Collection de souffle auprès des enfants pour la découverte de biomarqueurs de la maladie

Résumé

Ce protocole décrit une méthode simple pour l’acquisition d’échantillons d’haleine auprès des enfants. Brièvement, des échantillons d’air mélangé se concentrent avant dans tubes absorbants avant l’analyse de la chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse. Biomarqueurs de souffle des maladies infectieuses et non infectieuses peuvent être identifiés à l’aide de cette méthode de collecte de souffle.

Résumé

Analyse et air expiré peuvent être utilisés pour découvrir des biomarqueurs volatiles dans un certain nombre de maladies infectieuses et non infectieuses, comme le paludisme, la tuberculose, le cancer du poumon et une maladie du foie. Ce protocole décrit une méthode reproductible d’échantillonnage souffle chez les enfants et ensuite stabiliser les échantillons d’haleine pour analyse par chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse (GC-MS). L’objectif de cette méthode est d’établir un protocole standardisé pour l’acquisition d’échantillons d’haleine pour analyse chimique, auprès d’enfants âgés de 4 à 15 ans. Tout d’abord, le souffle est échantillonné à l’aide d’un embout en carton attaché à une vanne 2 voies, qui est reliée à un sac de 3 L. Haleine analytes sont ensuite transférées dans un tube de désorption thermique et stockés à 4-5 ° C jusqu'à l’analyse. Cette technique a servi antérieurement pour capturer le souffle des enfants atteints de paludisme pour l’identification de biomarqueurs souffle réussie. Par la suite, nous avons appliqué avec succès cette technique aux cohortes pédiatriques supplémentaires. L’avantage de cette méthode est qu’il exige une coopération minimale de la part du patient (d’une valeur particulière dans les populations pédiatriques), dispose d’un délai court collection, ne nécessite pas de personnel formé et peut être effectuée avec des appareils portatifs en paramètres de champ de ressources limitées.

Introduction

Biomarqueurs peuvent donner des informations précieuses sur des processus biologiques normaux et pathologiques qui peuvent contribuer à la maladie cliniquement identifiable. Récemment, on constate un intérêt croissant dans l’évaluation des substances volatiles souffle comme biomarqueurs pour une variété d’états pathologiques, y compris l’infection, troubles métaboliques et cancer ¹. Air expiré contient des niveaux quantifiables de composés organiques volatils (COV), les composés organiques semi-volatils et matériel microbienne dérivée (p. ex., les acides nucléiques des bactéries et des virus). L’objectif central de l’analyse de l’air expiré est de mieux comprendre l’état d’une condition médicale et/ou expositions environnementales non invasive. Il existe diverses méthodes pour recueillir et d’analyser l’air expiré, selon les constituants d’intérêt. Il n’existe actuellement aucune méthode de collecte normalisés air expiré, qui complique l’analyse comparative des résultats entre les études. Normalisation des procédures de collecte de souffle est essentiel, car la procédure d’échantillonnage lui-même a un effet considérable sur les résultats en aval des analyses d’haleine.

Dans de nombreuses études, l’échantillonnage souffle respiratoire tardive est travailleur^2,3. Ce prélèvement consiste à jeter la portion initiale de l’air expiré (« dead space »), afin de capter préférentiellement l’air à la fin du cycle de respiration. L’avantage de cette stratégie est qu’il minimise les concentrations de COV exogène (p. ex., les COV environnementales), tout en enrichissant pour les COV endogène, spécifique au patient. Cette méthode exclut les premières secondes de l’expiration d’un individu avant de prélever l’échantillon d’haleine. Autres chercheurs ont utilisé un capteur de pression pour activer l’échantillonnage durant une phase prédéfinie d’expiration^4,5. Capteurs de pression nécessitant une ingénierie complexe, cette méthode alternative nécessite un dispositif de prélèvement dédié et relativement coûteux.

L’échantillonnage souffle pédiatrique peut être particulièrement difficile. Des principales préoccupations est que les jeunes enfants peuvent être incapables de coopérer avec les protocoles d’expiration volontaire d’air « dead space ». Pour cette raison, il est plus facile à obtenir mixte souffle respiratoire des enfants. Toutefois, un bémol majeur avec les échantillons d’haleine respiratoire mixte est le risque de contamination environnementale et matériel. Par conséquent, la faisabilité de la collecte pédiatrique est une préoccupation conduite dans le domaine.

En outre, pour les méthodes de collecte, stockage des échantillons d’haleine peut également influencer qualité d’échantillon. La forte humidité en haleine exhalate et les concentrations ultra-faibles (parties par billion) de volatils organiques composés font souffle échantillons d’haleine particulièrement sensibles aux problèmes liés au stockage^6,7. Malgré son grand potentiel des techniques en temps réel comme proton transfert réaction-spectrométrie de masse (PTR-MS), GC-MS demeure l’étalon-or pour l’analyse des échantillons d’haleine. Étant donné que l’analyse des échantillons d’haleine GC-MS est une technique en mode hors connexion, il est couplé avec des méthodes de préconcentration comme tubes de désorption thermique (TD), micro-extraction en phase solide et dispositifs de piège d’aiguille. Avant la préconcentration, échantillons d’haleine doivent être stockés temporairement en polymère sacs⁸. Sacs de polymère sont populaires en raison de leur prix modéré, relativement bonne longévité et réutilisabilité. Alors que les sacs peuvent être réutilisés, temps et les efforts doivent s’assurer efficace nettoyage^7,8. Chaque type de sac spécifique nécessite aussi empiriquement déterminées et standardisées des procédures pour le contrôle de la qualité, la réutilisation et la récupération.

TD tubes sont employés couramment pour la préconcentration souffle parce qu’ils capturent un grand nombre de substances volatiles et peuvent être personnalisés. Les matériaux absorbants utilisés pour l’emballage des tubes TD peuvent être adaptés à des applications particulières et volatiles de cible particulière d’intérêt. TD tubes considérablement améliorer le confort des études de biomarqueurs de souffle, en particulier sur les sites distants, parce que TD tubes en toute sécurité stocker des substances volatiles souffle pendant au moins deux semaines et sont faciles à transport³.

Dans un effort pour standardiser l’air expiré pédiatrique pour découverte de biomarqueurs, nous décrivons ici une méthode simple pour collecter les souffle de jeunes enfants. Pour illustrer les résultats représentatifs des protocoles mis en œuvre, les données dépersonnalisées sont présentées dans une cohorte en cours des enfants (8-17 ans) en cours d’évaluation pour la maladie de boissons acides gras du foie (stéatose hépatique non alcoolique). Résultats complets et analyse de cette étude seront communiqués dans une publication ultérieure. Dans cet ouvrage, les auteurs rapportent un sous-ensemble des données pour démontrer l’application de notre protocole. En bref, les enfants sont chargés d’expirer normalement par embout buccal dans un sac de polymère, comme si « souffle un ballon. » Le processus est répété 2 - 4 fois jusqu'à 1 L de la respiration sont recueilli. L’échantillon est ensuite transférée dans un tube de TD et stocké à 5 ° C avant l’analyse par CPG-SM.

Protocole

L’étude a été approuvée par les institutionnels Review Board de Washington University School of Medicine (#201709030). Le consentement éclairé a été obtenu d’un parent ou tuteur légal avant l’inclusion dans l’étude. Photographies à la Figure 2 reproduit avec consentement éclairé parental.

1. Assemblée d’échantillonneur haleine

1. En utilisant des gants jetables, fixer un embout en carton sur le sampler du souffle, tel qu’illustré dans la Figure 1. Joignez une courte longueur de tubes de grand diamètre à l’autre extrême de l’échantillonneur de souffle, comme le montre la Figure 1. Utiliser de nouveaux tubes pour chaque patient.
2. Branchez le connecteur du souffle à la valve du sac par l’intermédiaire de la tubulure. Voir la Figure 1 pour la photo de l’échantillonneur de souffle et le sac connecté.
3. Tourner la vis de serrage moleté sur le côté du raccord vers la gauche pour ouvrir la vanne d’entrée et enfoncez la tige de la soupape de sac, pour ouvrir le raccord pour l’échantillonnage d’entrée.
4. Bloquer l’ouverture de la soupape, en tournant la vis moletée du côté du raccord dans le sens horaire d’entrée.
5. Confirmer que la soupape bleue sur le sampler de souffle est ouverte (en parallèle avec le connecteur).
6. Écrire les patients ID, date et heure sur l’étiquette du sac polymère.
7. Tube à adsorption TD condition avant à l’aide de la collection de souffle recommandé des procédures (disponibles auprès de fabricants différents). Rebouchez et stockez les tubes de désorption thermique à 4 à 5 ° C ayant précédé le prélèvement de souffle afin de minimiser les artefacts.

2. air expiré

1. Effectuer une démonstration de l’expiration du souffle à l’enfant en utilisant un échantillon d’haleine (sans sac). Expliquer à l’enfant qu’ils devraient expirer comme ils faire quand « faire sauter un ballon » et continuer à expirer autant qu’ils peuvent confortablement. Mettre l’embout en carton entre vos lèvres et expirez aussi loin que vous le pouvez.
2. Fournir à l’enfant un nouveau sampleur souffle attaché à un sac et demandez-leur d’expirer comme dans la démonstration, comme illustré à la Figure 2.
3. Fermez le robinet bleu sur le périphérique de sampler souffle dès que l’enfant a fini d’expirer. Rouvrir la vanne si nécessaire avant les exhalaisons supplémentaires.
4. Répétez l’étape 2.2 et 2.3 jusqu'à ce qu’au moins 1 L d’haleine a été recueilli. Pour un enfant en bonne santé, cela peut prendre 2 exhalaisons et pour un exhalaisons malades ou plus jeune enfant de 2 à 4. 1 L de la respiration est l’exigence minimale analytique. Notes relatives à l’étiquette de sac respirations combien étaient prélevées sur le patient. Voir la Figure 2 pour une photo du sac contenant les différents volumes de souffle.
5. Avant de détacher le sac de l’échantillon de l’haleine, assurez-vous de desserrer la vis de serrage moleté sur le côté de l’entrée du raccord en le tournant dans le sens anti-horaire et enfoncer la tige de la vanne jusqu'à fermer le raccord d’entrée. Voir supplément Figure 3 pour la photo de la vanne de sac en position ouverte et fermée.
6. Verrouiller la valve du sac fermée en tournant la vis moletée du côté du raccord dans le sens horaire d’entrée.
7. Retirer le sac de l’échantillon de l’haleine.
8. Jeter l’embout buccal et mettre de côté l’échantillonneur de souffle pour le nettoyage avant utilisation avec un autre patient.

3. transfert de souffle aux tubes de désorption thermique

1. Enlever le tube de TD du réfrigérateur. Retirer les capuchons de stockage à long terme du tube adsorbant, en utilisant l’outil de recouvrement/désoperculer tube fourni par le fabricant.
2. Raccordez l’extrémité cannelée du tube sorbant TD pour le sac de prélèvement à l’aide de tubes. Notez que l’orientation tube est importante, comme TD tubes sont conçus pour avoir l’air circulant dans un seul sens, à partir de l’extrémité rainurée. Notez que le transfert du souffle du sac à TD devrait être effectué dans l’heure de l’air expiré.
3. Insérez l’autre extrémité du tube TD dans le tube, qui est relié à une pompe.
4. Allumer la pompe et réglé pour fonctionner à 100 mL/min pendant 10 min.
5. Ouvrez le robinet sur le sac en tournant dans le sens anti-horaire la vis moletée du côté du raccord et enfoncer la tige de la soupape vers le bas pour ouvrir le raccord d’entrée. Cela est illustré dans supplémentaire Figure 4, qui montre le transfert de souffle dans un tube à adsorption TD à l’aide d’une pompe.
6. Démarrer la pompe, qui s’arrêtera après 10 min de collection.
7. Retirer le tube à adsorption TD et serrer les bouchons sur les deux extrémités en utilisant l’outil de recouvrement/déplafonnement du tube. Casquettes de stockage à long terme doivent être bien serrées afin d’assurer un joint étanche.
8. Une gommette sur la fin d’un capuchon pour indiquer que le tube a été utilisé. Sur l’autocollant, indiquer la date et numéro d’identification (ID) étude de patients.
9. Placer le tube dans un petit sac en plastique refermable. Tube à adsorption magasin 4 – 5 ° c. Appuyez sur le reste de l’haleine du sac et jeter le sac. Enregistrer la patiente étude ID, TD tube numéro de série, jour de la collection, temps d’air expiré, temps de transfert de souffle et la prise alimentaire (moment de la prise alimentaire avant l’air expiré et repas consommés).

4. collection ambient air

1. Recueillir les échantillons d’air ambiant dans l’environnement du patient immédiatement après le prélèvement de souffle.
   1. Fixer le sac à l’orifice de sortie de la pompe à l’aide de tubes, comme illustré dans la Figure supplémentaire 5.
   2. Enfoncer la tige de la soupape du sac vers le bas pour ouvrir le raccord pour l’échantillonnage.
   3. Bloquer l’ouverture de la valve en tournant dans le sens horaire la vis moletée du côté du raccord.
2. Allumer la pompe et réglé pour fonctionner à 100 mL/min pendant 12 min. La pompe recueillera 1 200 mL d’air ambiant.
3. Après que le volume requis aient été recueilli, desserrez la vis moletée sur le côté de l’entrée du raccord en le tournant dans le sens anti-horaire et enfoncer la tige de la vanne jusqu'à fermer le raccord d’entrée.
4. Verrouiller la valve du sac fermée en tournant dans le sens horaire la vis moletée du côté du raccord.
5. Retirer le sac de la pompe.
6. Suivez la même procédure qu’à l’article 3. La seule différence est que l’air ambiant que COV est transférés, pas ceux de l’haleine.

5. échantillonnage et analyse des données

Remarque : Les Conditions pour l’analyse des échantillons d’haleine et de l’air ont été décrits précédemment⁹.

1. Analyser les données recueillies et détecter les composés des chromatogrammes. Utiliser des logiciels typique pour trouver et identifier tous les composés détectés par l’instrument (Figure 3 a). Par exemple, utiliser une fonction de déconvolution d’identifier des composés. Filtrer les données en utilisant le facteur de taille de fenêtre de rétention de 80, hauteur masse filtres ≥100 compte et composé absolu zone filtre ≥500 compte.
2. Utiliser les normes chimiques aux composés de l’identité dans les échantillons d’haleine et l’air. Extrait de la surface du pic ion base de composés d’intérêt, tels que l’isoprène et β-pinène (Figure 4) et comparer les niveaux de composés volatils dans l’air et le souffle.

Résultats

Dans notre étude, souffle échantillons ont été prélevés de 10 enfants (8-17 ans) en cours d’évaluation à l’hôpital pour enfants de Saint-Louis. Échantillons d’haleine et des échantillons d’air ambiant (n = 10) ont été récoltés comme décrit ci-dessus. Des échantillons ont été analysés à l’aide de la chromatographie en phase gazeuse quadrupolaire time-of-flight spectrométrie de masse (GC-QToF-MS) et de la désorption thermique, comme précédemment décrit⁹. Apr...

Discussion

Malgré des progrès considérables dans la recherche de souffle durant la dernière décennie, des pratiques normalisées pour l’échantillonnage et l’analyse des composés volatils de gaz souffle restent indéfini¹⁰. Des principales raisons de cette absence de normalisation a été la diversité des méthodes de collecte de souffle, ayant un impact direct sur la diversité chimique qui en résulte présente dans n’importe quel échantillon d’air expiré donnée. Respiration exhalate contient une vaste gamme de com...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Sac respiratoire  ;	SKC	237-03	Il s’agit de sacs de 3 L
Embout buccal en carton  ;	Systèmes A-M	161902	0,86 » OD, 2,00 » L
Tube de grand diamètre	Cole Parmer	95802-11	Tube en silicone, 1/4 » ID x 5/16 » OD,
Capuchons de stockage à long terme  ;	Markes International	C-CF010	Capuchon de stockage en laiton ¼ ; " & Virole en PTFE, pk 10
Adaptateur mâle	Charlotte Pipe	2109	Partie 1/3 du connecteur d’haleine (1/2 » Universel pièce n° 436-005)
Adaptateur mâle (en téflon)		en interne	(1/4 » ID x 1/2 » MIP). Cette pièce a été spécialement usinée à partir de tiges fabriquées à partir d’une pompe en téflon vierge
	SKC	220-1000TC-C	Pocket PumpTouch avec chargeur
Tube de petit diamètre  ;	Supelco	20533	Tube en téflon  ; L & fois ; O.D. & fois ; D.I. 25 pieds et temps ; 1/4 po. (6,35 mm) & temps ; 0,228 po. (5,8 mm)  ;
Tubes à désorption thermique  ;	Markes International	C2-CAXX-5314	Tube, inerte, TnxTA/Sulficarbe, cond/bouchon, pk 10
Outil de bouchage/débouchage de tube	Markes International	C-CPLOK
Connecteur de vanne à bille à bille à deux voies  ;	Homewerks Worldwide	VBV-P40-E3B	Partie 2/3 du connecteur d’haleine (1/2")

Partie 3/3 du connecteur d’haleine fabriqué