés de 25 à 64 ans. Le DILI idiosyncratique, parfois appelé hépatite auto-immune induite par les médicaments (DIH), est la troisième cause la plus fréquente d’insuffisance hépatique aiguë aux États-Unis. Le DIH est le processus d’hypersensibilisation hépatique induit par les médicaments le plus courant observé chez environ 9 à 12% des patients atteints d’hépatiteauto-immune 1. L’écrasante majorité des patients atteints de DIH sont des femmes 2,3,4. Un type de DIH se développe chez les personnes sensibles après l’administration d’anesthésiques volatils halogénés tels que l’isoflurane, le sévoflurane, le desflurane ou l’halothane. Ces anesthésiques se lient de manière covalente aux protéines hépatiques avec des produits réactifs de leur métabolisme, créant ainsi de nouveaux autoantigènes capables de provoquer des réponses allergiques ou auto-immunes5.

L’étude des mécanismes pathogènes impliqués dans le développement de l’anesthésique et de toute forme de DIH a déjà été entravée par l’absence d’un modèle animal qui imite étroitement l’induction de la maladie humaine. Nous avons développé un modèle murin expérimental de DIH avec des caractéristiques ressemblant à DILI à médiation immunitaire chez les patients. L’hépatite est induite par l’immunisation avec l’un des deux autoantigènes qui ont été modifiés de manière covalente par le métabolite du chlorure de trifluoroacétyle (TFA) qui se forme à la suite du métabolisme oxydatif de l’anesthésique par l’enzyme cytochrome P450 2E1 (CYP2E1)5. Un autoantigène est la fraction hépatique cytosolique hépatique S100, qui est un mélange de plusieurs protéines6, et le second autoantigène est un épitope du CYP2E1 qui est reconnu par les sérums de patients atteints de DILI7 à médiation immunitaire anesthésique. En utilisant des souris BALB/c, qui sont relativement résistantes à l’hépatite auto-immune expérimentale, nous distinguons notre modèle du modèle d’immunisation induite par S100 de l’hépatite auto-immune chez les souris C57Bl/6J8.

En raison de ses diverses présentations cliniques, le DIH est difficile à étudier chez les patients. Les modèles expérimentaux translationnels offrent la possibilité d’évaluer la pathogenèse de la maladie in vivo et in vitro. À l’heure actuelle, il n’existe pas d’autres méthodes alternatives pour induire le DIH qui examinent pleinement in vivo ou in vitro les réponses immunitaires adaptatives ou innées sans l’utilisation d’animaux. De plus, étant donné que la trifluoroacétylation du S-100 ou de l’épitope CYP2E1 ne semble pas produire d’immunogène irritant et que nous induisons le DIH par immunisation avec des protéines altérées par le TFA, ces animaux ne recevront pas d’éther, d’anesthésique halogéné, de barbiturique ou d’alcool avant l’immunisation ou d’autres procédures, étant donné que ces agents peuvent modifier les paramètres que nous étudions. Malgré cela, nous avons réduit notre utilisation de souris en utilisant la simulation informatique pour confirmer les préférences de liaison de notre épitope9 CYP2E1 découvert et avons reflété le DIH humain impliquant le sexe féminin en démontrant que les souris FEMELLES BALB / c développent un DIH10 plus sévère.

Malgré les diverses présentations du DIH chez les patients et les défis dans l’étude de la maladie clinique, la modification post-traductionnelle des protéines natives par les métabolites réactifs des médicaments est un mécanisme clé accepté dans la pathogenèse DIH qui suit les anesthésiques halogénés11. Les chercheurs admettent également que le CYP2E1 est un autoantigène majeur dans ce processus12,13. Le rôle des lymphocytes T CD4+régulés à la hausse par l’interleukine (IL)-4 qui reconnaissent un CYP2E1 modifié post-traductionnellement et d’autres protéines hépatiques est un initiateur accepté du DIH anesthésique en attirant les neutrophiles, les éosinophiles et les mastocytes dans le foie14, et ce mécanisme a été confirmé dans de nombreuses formes de DIH15,16. Les lymphocytes T CD4+CD25+T (Tregs) exprimant FoxP3 induits réduisent la gravité de la DIH, et les déficiences relatives de ces cellules dans la rate aggravent la DIH 10,7. Ainsi, la majorité des progrès dans la compréhension du DIH ont été rendus possibles en utilisant des modèles murins in vivo pour évaluer les mécanismes génétiques, métaboliques et immunologiques du DIH in vivo et in vitro.

Étant donné que nous et d’autres chercheurs avons découvert des rôles pour l’IL-4, les neutrophiles et les éosinophiles dans l’initiation du DIH en utilisant différents modèles murins, nous pensons que cette observation appuie notre affirmation selon laquelle, quel que soit le modèle DIH utilisé, l’hépatite et les blessures sont induites par l’IL-4. La force de notre protocole réside dans l’utilisation de la méthodologie in vivo, à la fois des souris mâles et femelles, et la répétition de l’histologie, des tests de prolifération des lymphocytes T CD4+ et des cytokines. La force de notre utilisation des études in vitro est qu’elles réduisent le nombre de souris nécessaires tout en fournissant la méthodologie pour isoler les interactions cellulaires qui conduisent au DIH. Nous recommandons l’utilisation de souris mâles et femelles, car cela réduit la possibilité de biais inconscients dans l’interprétation des résultats et renforce le potentiel de traduction de nos études puisque l’incidence, la prévalence et la gravité du DIH sont plus élevées chez les femmes17. Nous recommandons que les souris soient obtenues auprès d’un seul fournisseur; toutefois, si cela n’est pas possible, procurez-vous des témoins de compagnons de litière ou des souris de type sauvage auprès du même fournisseur que les souris génétiquement modifiées.

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Protocole

Toutes les procédures ont été approuvées par le comité de soins et d’utilisation des animaux.

1. Trifluoroacétylation de protéines cytosoliques hépatiques S-100 ou d’un épitope CYP2E1

REMARQUE: Tout d’abord, préparez l’épitope trifluoroacétylé S100 (TFA-S100) et trifluoroacétylé CYP2E1 (TFA-JHDN5). Parce que les protéines syngéniques S100 sont nécessaires pour les immunisations, et les souris BALB / c sont nécessaires pour produire l’immunogène. La préparation produit une grande quantité d’immunogène; alors, prévoyez d’effectuer cette portion environ quatre fois par an. Une méthode identique sera utilisée pour fabriquer le TFA-JHDN5. L’épitope CYP2E1 (JHDN5), GII / FNN / GPT / WKD / IRR / FSL / TTL, peut être séquencé ou acheté.

  1. Isolement de la fraction S100 du foie.
    1. Après une sédation de 5 à 10 souris BALB/c avec 40 à 60 mg/kg de kétamine mélangée à 4 à 6 mg/kg de xylazine, confirmez la bonne profondeur de l’anesthésie en observant une réduction du tonus musculaire et aucune réponse aux stimuli douloureux, tels qu’un pincement des orteils (réflexe de sevrage), en plus de la perte des réflexes de redressement et de la perte des réflexes palpébraux.
    2. À l’aide de ciseaux microchirurgicaux, exposez le contenu intra-abdominal à l’aide d’une incision médiane et faites une petite coupure dans la veine cave inférieure pour enlever le sang.
    3. Placez un angiocathéter de calibre 24 dans la veine porte et perfuser le foie 10 mL/min avec 40 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pH 7,4 dans un bain-marie à 4 °C. Retirez et pesez les foies groupés et coupez-les en petits morceaux (10 à 15 mm).
      REMARQUE: L’euthanasie est induite par injection intrapéritonéale de kétamine / xylazine supplémentaire (80 mg / kg: 8 mg / kg), suivie d’une luxation cervicale et de l’ouverture de la cavité thoracique pour effondrer les poumons. Cette méthode fournit le moins de douleur et d’inconfort aux animaux. Cette méthode est conforme aux recommandations du groupe scientifique sur l’euthanasie de l’American Veterinary Medical Association.
    4. Ajouter 4 fois le poids du tampon d’homogénéisation saccharose (250 mM) -TRIS (10 mM)- EDTA (1 mM) (pH 7,4) complété par des comprimés cocktails inhibiteurs de protéase complète (voir tableau des matériaux) conformément aux recommandations du fabricant. Homogénéiser dans un tube de polypropylène de 15 mL, à l’aide d’un homogénéisateur tissulaire de laboratoire général à vitesse moyenne sur glace jusqu’à consistance lisse. Homogénéiser sur la glace pour éviter que les tissus ne deviennent chauds pendant l’homogénéisation.
    5. Centrifuger les homogénats du foie à 1500 x g pendant 10 min, puis verser le surnageant. Centrifuger le surnageant pendant 1 h à 100 000 x g. Congelez le surnageant et conservez-le à -80 °C. Le surnageant est le cytosolique S-100.
  2. Trifluoroacétylation de S100 et JHDN5
    REMARQUE: La trifluoroacétylation des groupes ε-amino des résidus de lysine de S-100 sera effectuée selon la procédure de Satoh18. Toutes les parties de cette expérience, à l’exception des derniers jours de dialyse, sont effectuées dans la hotte.
    1. Déterminer la concentration totale en protéines du cytosolique S-100 à l’aide du dosage de l’acide bicinchoninique (test BCA)7. Diluer 20 mg de BALB/c souris S100 ou JHDN5 à 10 mL avec dH2O dans une fiole d’Erlenmeyer de 50 mL. Ajustez le pH à 10 avec 1N KOH.
    2. Ajouter 4,7 mmole de S-éthyltrifluorothioacétate (S-ETFA), à la solution. Maintenez le pH entre 9,9 et 10,0 avec 1N KOH en administrant KOH sous forme de gouttelettes pendant environ 1 h. Enregistrez le volume total de KOH pour chaque réaction.
    3. Transférer les solutions dans des cassettes de dialyse séparées (ne pas trop remplir). Dialyze les cassettes pendant 72 h contre 4 L de dH2O avec trois changements par jour. Après la dialyse, enregistrez le volume final de TFA-S100 ou TFA-JHDN5, puis aliquote dans des tubes étiquetés. Congeler et conserver à –80 °C.
    4. Une concentration estimée est déterminée en divisant la quantité initiale de S100 ou de JHDN5 (en mg) par le volume final après dialyse (mL). Pour déterminer le pourcentage de modification de la protéine native19, diluer 1,0 mg de chaque protéine native et altérée par le TFA (si la concentration finale est supérieure à 1,0 mg) à 1,0 mL avec dH2O dans des tubes à balles séparés et préparer un blanc en utilisant 1,0 mL dH2O. Si la concentration de la protéine altérée par le TFA est inférieure à 1,0 mg, ne pas diluer
      1. Pour séparer les puits d’une plaque de 96 puits, ajoutez 50 μL de protéines vierges, natives et altérées. Ajouter 50 μL de NaHCO3 à 4 % suivi de 50 μL d’acide sulfonique 2,4,6-trinitrobenzène à 0,1 %.
      2. Incuber la plaque à 40 °C pendant 2 h. Après l’incubation, ajouter 50 μL de FDS à 10 % à chaque puits, suivi de 25 μL de 1N HCl.
      3. Lire à OD de 334 nm, puis enregistrer l’absorbance de chaque composé de 200 à 600 nm afin de confirmer la baisse caractéristique de l’absorbance à 334 nm. Calculer le pourcentage de modification des résidus de lysine par TFA, en utilisant la formule suivante:
        figure-protocol-1

2. Immunisation des souris pour induire l’hépatite

REMARQUE: Le DIH est modélisé chez les souris BALB / c par des immunisations avec des protéines cytosoliques hépatiques qui ont été modifiées de manière covalente par le chlorure de trifluoracétyle (TFA), un métabolite médicamenteux modèle, TFA-S1006 ou un épitope du CYP2E1 modifié de manière covalente par TFA9, TFA-JHDN5 qui induit l’hépatite, les cellules T autoréactives et les auto-anticorps CYP2E1. Les souris présentent une phase d’activation splénique 2 semaines après l’immunisation initiale et une phase hépatique de 3 semaines caractérisée par une inflammation granulocytaire. Les souris femelles BALB/c sont plus sensibles que les mâles à l’hépatite dans ce modèle.

  1. Le jour 0, immuniser par voie sous-cutanée 6 à 8 souris BALB/c âgées de 6 à 8 semaines à la base du cou avec 200 μg de TFA-S100 ou 100 μg de TFA-JHDN5 émulsionnés en volumes égaux d’adjuvant de Freund complet (CFA). Le jour 0, immunisez les souris avec 50 ng de toxine de la coqueluche, par voie intramusculaire dans l’une des pattes postérieures. Le jour 7, immuniser les souris par voie sous-cutanée à la base de la queue avec 200 μg de TFA-S100 ou 100 μg de TFA-JHDN5 émulsionnés en volumes égaux de CFA pour s’assurer que chaque souris reçoit deux injections du même immunogène.
    REMARQUE: Les souris sont surveillées toutes les heures pendant les 6 premières heures suivant l’immunisation, puis au moins deux fois par jour pendant une semaine. Si les souris présentent des signes de douleur ou de détresse, tels qu’une posture voûtée ou une fourrure ébouriffée, les analgésiques doivent être administrés conformément à l’ACUC local. Si une douleur ou une détresse importante est notée, les souris doivent être évaluées par un vétérinaire pour déterminer si l’euthanasie est nécessaire.
  2. Détermination des réponses immunitaires des lymphocytes T CD4+ aux auto-protéines entières, aux épitopes des auto-protéines ou à l’haptène TFA à l’aide de la cytométrie en flux
    1. Après la sédation de souris avec 40-60 mg / kg de kétamine mélangée à 4-6 mg / kg de xylazine par injection intrapéritonéale, confirmez la profondeur appropriée de l’anesthésie comme décrit à l’étape 1.1.1, puis identifiez la rate après avoir exposé la cavité intra-abdominale à l’aide de ciseaux microchirurgicaux. Couper la rate au niveau du pédicule et placer dans une boîte de Pétri avec du PBS/2% de sérum de veau fœtal (FCS).
      REMARQUE: L’euthanasie sera induite chez la souris par injection intrapéritonéale de kétamine / xylazine supplémentaire (80 mg / kg: 8 mg / kg), suivie d’une luxation cervicale et de l’ouverture de la cavité thoracique pour effondrer les poumons. Cette méthode fournit le moins de douleur et d’inconfort aux animaux. Cette méthode est conforme aux recommandations du groupe scientifique sur l’euthanasie de l’American Veterinary Medical Association.
    2. Libérez les cellules à l’aide de lames en verre dépoli et transférez-les dans un tube conique en polypropylène de 50 mL. Laver avec PBS/2% FCS en portant le volume à 50 mL et en centrifugant à 335 x g à l’aide d’une centrifugeuse réfrigérée de paillasse. Versez le surnageant et répétez cette étape.
    3. Retirez les globules rouges à l’aide de 1 mL de tampon ACK Lysing pendant 1 min et portez le volume jusqu’à 50 mL avec PBS/2% FCS. Centrifuger à 335 x g et verser le surnageant.
    4. Comptez les cellules. Étiquetez les cellules avec cfSE pendant 30 minutes sur de la glace dans l’obscurité, conformément aux instructions du fabricant. Suspendre les suspensions à cellule unique dans 6 plaques de puits de 3x106 cellules/mL par puits en PBS/2% FCS.
    5. Stimuler les cellules marquées avec du CYP2E1, du JHDN5 ou du TFA-OVA (10 μg/mL) pendant 72 h à 37 °C dans 5 % de CO2, 95 % d’air (humidifié). Après l’incubation, colorer les cellules avec CD4-APC (1:100) pendant 30 min sur de la glace et analyser par cytométrie en flux dans les 3 jours.
    6. Utilisez la stratégie de contrôle suivante pour identifier les cellules CD4+CFSE+ : Les cellules CD4+CFSE+ seront identifiées à partir des cellules vivantes fermées et affichées sous forme d’histogrammes de cellules proliférantes.
  3. Isolement des cellules immunitaires infiltrantes de souris immunisées.
    1. Pour isoler les cellules immunitaires infiltrantes dans le foie le jour 14 ou le jour 21, anesthésier les souris par injection intrapéritonéale avec 40-60 mg / kg de kétamine mélangée à 4-6 mg / kg de xylazine et confirmer la profondeur appropriée de l’anesthésie comme décrit à l’étape 1.1.1. Après laparotomie à l’aide d’une incision médiane faite avec des ciseaux micro chirurgicaux comme décrit au point 1.1.2, canulez la veine porte avec une aiguille de calibre 25, puis coupez la veine cave inférieure sous les veines rénales.
    2. Perfuser chaque foie à un débit de 10 mL/min avec 40 mL de PBS dans un bain-marie à 37 °C. Après perfusion, à l’aide de ciseaux micro chirurgicaux, coupez le foie au niveau du pédicule hépatique, retirez la vésicule biliaire, puis coupez le foie au niveau du hile.
    3. Perturbez le foie sur un tamis en acier inoxydable à mailles à l’aide d’un pilon de seringue stérile de 20 mL et de PBS froid. Filtrer la suspension cellulaire résultante dans des tubes centrifugeux pré-stérilisés de 50 mL à l’aide d’un écran de 300 mailles. Porter chaque suspension à 50 mL à l’aide de PBS froid, puis laver la suspension par centrifugation pendant 10 min à 370 x g.
    4. Jeter le surnageant, puis regrouper chaque pastille par traitement dans de nouveaux tubes de 50 mL (un tube par souris est recommandé; cependant, si les échantillons sont regroupés, 2 à 4 pastilles / tube sont recommandés). Suspendre les granulés regroupés dans 45 mL de Percoll 35 % (en PBS) et 100 UI/mL d’héparine.
    5. Faire tourner chaque tube à 500 x g pendant 10 min à 20 °C. Jeter le surnageant et suspendre la pastille dans 5 mL de PBS, puis ajouter 1 mL de tampon de lysage ACK à chaque pastille pendant 10 min sur glace.
    6. Porter chaque tube à 50 mL avec PBS et laver par centrifugation pendant 10 min à 370 x g. Jeter le surnageant puis laver les cellules avec PBS/2% FCS par centrifugation pendant 10 min à 370 x g. Comptez les cellules.
    7. Analyse du type cellulaire par cytométrie en flux
      REMARQUE: Voici un exemple de la façon dont foxp3 + Tregs induits peuvent être détectés.
      1. Incuber 1x106 cellules avec un réactif bloquant FcR et tacher avec des dilutions 1:100 de CD4-FITC, CD25-PE et CD45-PerCP pendant 30 min sur glace. Ensuite, colorez les cellules intracellulairement avec FoxP3-APC.
      2. Fixer les cellules avec 250 μL de tampon de fixation (voir Tableau des matériaux), et les conserver à 4 °C jusqu’à analyse par cytométrie en flux dans les 3 jours.
      3. La stratégie de contrôle suivante est recommandée afin de détecter les Foxp3+ Tregs induits dans des suspensions unicellulaires du foie, de la rate ou des ganglions lymphatiques à l’aide de la cytométrie en flux: Identifier les cellules vivantes à l’aide du kit de coloration Aqua Dead Cell réparable vivant / mort. Ensuite, la porte sur les cellules hépatiques qui sont CD45+ (PerCP, clone RA3-6B2), et la porte CD4+ cellules (FITC, cloneGK1.5) de la porte CD45+. À partir des cellules CD4+, identifiez les pourcentages de cellules CD25+ (PE, clone 7D4) et FoxP3+ (APC, clone 3G3).
  4. Analyse histologique des tissus hépatiques pour l’hépatite
    1. Le jour 21, fixez les sections hépatiques (5 μm d’épaisseur) dans du formol tamponné neutre à 10% et tachez avec de l’hématoxyline et de l’éosine.
    2. Déterminez les scores histologiques en premier à faible puissance (40X) dans une moyenne de 2 vues et confirmez à 64X. Noter les coupes de tissu comme suit: Grade 0 = pas d’inflammation ou de nécrose; Grade 1 = inflammation lobulaire mineure sans nécrose; Grade 2 = inflammation lobulaire impliquant <50% de la section; Grade 3 = inflammation lobulaire impliquant ≥ 50% de la section; et Grade 4 = inflammation avec nécrose.
  5. Détermination des taux de cytokines tissulaires dans la rate et le foie.
    1. Le jour 14 ou le jour 21, homogénéiser les échantillons de foie ou de rate (1 g) de chaque souris dans 1 mL de RPMI/2% FCS jusqu’à consistance lisse à l’aide d’un homogénéisateur de laboratoire général en milieu. Gardez l’échantillon au froid sur la glace.
    2. Centrifuger l’homogénat pendant 15 min à 1455 x g à 4 °C à l’aide d’une centrifugeuse de bureau réfrigérée. Congelez le surnageant et conservez-le à -80 °C jusqu’à ce qu’il soit prêt à l’emploi. Les niveaux de cytokines et de chimiokine peuvent être mesurés avec des kits ELISA commerciaux, conformément aux instructions du kit. Normaliser les niveaux de cytokines en convertissant les niveaux (en mL ou μL) en pg/g de tissu.
  6. Détection d’anticorps sériques dirigés contre le CYP2E1, l’épitope JHDN5 du CYP2E1 et le métabolite médicamenteux TFA.
    1. Les jours 14 ou 21, sédez les souris avec 40-60 mg / kg de kétamine mélangée à 4-6 mg / kg de xylazine. Confirmer la bonne profondeur de l’anesthésie en observant une réduction du tonus musculaire et aucune réponse aux stimuli douloureux, tels qu’un pincement de l’orteil (réflexe de retrait), en plus de la perte des réflexes de redressement et de la perte des réflexes palpébraux. Utilisez une aiguille de 25 G attachée à une seringue de tuberculine et approchez-vous du cœur en avançant lentement l’aiguille dans la cavité thoracique sous les côtes et immédiatement latéralement au processus xiphoïde. Prélever du sang par ponction intracardiaque.
    2. Une fois le sang recueilli, laissez-le coaguler à température ambiante. Centrifuger les échantillons de sang à 295 x g pendant 20 min à température ambiante. Retirez soigneusement le sérum, aliquotez le sérum et congelez à -20 °C.
    3. Appliquer 100 μL d’antigènes d’essai CYP2E1, JHDN5 ou TFA-ovalbumine (OVA) (5 μg/mL dans pbS) sur 96 plaques de puits pendant au moins 18 h à 4 °C pendant la nuit. Le lendemain, lavez les plaques avec un tampon de lavage (PBS/2% FCS), 2 cycles (4 lavages chacun).
    4. Appliquer 100 μL de sérum de souris (1:100) dans PBS/2% FCS en triple exemplaire sur les plaques et incuber à température ambiante pendant 2 h. Après 2 h, laver les plaques avec un tampon de lavage comme décrit à l’étape 2.6.2.
    5. Ajouter 100 μL d’IgG anti-souris phosphatase alcaline (AKP)-chèvre IgG, IgG1 anti-souris AKP-rat ou IgG2a anti-souris AKP-rat (1:1000) pendant 2 h suivi d’une étape de lavage de 1 cycle avec tampon de lavage et 1 cycle avec PBS. Détectez les anticorps à l’aide d’un kit de substrat AKP et mesurez à OD 405 nm toutes les 15 minutes avec un spectrophotomètre. L’AGT se développe généralement complètement en 15 min tandis que le CYP2E1 et l’épitope du CYP2E1 peuvent se développer de 30 à 60 min7.
  7. Études du développement du stress oxydatif induit par les IgG JHDN5 in vitro.
    1. À l’aide de 12 plaques de puits, incuber 106 cellules hépatiques différenciées en phase terminale par puits sur des feuillets de couverture recouverts de fibronectine dans 1000 μL de milieu Williams E complétés par de la glutamine et un supplément général (voir tableau des matériaux) à 37 °C, 5 % de CO2, 95 % d’humidité pendant 7 jours comme recommandé pour maximiser l’activité du CYP2E1.
    2. Ajouter JHDN5 IgG (1:40) ou IgG de souris (1:1000) pour séparer les puits et incuber pendant 2 h à 37 °C, 5 % de CO2, 95 % d’humidité. Le sérum d’hybridome était très dilué. Ajouter un détecteur d’anticorps fluorescents rouge foncé (voir tableau des matériaux) pendant 30 minutes supplémentaires à tous les puits.
    3. Lavez les puits 3x avec 1 mL de PBS dans l’obscurité. Fixez les cellules dans du formaldéhyde à 3,7% pendant 10 min. Examen par microscopie confocale dans les 24 heures.
  8. Études de colocalisation de JHDN5 IgG avec des organites intracellulaires tels que les mitochondries in vitro.
    1. Pour démontrer la colocalisation de JHDN5 IgG avec les mitochondries, la culture de cellules hépatiques différenciées en phase terminale (~ 30% de confluence) sur des feuillets de couverture recouverts de fibronectine pendant 7 jours dans le milieu E de Williams sans colorant complété comme décrit à l’étape 2.7.
    2. Après avoir déterminé les longueurs d’onde d’absorption correctes, ajoutez la fluorescence verte, IgG ou JHDN-5 (1:100) et la souris fluorescente rouge, 594 conjugués Mito-tracker Rouge (1:100) pendant 2 h (37 °C), 5% de CO2, 95% d’humidité.
    3. Montez des couvercles recouverts de fibronectine marqués avec un réactif anti-décoloration avec DAPI et examinez par microscopie confocale.

3. Notes générales sur le protocole

  1. Utilisez des outils de qualité non pharmaceutique lorsque les composés ne sont pas disponibles dans une formulation à usage clinique. Cependant, procurez-vous chacun de ces outils auprès de fournisseurs commerciaux fiables identifiés dans cette méthode. Utilisez toujours des produits chimiques conformes aux spécifications définies par le Committee on Analytical Reagents de l’American Chemical Society d’au moins le niveau de qualité du réactif. Pour nos méthodes, utilisez des réactifs de niveau de qualité analytique dans la mesure du possible.
  2. Suivre une technique aseptique stricte pour la formulation des protéines altérées par l’AGT afin de prévenir la contamination qui pourrait nuire au bien-être des animaux ou à l’interprétation des données.
  3. Stockez et utilisez des formulations de qualité non pharmaceutique à des durées pendant lesquelles la formulation restera puissante, selon les informations techniques disponibles. Conserver le CFA à température ambiante, le CYP2E1 et ses épitopes à -20 ou -80 °C. Conserver les protéines altérées par le TFA à -80 °C et laisser atteindre 4 °C avant l’émulsification avec le CFA. Conserver les protéines altérées par le TFA à -80 °C et les conserver dans des aliquotes afin d’éviter la répétition des cycles de gel-décongélation.

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Résultats

Le calendrier d’immunisation utilisé pour induire le DIH illustré à la figure 1 représente les deux vaccinations requises à la base du cou (jour 0) et à la base de la queue (jour 7). La figure 2 montre des données représentatives sur la prolifération obtenues au jour 14 en utilisant le CFSE en réponse au CYP2E1, au JHDN5, à l’épitope du CYP2E1 et au métabolite trifluoroacétyle (TFA) des anesthésiques. La figure 3 montre la stratégie...

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Discussion

La force de ce protocole réside dans sa reproductibilité; il est donc essentiel de respecter les étapes suggérées. La formulation de l’immunogène peut être une barrière pour certains; cependant, nous avons reproduit notre modèle en utilisant l’épitope décrit dans notre document, ce qui élimine le besoin d’isoler la fraction S100 du foie. Il est probable que des épitopes ou des protéines supplémentaires peuvent être modifiés et induire une hépatite après les vaccinations; cependant, nous décrivons les protéines que nous a...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Le Dr Njoku tient à remercier le Dr Noel R. Rose, MD PhD, pour ses conseils et ses discussions perspicaces qui ont abouti à la formulation de ce modèle.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,1 % 2,4,6-trinitrobenzène sulfonique (TNBS)ThermoFisher28997
AKP Substrate KitBioRad172-1063
souris BALB/cJackson
CellTrace&trade ; CFSE Kit de prolifération cellulaireThermoFisherC34554
CFA H37RaBecton Dickinson (Difco Bacto)231131
FcR Réactif bloquantMilteyi130-092-575
Complément généralThermoFisherHPRG770
HepaRG&trade ; cellules cryoconservéesThermoFisherHPR GC10
Live/Dead Fixable Kit de coloration Aqua Dead Cells  ;ThermoFisherL34965
NaHC03Millipore SigmaS5761
Percoll® ;Millipore SigmaP1644-1L
Liste destoxines de la coquelucheProduits biologiques 180
Phosphate Tamponné Saline pH 7,4Divers
Pierce&trade ; Mini comprimés inhibiteurs de protéase, sans EDTAThermoFisher88666
Hydroxyde de potassiumJT Baker3140-01
S-éthyltrifluorothioacétate (S-ETFA)Cassettes de dialyse Millipore Sigma177474
Slide-a-lyzer (10 K, 12 ml)ThermoFisher66810
UltraPure&trade ; Solution SDS, 10 %ThermoFisher24730020
Williams Media E, sans rouge de phénolThermoFisherA1217601

Références

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