Article de méthode

Génération, Amplification et titrage du virus Syncytial respiratoires recombinants

DOI :

10.3791/59218

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4 avril 2019

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1UMR 1173 Institut national de la santé et de la recherche médicale (INSERM), Université de Versailles St. Quentin, 2UR892 Institut national de la recherche agronomique (INRA), Unité de virologie et immunologie moléculaires, 3Assistance Publique–Hôpitaux de Paris (AP-HP), Hôpital Ambroise Paré, Laboratoire de Microbiologie

Dans cet article

Résumé

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Nous décrivons une méthode permettant de générer et amplifier les organismes génétiquement modifiés virus syncytiales respiratoires (RSVs) et un dosage de plaque optimisé pour RSVs. Nous illustrons ce protocole en créant deux virus recombinants qui sont respectivement permettent la quantification de la réplication de la RSV et analyse des corps d’inclusion de RSV et dynamiques associés à corps d’inclusion des granules en direct.

Résumé

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L’utilisation de virus recombinants est devenu cruciale en virologie fondamentale ou appliquée. Génétique inverse s’est avérée pour être une technologie extrêmement puissante, tant pour décrypter les mécanismes de réplication virale et à étudier les antiviraux ou fournir la plate-forme de développement pour les vaccins. La construction et la manipulation d’un système génétique inverse pour un négatif-strand RNA virus comme un virus respiratoire syncytial (VRS), cependant, reste délicates et nécessite des savoir-faire spécial. Le génome de la RSV est un ARN monocaténaire, sens négatif d’environ 15 Ko qui sert de matrice pour viral replication RNA et transcription. Notre système de génétique inverse utilise une copie de cDNA du génome humain RSV souche longue (HRSV). Cet ADNc, mais aussi des CDNA codant pour des protéines virales de la polymérase complexe (L, P, N et M2-1), est placés dans des vecteurs d’expression individuelle en vertu de séquences de contrôle polymérase T7. La transfection de ces éléments dans les cellules de BSR-T7/5, qui expriment le stablement polymérase T7, permet la réplication cytoplasmique et la transcription de la RSV recombinante, donnant lieu à des virions génétiquement modifiées. Une nouvelle RSV, qui est présent à la surface cellulaire et dans le surnageant de culture de BSRT7/5, est recueillie pour infecter des cellules humaines de HEp-2 pour l’amplification virale. Deux ou trois rondes d’amplification sont nécessaires pour obtenir des stocks viraux contenant 1 x 106 à 1 x 107 unités de formation de plaques (PFU) / mL. Méthodes d’optimal de récolte, gel et titrage des stocks viraux sont décrites ici en détail. Nous illustrons le protocole présenté ici en créant deux virus recombinants exprimant respectivement gratuit protéine fluorescente verte (GFP) (RSV-GFP) ou virale M2-1 fusionnée à la GFP (RSV-M2-1-GFP). Nous montrons comment utiliser RSV-GFP pour quantifier la réplication RSV et la RSV-M2-1-GFP de visualiser les structures virales, ainsi que la dynamique de protéine virale dans des cellules vivantes, en utilisant des techniques de microscopie vidéo.

Introduction

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VRS humaine est la principale cause d’hospitalisation chez les infections respiratoires aiguës dans les bébés dans le monde1. En outre, le VRS est associé à une morbidité importante dans comparable à la grippe, avec la plus grande partie de l’hospitalisation et la charge de mortalité dans les personnes âgées de2adultes. Il n’y aucun vaccins ou des antiviraux spécifiques disponibles encore contre RSV, mais promettant de nouveaux médicaments sont en développement3,4. La complexité et la lourdeur des techniques de quantification de la multiplication de la RSV font o....

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Protocole

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1. matérielle préparation

  1. Acheter des supports de la cellule (sérum réduit médias, minimales essentielles [MEM], 10 x MEM et Dulbecco de l’aigle modifié [DMEM]), réactif de transfection et cellulose microcristalline (voir Table des matières).
  2. Obtenir les vecteurs suivants de génétique inverse : la génomique vecteur (s) et les vecteurs d’expression codant pour la protéine N et les protéines complexe polymérase. Les vecteurs génomiques contiennent le génome complet cDNA du RSV-GFP (p-RSV-GFP) et du M2-RSV-1GFP (p-RSV-M2-1GFP) en aval de l’instigateur du bactériophage T7 RNA polymérase (pol T7). Les vecteurs d’expression (désigné comm....

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Résultats

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Dans cet ouvrage, nous décrit un protocole détaillé pour produire des virus recombinants de RSV, exprimant une protéine fluorescente (Figure 2). Au pRSV-GFP, le gène de la GFP a été introduit entre les gènes P et M, comme pour le gène cerise en œuvre précédemment publiée21. Dans le pRSV-M2-1-GFP, le gène M2 a été laissé intact et un gène supplémentaire codant pour M2-1-GFP a été inséré entre SH et G gènes12. La .......

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Discussion

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Nous présentons ici une méthode de sauvetage de recombinant RSVs de cinq plasmides et leur amplification. La possibilité de manipuler le génome du virus a révolutionné la recherche virologie afin de tester des mutations et exprimer un gène additionnel ou une protéine virale étiquetée. La RSV, nous avons décrit et utilisé comme un exemple de cet article est un virus exprimant un gène rapporteur, la RSV-GFP (inédit) et exprime une protéine M2-1 fusionnée à la GFP tag12. Sauvetage de RSV est un défi .......

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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Les auteurs remercient m. Qin Yu de AstraZeneca R & D Boston, MA, é.-u., pour fournir le médicament AZD4316. Les auteurs sont reconnaissants à la plateforme Cymages pour l’accès au microscope ScanR Olympus, qui était soutenu par des subventions de la région Ile-de-France (DIM ONE HEALTH). Les auteurs reconnaissent le soutien de l’INSERM et l’Université de Versailles Saint-Quentin.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
35 mm & micro-parabole pour l’imagerie de cellules vivantesIbidi81156
A549ATCCATCC CCL-185
Avicel RC-591FMC BioPolymerAvicel RC-591Des informations techniques et autres sur Avicels sont disponibles à l’adresse http://www.fmcbiopolymer.com. Conserver à température ambiante. Le protocole de l’étape 4 est optimisé pour ce réactif.
BSRT7/5non disponible dans le commerceVoir référence 22. Buchholz et al., 1999
SigmaHT90132
Microscope à fluorescence pour les observationsMicroscope OlympusIX73 Microscope
fluorescence pour vidéomicroscopieMicroscope OlympusScanR Microscope
Olympus HEp-2ATCCATCC CCL-23
HEPES &ge ; 99.5 %SigmaH3375
L-Glutamine (200 mM)ThermoFisher Scientific25030024
LIPOFECTAMINE 2000 REACTIVELe protocole ThermoFisher Scientificà l’étape 2.3. est optimisé pour ce réactif.
MEM (10x), sans glutamineThermoFisher Scientific11430030
MEM, Supplément GlutaMAXThermoFisher Scientific41090-028
MgSO4 ReagentPlus, &ge ; 99,5 %SigmaM7506
Opti-MEM I Sérum réduit moyenThermoFisher Scientific51985-026
Solution aqueuse de paraformaldéhyde, 32 %,Microscopie électronique15714
Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/mL)ThermoFisher Scientific15140122
Plasmidesnon disponibles dansle commerceVoir la référence 21. Rameix-Welti et al., 2014
Voir Saw RockerVWR444-0341
Si RNA GAPDHDharmaconON-TARGETplus siRNA
D-001810-10-05		SMARTpool et 3 des 4 siRNA individuels conçus par Dharmacon.
Si RNA IMPDH2DharmaconON-TARGETplus siRNA IMPDH2 Pool- Human
L-004330-00-0005		SMARTpool de 4 siRNA individuels conçus par Dharmacon.
Références et séquences individuelles
J-004330-06 : GGAAAGUUGCCCAUUGUAA ;
J-004330-07 : GCACGGCGCUUUGGUGUUC ;
J-004330-08 : AAGGGUCAAUCCACAAAUU ;
J-004330-09 : GGUAUGGGUUCUCUCGAUG ;
Si RNA RSV NDharmaconON-TARGETplus siRNA personnaliséUUCAGAAGAACUAGAGGCUAU et UUUCAUAAAUUCACUGGGUUA
SiRNA NTDharmaconON-TARGETplus Non-targeting Pool
SiRNA refection reagentDharmaconDharmaFECT 1 Ref : T-2001-03Le protocole des étapes 5.1.et 5.1.2 est optimisé pour ce réactif.
Bicarbonate de sodium 7,5 % solutionThermoFisher Scientific25080094
SpectrofluorimètreTecanTecan infinite M200PRO
Microscope à fluorescence à 11668019 de qualité EM Sciences

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shi, T., et al. Global, regional, and national disease burden estimates of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children in 2015: a systematic review and modelling study. The Lancet. 390 (10098), 946-958 (2017).
  2. Falsey, A. R., Hennessey, P. A., Formica, M. A., Cox, C., Walsh, E. E.

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Mots-clés

Virus respiratoire syncytial recombinantsyst me de g n tique inverseamplification de stock viralessai de titrage par plaquescellules BSR T7 5infection de cellules HEp 2suivi de la fluorescence GFPrecouvrement la cellulose microcristallinecong lation pour la r colte viraleunit s formant des plaques

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