Article de méthode

Génération, Amplification et titrage du virus Syncytial respiratoires recombinants

DOI :

10.3791/59218

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4 avril 2019

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1UMR 1173 Institut national de la santé et de la recherche médicale (INSERM), Université de Versailles St. Quentin, 2UR892 Institut national de la recherche agronomique (INRA), Unité de virologie et immunologie moléculaires, 3Assistance Publique–Hôpitaux de Paris (AP-HP), Hôpital Ambroise Paré, Laboratoire de Microbiologie

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous décrivons une méthode permettant de générer et amplifier les organismes génétiquement modifiés virus syncytiales respiratoires (RSVs) et un dosage de plaque optimisé pour RSVs. Nous illustrons ce protocole en créant deux virus recombinants qui sont respectivement permettent la quantification de la réplication de la RSV et analyse des corps d’inclusion de RSV et dynamiques associés à corps d’inclusion des granules en direct.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’utilisation de virus recombinants est devenu cruciale en virologie fondamentale ou appliquée. Génétique inverse s’est avérée pour être une technologie extrêmement puissante, tant pour décrypter les mécanismes de réplication virale et à étudier les antiviraux ou fournir la plate-forme de développement pour les vaccins. La construction et la manipulation d’un système génétique inverse pour un négatif-strand RNA virus comme un virus respiratoire syncytial (VRS), cependant, reste délicates et nécessite des savoir-faire spécial. Le génome de la RSV est un ARN monocaténaire, sens négatif d’environ 15 Ko qui sert de matrice pour viral replication RNA et transcription. Notre système de génétique inverse utilise une copie de cDNA du génome humain RSV souche longue (HRSV). Cet ADNc, mais aussi des CDNA codant pour des protéines virales de la polymérase complexe (L, P, N et M2-1), est placés dans des vecteurs d’expression individuelle en vertu de séquences de contrôle polymérase T7. La transfection de ces éléments dans les cellules de BSR-T7/5, qui expriment le stablement polymérase T7, permet la réplication cytoplasmique et la transcription de la RSV recombinante, donnant lieu à des virions génétiquement modifiées. Une nouvelle RSV, qui est présent à la surface cellulaire et dans le surnageant de culture de BSRT7/5, est recueillie pour infecter des cellules humaines de HEp-2 pour l’amplification virale. Deux ou trois rondes d’amplification sont nécessaires pour obtenir des stocks viraux contenant 1 x 106 à 1 x 107 unités de formation de plaques (PFU) / mL. Méthodes d’optimal de récolte, gel et titrage des stocks viraux sont décrites ici en détail. Nous illustrons le protocole présenté ici en créant deux virus recombinants exprimant respectivement gratuit protéine fluorescente verte (GFP) (RSV-GFP) ou virale M2-1 fusionnée à la GFP (RSV-M2-1-GFP). Nous montrons comment utiliser RSV-GFP pour quantifier la réplication RSV et la RSV-M2-1-GFP de visualiser les structures virales, ainsi que la dynamique de protéine virale dans des cellules vivantes, en utilisant des techniques de microscopie vidéo.

Introduction

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VRS humaine est la principale cause d’hospitalisation chez les infections respiratoires aiguës dans les bébés dans le monde1. En outre, le VRS est associé à une morbidité importante dans comparable à la grippe, avec la plus grande partie de l’hospitalisation et la charge de mortalité dans les personnes âgées de2adultes. Il n’y aucun vaccins ou des antiviraux spécifiques disponibles encore contre RSV, mais promettant de nouveaux médicaments sont en développement3,4. La complexité et la lourdeur des techniques de quantification de la multiplication de la RSV font obstacle à la recherche d’antiviraux ou vaccins malgré des efforts considérables actuels. La quantification de la multiplication de RSV in vitro est généralement fondée sur des méthodes laborieux, longues et coûteux, qui consistent principalement en l’analyse de l’effet cytopathogène par microscopie, immunomarquage, réduction de la plaque essais, quantitatives la transcriptase inverse (EIR)-réaction en chaîne par polymérase (PCR) et les immuno-essais de dosage. Virus avec des génomes modifiés et exprimant des gènes rapporteurs, comme ceux codant pour la GFP, sont plus adaptés pour ces projections. Couplé à l’usage des lecteurs de plaques automatisé, virus recombinants porteurs de gène de journaliste peuvent faire ces dosages plus adapté à la normalisation et haut débit.

Le VRS est un virus à ARN sens négatif enveloppé, un qui appartient au genre Orthopneumovirus de la Pneumoviridae famille, ordre Mononegavirales5. Le génome de la RSV est un ARN monocaténaire, sens négatif d’environ 15 Ko, qui contient une région non codante aux extrémités 3' et 5' appelé Leader et remorque et 10 unités de transcriptionnelles codant des 11 protéines. Les gènes sont classés comme suit : 3'-NS1, NS2, N, P, M, SH, G, F, M2 (codant pour des protéines M2-1 et M2-2) et L-5'. L’ARN génomique est étroitement conditionné par la nucléoprotéine N. Using l’ARN génomique encapsidés comme gabarit, virale ARN polymérase ARN dépendante (RdRp) assurera la transcription et la réplication de l’ARN viral. RdRp virale est composé de la protéine grande L qui porte l’activité polymérase de nucléotide en soi, son cofacteur obligatoire la phosphoprotéine de P et la protéine M2-1 qui fonctionne comme une transcription virale facteur6. Dans les cellules infectées, RSV induit la formation d’inclusions cytoplasmiques appelées inclusions (IBs). Les inclusions cytoplasmiques morphologiquement semblables ont été observées pour plusieurs Mononegavirales7,8,9,10. Études récentes sur le virus rabique, virus de la stomatite vésiculaire (VSV), virus Ebola et RSV a montré que la synthèse de l’ARN virale s’effectue en IBs, qui peuvent ainsi être considérés comme usines virales8,9,11, 12. les usines de virus concentré l’ARN et des protéines virales requis pour la synthèse de l’ARN virale et contiennent également des protéines cellulaires13,14,15,16, 17. IBs présentent un plus fonctionnel appelé IB associées aux granules (IBAGs), qui concentrent la nouvellement synthétisée ARNm viral naissant ainsi que de la protéine M2-1. L’ARN génomique et le L, P et N ne sont pas détectés dans IBAGs. IBAGs sont de petites structures sphériques dynamiques à l’intérieur de l’ISB qui présentent les propriétés des organites liquide12. Malgré le rôle central de l’IBs dans la multiplication virale, on sait peu sur la nature, structure interne, formation et exploitation de ces usines virales.

L’expression du génome d’un poliovirus chez un ADNc a permis la production du premier clone virale infectieuse en 1981,18. Pour négatifs virus à ARN simple brin, ce n’est qu’en 1994 que la production d’un premier virus de la rage après transfection des plasmides dans les cellules19 a eu lieu. La première axée sur le plasmide inverse système génétique pour RSV a été publié en 1995,20. Génétique inverse ont conduit à des avancées majeures dans le domaine de la virologie. La possibilité d’introduire des modifications spécifiques dans le génome viral a fourni un aperçu critique de la réplication et la pathogenèse des virus à ARN. Cette technologie a également grandement facilité le développement de vaccins en permettant atténuation spécifique ciblés série de modifications. Modifications du génome qui permet un dosage rapide de multiplication virale grandement amélioré le contrôle antiviral et étude de leur mode d’action.

Bien que décrite précédemment, obtention d’organismes génétiquement modifiés RSVs reste délicate. Ici, nous détaillons un protocole pour créer deux types de recombinaison HRSV, exprimant respectivement RSV-GFP ou RSV-M2-1-GFP. Dans ce protocole, nous décrivons les conditions de transfection nécessaires pour secourir les nouveaux virus recombinants, ainsi que leur amplification afin d’obtenir des stocks viraux avec un titre élevé, adapté aux expérimentations reproductibles. La construction des vecteurs de la génétique inverse en soi n’est pas décrit ici. Nous décrivent les méthodes de récolte optimale et gel des stocks viraux. La méthode la plus précise pour mesurer les particules infectieuses virales reste essai de plaque. Cellules sont infectées par des dilutions successives de la suspension analysée et incubées avec une surcouche qui interdit la diffusion de particules virales libres dans le surnageant. Dans de telles conditions, le virus infectera seulement des cellules contiguës formant une « plaque » pour chaque particule infectieuse initial. Dans l’essai de titrage de RSV classique, les plaques sont révélés par immunomarquage et comptés sous observation microscopique. Cette méthode est coûteuse et fastidieuse. Ici, nous avons décrit un protocole très simple pour un essai de plaque RSV à l’aide de superposition de cellulose microcristalline qui permet la formation de plaques visibles à le œil nu. Nous montrons comment RSV-GFP permet de mesure RSV réplication et, partant, de quantifier l’impact des antiviraux. La combinaison génétique inverse et technologie de l’imagerie live, nous démontrons comment RSV-M2-1-GFP permet aux chercheurs de visualiser M2-1 dans des cellules vivantes et de suivre la dynamique des structures virales intracellulaires, comme IBs.

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Protocole

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1. matérielle préparation

  1. Acheter des supports de la cellule (sérum réduit médias, minimales essentielles [MEM], 10 x MEM et Dulbecco de l’aigle modifié [DMEM]), réactif de transfection et cellulose microcristalline (voir Table des matières).
  2. Obtenir les vecteurs suivants de génétique inverse : la génomique vecteur (s) et les vecteurs d’expression codant pour la protéine N et les protéines complexe polymérase. Les vecteurs génomiques contiennent le génome complet cDNA du RSV-GFP (p-RSV-GFP) et du M2-RSV-1GFP (p-RSV-M2-1GFP) en aval de l’instigateur du bactériophage T7 RNA polymérase (pol T7). Les vecteurs d’expression (désigné comme p-N-p -P, p-L et p-M2-1) contient la séquence codante de N, P, L ou M2-1 en aval la pol T7 (voir Al. goudronneuse12 et al. Rameix-Welti21 pour plus de détails concernant les constructions de plasmide).
  3. Préparer les médias pour une culture de cellules dans un milieu stérile et pour la transfection et l’infection. Utilisation DMEM avec 2 mM de L-glutamine complétée avec 10 % de sérum de veau foetal (FCS), 1 000 unités/mL de pénicilline et la streptomycine 1 mg/mL (ou sans antibiotiques) et MEM avec 2 mM de L-glutamine additionné de 0 %, 2 %, soit 10 % de FCS, 1 000 unités/mL de pénicilline et 1 mg/mL streptomycine, désigné comme « milieu complet » dans le protocole suivant.
  4. Obtenir BSRT7/522 cellules et faire des stocks en milieu complet additionné de 10 % le diméthylsulfoxyde (DMSO) à 1 à 2 x 106 cellules/mL. Conserver les stocks de cellules dans l’azote liquide. Obtenir des cellules HEp-2. Culture BSRT7/5 cellules en DMEM complet et cellules HEp-2 en MEM complet à 37 ° C et 5 % de CO2 dans un environnement stérile.
  5. Préparer une solution de conservation du RSV 10 x (0,5 M HEPES et 1 M MgSO4 [pH 7.5] dans l’eau) dans un environnement stérile.
  6. Obtenir un microscope à fluorescence inversé compatible avec les mesures de fluorescence GFP et compatible avec l’imagerie direct s’il est nécessaire de surveiller une infection. Obtenir un lecteur de microplaques compatible avec les mesures de fluorescence GFP pour la quantification de la réplication de RSV-GFP.

2. le sauvetage et le premier Passage de Virus Recombinant

Remarque : Effectuez toutes les opérations suivantes dans un environnement stérile, à l’aide d’une classe de sécurité II.

  1. La veille de la transfection, préparer une suspension d’une lignée cellulaire BSRT7/5 à 5 x 105 cellules/mL dans le milieu complet. Distribuer 2 mL de suspension de cellules par puits dans une plaque 6 puits. Préparer un puits par des virus qui va être secourus et un puits supplémentaire pour le contrôle négatif. Incuber les plaques à 37 ° C et 5 % de CO2. Vérifiez que les cellules sont à une confluence de 80 à 90 % le lendemain.
  2. Dégeler les vecteurs (de l’étape 1.2) de la génétique inverse p-RSV-GFP et p-RSV-M2-1-GFP, ainsi que p-N-p -P, p-L et p-M2-1. Combinaison de chaque virus sauver, 1 µg de p-N et p -P, 0,5 µg de p-L, 0,25 µg de p-M2-1 et 1,25 µg de p-RSV (GFP ou GFP M2-1) dans un tube.
    Remarque : Vecteurs d’expression différents pour N, P, L et M2-1 peuvent être utilisés ; Toutefois, le rapport entre les protéines doit être maintenu. Effectuer le contrôle négatif en remplaçant le vecteur p-RSV avec un vecteur vide.
  3. Passez à la transfection, suivant le protocole du fabricant réactif transfection (voir Table des matières).
    1. Ajouter 250 µL de milieu de sérum réduit pour les vecteurs mixtes. Dans un autre tube, diluer 10 µL de réactif transfection dans 250 µL de milieu de sérum réduit. Doucement vortex tubes et attendre 5 min. mélanger le contenu des deux tubes et attendre 20 min à température ambiante.
    2. Rincer les cellules BSRT7/5 avec 1 mL de milieu de sérum réduit et distribuer 1,5 mL de MEM avec 10 % de FCS sans antibiotiques / puits. Si nécessaire, incuber à 37 ° C et 5 % de CO2 jusqu'à ce que l’incubation décrite à l’étape 2.3.1 est terminée.
    3. Ajouter 500 µL du mélange transfection préparé à l’étape 2.3.1 vers un puits lorsque le temps d’incubation de 20 min est terminée. Placer les cellules dans l’incubateur à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant 3 jours. Ne modifiez pas le milieu de culture des cellules au cours de la transfection.
  4. Observer la fluorescence GFP (excitation à 488 nm) et l’émission à 515 – 535 nm sous un microscope à fluorescence inversé au grossissement x 20 1 x par jour pour surveiller l’efficacité de secours, à l’aide de la GFP filtrer.
  5. Le deuxième jour après la transfection, les semences des cellules pour le premier passage des virus secourues. Préparer une suspension de cellules HEp-2 à 5 x 105 cellules/mL dans le milieu complet. Distribuer 2 mL de suspension de cellules par puits dans une plaque de 6 puits (un puits par virus de sauvetage et un contrôle négatif).
  6. Le troisième jour de la transfection, les cellules gratter dans chaque puits de la plaque de 6 puits transfectée BSRT7/5, en utilisant un grattoir à différent pour chaque puits. Transférer le contenu de chaque bien (cellules et surnageant) dans un tube de microtubes stériles de 2 mL. Vortex chaque tube vigoureusement pendant au moins 30 s de libérer le virus sauvé de la membrane cellulaire.
    Remarque : Cela correspond au passage 0 (P0) du virus sauvé (Figure 1).
  7. Utiliser les frais en suspension virale P0 pour effectuer la première amplification des virus secourues.
    1. Enlever le milieu de culture de la plaque de 6 puits de HEp-2 graines la veille (voir l’étape 2.5) et rapidement ajouter 500 µL de la suspension de P0 (de l’étape 2.6) / puits. Placer la plaque de HEp-2 à 37 ° C sur une bascule de balançoire pour douce agitation pendant 2 h.
    2. Enlever et jeter les 500 µL d’inoculum et ajouter 2 mL de MEM avec 2 % FCS. Incuber les plaques à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant 3 jours. Cela produira le premier passage (P1) des virus sauvés (Figure 1).
  8. Ajouter 1/10 du volume de solution de conservation x RSV 10 (0,5 M HEPES et 1 M MgSO4 [pH 7.5]) dans la suspension P0 restante (de l’étape 2.6). Vortex les microtubes vigoureusement pendant 5 s et partie aliquote le contenu dans des tubes cryogéniques étiquetés avec des tags antialcool. Plonger les tubes pendant au moins 1 h dans de l’alcool refroidi à-80 ° C et les stocker à-80 ° C.
  9. Titrer l’encours P0 (voir étape 2.6) de chaque virus sauvés (voir la section 4 pour le titrage de cellulose microcristalline).
  10. Observer la fluorescence GFP (excitation à 488 nm) et l’émission à 515 – 535 nm des cellules HEp-2 infectées par la suspension de P0 sous un microscope à fluorescence inversé à un grossissement de 20 x 1 x par jour pour contrôler l’infection. Observer sous un microscope à fond clair, l’apparition de petits syncytiums et détachement qui résulte de l’effet cytopathogène RSV (CPE) de la cellule (voir Figure 2).
  11. Notez que le sauvetage a échoué si fluorescence ni CPE est visible après 2 – 3 jours.
  12. Percevoir le premier passage (P1) au jour 3 ou 4 comme indiqué au point 2.6. En bref, gratter les cellules, recueillir les cellules et le surnageant ensemble, vortex, ajoutez la solution de conservation comme indiqué au point 2.8, aliquote de l’échantillon et le congeler.
  13. Titrer (voir la section 4 pour l’essai de titrage) et amplifient le premier passage (voir la section 3 pour l’amplification).

3. amplification des virus sauvés

Remarque : Le protocole suivant décrit l’amplification des virus sauvés dans une fiole de2 75 cm. Adapter la taille du ballon pour le volume nécessaire et la nécessaire multiplicité d’infection (MOI). Le tableau 1 indique les volumes pour différents ballons. Effectuez toutes les opérations suivantes dans un environnement stérile dans une classe de sécurité II.

  1. Préparer une suspension de cellules HEp-2 à 5 x 105 cellules/mL dans le milieu complet, le jour avant l’amplification. 15 mL de la suspension cellulaire par flacon de 75 cm2 de distribuer et incuber les flacons à 37 ° C et 5 % de CO2. Préparer une fiole par virus d’amplifier.
  2. Le jour après le début de l’incubation, vérifiez que les cellules sont confluents de 80 à 100 %.
  3. Diluer la suspension virale à l’étape 2.12 de MEM sans FCS pour obtenir une suspension de 3 mL à 50 000 UFP/mL (correspondant à un MOI de 0,01 PFU/cellule).
  4. Enlever le milieu et ajouter rapidement la suspension virale de 3 mL. Placer le ballon à 37 ° C sur une bascule de balançoire pour douce agitation pendant 2 h.
  5. Enlever et jeter l’inoculum et ajouter 15 mL de MEM avec 2 % FCS. Incuber à 37 ° C et 5 % de CO2 pour 2 à 4 jours.
  6. Vérifier la morphologie cellulaire et la fluorescence GFP (excitation à 488 nm) et l’émission à 515 – 535 nm sous un microscope à fluorescence inversé à un grossissement de 20 x afin d’estimer le bon moment pour récolter les virus. Notez que c’est généralement quand 50 % à 80 % de la couche de cellules HEp-2 est détachée en raison de la CPE RSV qui se produit entre 48 et 72 h après (p.i.) (voir la Figure 3).
  7. Grattez toutes les cellules à l’aide d’un grattoir de cellules. Rassembler les cellules et le surnageant et transférez-les dans un tube à centrifuger 50 mL.
  8. Ajouter 1/10 du volume des 10 x solution de conservation RSV (0,5 M HEPES et 1 M MgSO4 [pH 7.5]). Vortex les tubes vigoureusement pendant 5 s et clarifier la suspension par une centrifugation de 5 min à 200 x g.
  9. Transférer le surnageant dans un tube de 50 mL. Vortex brièvement et aliquote de la suspension dans des tubes cryogéniques étiquetés avec des tags antialcool. Plonger les tubes dans l’alcool rafraîchies-80 ° C pendant au moins 1 h et les stocker à-80 ° C.
  10. Libérer un des aliquotes de titrer la suspension virale (voir section 4).

4. plaque titrage dosage

  1. Préparer 12 plats pour le titrage le jour avant le test de titrage est réalisé (six puits seront requise pour titrer un tube de virus). Les semences des puits avec 1 mL de cellules HEp-2 à 5 x 105 cellules/mL dans le milieu complet.
  2. Le lendemain, préparer une suspension microcristalline stérile (2,4 % [p/v] dans l’eau) (voir la Table des matières).
    1. Disperse 2,4 g de poudre de cellulose microcristalline dans 100 mL d’eau distillée, à l’aide d’un agitateur magnétique standard, jusqu'à dissolution complète de la poudre (habituellement de 4 à 12 h). Autoclaver la suspension à 121 ° C pendant 20 min et conserver à température ambiante avant utilisation.
      Remarque : Dans ces conditions, la suspension est stable pendant 1 an.
    2. Après l’ouverture de la solution dans un environnement stérile, stockez-le à 4 ° C pendant 6 mois. Toujours mélanger la suspension avant de l’utiliser (en écriture tremblante ou vortex) pour vous assurer que c’est homogène.
  3. Préparer les 2 x MEM dans un environnement stérile. Diluer commercial MEM 10 x avec de l’eau stérile et ajouter L-glutamine, 1 000 unités/mL de pénicilline et la streptomycine 1 mg/mL. Vigoureusement la dilution et le stocker à 4 ° C.
    Remarque : Effectuez les étapes 4.4 – 4.10 dans un environnement stérile en utilisant une classe de sécurité II.
  4. Préparer six tubes contenant 900 µL de MEM sans FCS par virus à être titré (les tubes de titrage). Décongeler les aliquotes de virus, vortex eux vigoureusement pendant 5 s et transférer 100 µL au titrage du premier tube.
  5. Effectuer une dilution décuplé 6 x, comme suit. Ajouter 100 μL de virus à 900 μl de milieu dans le premier tube, mettre le bouchon sur le tube et mélanger son contenu au vortex pendant quelques secondes. Changer le cône sur la pipette, ajouter 100 µL de la première dilution à 900 µL de milieu dans le deuxième tube, mettre le bouchon sur le tube et vortex. Répétez la procédure jusqu'à ce que le tube de sixième.
    Remarque : Il est très important de changer le cône pour chaque dilution.
  6. Écrire le virus nom et des dilutions de pli sur les plaques de 12 puits de HEp-2. Ajouter une marque pour correspondre à la plaque et sa couverture car ils peuvent être séparés au cours de la coloration (étape 4,9). Retirer le support des plaques et distribuer 400 µL d’une dilution par puits. Incuber les plaques à 37 ° C pendant 2 h, pour l’adsorption du virus.
    Remarque : Changer l’embout de la pipette entre chaque inoculum ou passer du plus bas à la concentration la plus élevée avec le même embout. Ensemencer une série limitée de planches (1 à 2) en même temps pour éviter les séchage des cellules.
  7. Préparer la superposition de cellulose microcristalline lors de l’adsorption du virus (préparation extemporanée). Pour obtenir 100 mL de superposition, mélanger 10 mL de suspension microcristalline de 2,4 %, 10 mL de 2 x MEM et 80 mL de MEM avec 2 % FCS.
    1. Ajuster le pH de la 2 x MEM pour environ 7,2 avec une solution de bicarbonate de sodium stérile à 7,5 %, suite à l’indicateur de couleur. Ajouter la suspension microcristalline et la MEM et mélanger vigoureusement.
  8. À la fin de l’incubation de 2 h, ajouter 2 à 3 mL de superposition dans chaque loge des plaques de 12 puits sans enlever l’inoculum. Veillez à éviter la contamination des puits adjacents avec inocule titre viral élevé. Incuber les plaques à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant 6 jours. Ne déplacez pas la plaque et ne déplacez pas l’incubateur durant l’incubation.
  9. Faire colorer les cellules, en utilisant une solution de cristal violet (violet de gentiane 8 % [v/v], 2 %, formaldéhyde [v/v] et [v/v] 20 % d’éthanol dans l’eau).
    1. Protéger la surface de travail de la biosécurité du cabinet avec une feuille (le violet de gentiane couleurs fortement les surfaces).
    2. Secouer doucement les plaques à décoller de la superposition de la cellulose microcristalline. Retirez les surnageants et laver les cellules 2 x avec 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Manipulez les plaques une par une afin d’éviter les cellules de séchage. Ajouter 1 à 2 mL de la solution de violet de gentiane et attendez 10 à 15 min. retirer la solution, qui peut être réutilisée pour la coloration de la plaque ultérieur.
    3. Immerger les plaques et les couvercles dans l’eau de Javel fraîche pendant quelques secondes et, ensuite, laver soigneusement avec l’eau du robinet. Notez que les plaques et les couvertures sont décontaminés par l’eau de Javel.
    4. Mettre les plaques et les couvercles sur du papier absorbant et laissez-les sécher. Sécher les plaques à une température ambiante après le rinçage de l’eau et les stocker à température ambiante. Pour les longues périodes d’entreposage (mois), garder les plaques à l’abri de la lumière pour protéger la couleur. Notez que si les cellules perdent leur coloration, elles peuvent être tachées nouveau cristal violet.
  10. Calculer les titres de virus. Compter les plaques dans les puits des plaques sèches, qui sont visibles à le œil nu. Vérifiez que le nombre de plaques des dilutions différentes est cohérente (facteur 10 entre chaque dilution). Choisissez le puits où les plaques sont les plus faciles à compter. Évaluer le nombre de plaques par rapport au volume de l’inoculum et la dilution.
    Remarque : Sur l’exemple fourni dans la Figure 4, 21 plaques sont comptés à la dilution de 10-5 . Ils correspondent à un titre de
    figure-protocol-1
    figure-protocol-2

5. l’utilisation de Virus Recombinant HRSV-GFP pour surveiller la réplication virale dans les cellules traitées avec les petits ARN interférents ou antiviraux

Remarque : Exécutez toutes les étapes sauf 5.1 et 5.2.5 dans un environnement stérile en utilisant une classe de sécurité II.

  1. Surveiller l’effet du gène cellulaire silencieux sur la multiplication de RSV
    Remarque : Le protocole de transfection dépend du réactif (voir Table des matières).
    1. Préparer les plaques à 96 puits pour la mesure de la GFP. Deux jours avant le dosage, pour compte tenu des petits ARN interférents (siARN), préparer une solution de support réduits de sérum contenant des siARN à une concentration de 100 nM et un réactif de transfection de siARN dilué au 1/500. Incuber la solution pendant 30 min à température ambiante.
    2. Ajouter 25 µL de la solution dans les puits de la plaque préparée en 5.1.1 (en triple exemplaire). Ensemencez les puits avec 75 µL d’une suspension de cellules A549 à 4 x 105 cellules/mL dans le milieu complet sans antibiotiques pour obtenir une concentration finale de cellule de 3 x 105 cellules/mL. Incuber les plaques pendant 48 h à 37 ° C et 5 % de CO2.
      Remarque : La concentration finale de siARN est 25 nM et le volume de réactif de transfection final est 0,5 µL/puits).
    3. Infectent les cellules comme suit. Retirer le support des puits. Ajouter 100 µL de la suspension de la RSV-GFP à 50 000 UFP/mL et incuber pendant 2 h à 37 ° C et 5 % de CO2. Supprimer la suspension virale et ajouter 100 µL de DMEM avec 2 % FCS et sans rouge de phénol. Incuber les plaques à 37 ° C et 5 % de CO2.
    4. À 24 h et 48 h p.i., mesurer la fluorescence, à l’aide d’un spectrofluorimètre définie sur des longueurs d’onde d’excitation et d’émission de 488 et 520 nm, respectivement (fluorescence est exprimée en unités de fluorescence relative). Utiliser des cellules A549 infectés comme étalons pour les niveaux de fluorescence et d’arrière-plan.
      Remarque : Les cellules doivent être fixés avec 4 % de paraformaldéhyde (PFA) avant de les mesurer sans le couvercle de la plaque.
  2. Évaluation de l’inhibition de la drogue à l’aide de RSV-GFP
    1. Préparer les plaques à 96 puits pour la mesure de la GFP. Le jour avant le dosage, les semences des puits avec 100 µL d’une suspension de cellules HEp-2 à 5 x 105 cellules/mL dans le milieu complet sans rouge de phénol.
    2. Préparer une dilution en série de la testé (AZ4316 dans cet exemple) de la drogue en MEM complété avec 2 % FCS et antibiotiques (50 µL / puits). Préparer une suspension virale à 10 000 UFP/mL en MEM sans facteur vasculaire stromal (SVF) et sans rouge de phénol (50 µL / puits).
    3. Retirer le support de la 96 puits HEp-2 plaque et ajouter 50 µL de la suspension de la drogue et 50 µL de la suspension virale (en triple exemplaire). Effectuer une infection simulée en parallèle comme un contrôle.
      Remarque : La dilution de la drogue et de la suspension virale peuvent être mélangés avant de les ajouter sur les cellules, ou ils peuvent être ajoutés dans l’ordre.
    4. Incuber les plaques pendant 48 h à 37 ° C et 5 % de CO2.
    5. Mesurer la fluorescence, à l’aide d’un spectrofluorimètre comme indiqué au point 5.1.4. Utiliser mock-infecté les cellules HEp-2 comme des normes pour les concentrations de fond de fluorescence.

6. caractérisation des M2-1 localisation In Vivo avec le Virus Recombinant RSV-M2-1-GFP

Remarque : Exécutez les étapes 6.1 et 6.2 dans un environnement stérile, à l’aide d’une classe de sécurité II.

  1. Préparer une suspension de cellules HEp-2 à 5 x 105 cellules/mL dans le milieu complet. Graine de 1,5 mL de la suspension cellulaire dans un 35 mm boîte de pétri perméants de CO2 et adaptées pour vivre d’imagerie.
  2. Effectuer l’infection le jour après l’ensemencement avec le virus RSV-M2-1-GFP au MOI 1, comme décrit aux points 3.3 à 3.5 (enlever le milieu, ajouter 500 µL à 1 mL de l’inoculum et incuber les échantillons à 37 ° C en agitant doucement pendant 2 h ; enlever l’inoculum et ajouter 1,5 mL de MEM avec 2 % FCS). Incuber les cellules à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant le temps désiré (IBs commencera à apparaître depuis 10 h p.i.).
  3. Préchauffer la chambre d’incubation d’un microscope inversé équipé de 40 x 100 objectifs x à 37 ° C, avant de placer la boîte de pétri contenant les cellules infectées sur la scène. Ouvrez l’alimentation en CO2 et d’attendre pour la stabilisation de la mise au point.
  4. Effectuer d’imagerie avec des filtres de GFP-compatible, sous une fréquence d’excitation faible intensité et de l’image (de 1 à 0,1 image / min) pour minimiser la phototoxicité.

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Résultats

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Dans cet ouvrage, nous décrit un protocole détaillé pour produire des virus recombinants de RSV, exprimant une protéine fluorescente (Figure 2). Au pRSV-GFP, le gène de la GFP a été introduit entre les gènes P et M, comme pour le gène cerise en œuvre précédemment publiée21. Dans le pRSV-M2-1-GFP, le gène M2 a été laissé intact et un gène supplémentaire codant pour M2-1-GFP a été inséré entre SH et G gènes12. La ...

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Discussion

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Nous présentons ici une méthode de sauvetage de recombinant RSVs de cinq plasmides et leur amplification. La possibilité de manipuler le génome du virus a révolutionné la recherche virologie afin de tester des mutations et exprimer un gène additionnel ou une protéine virale étiquetée. La RSV, nous avons décrit et utilisé comme un exemple de cet article est un virus exprimant un gène rapporteur, la RSV-GFP (inédit) et exprime une protéine M2-1 fusionnée à la GFP tag12. Sauvetage de RSV est un défi ...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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Les auteurs remercient m. Qin Yu de AstraZeneca R & D Boston, MA, é.-u., pour fournir le médicament AZD4316. Les auteurs sont reconnaissants à la plateforme Cymages pour l’accès au microscope ScanR Olympus, qui était soutenu par des subventions de la région Ile-de-France (DIM ONE HEALTH). Les auteurs reconnaissent le soutien de l’INSERM et l’Université de Versailles Saint-Quentin.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
35 mm & micro-parabole pour l’imagerie de cellules vivantesIbidi81156
A549ATCCATCC CCL-185
Avicel RC-591FMC BioPolymerAvicel RC-591Des informations techniques et autres sur Avicels sont disponibles à l’adresse http://www.fmcbiopolymer.com. Conserver à température ambiante. Le protocole de l’étape 4 est optimisé pour ce réactif.
BSRT7/5non disponible dans le commerceVoir référence 22. Buchholz et al., 1999
SigmaHT90132
Microscope à fluorescence pour les observationsMicroscope OlympusIX73 Microscope
fluorescence pour vidéomicroscopieMicroscope OlympusScanR Microscope
Olympus HEp-2ATCCATCC CCL-23
HEPES &ge ; 99.5 %SigmaH3375
L-Glutamine (200 mM)ThermoFisher Scientific25030024
LIPOFECTAMINE 2000 REACTIVELe protocole ThermoFisher Scientificà l’étape 2.3. est optimisé pour ce réactif.
MEM (10x), sans glutamineThermoFisher Scientific11430030
MEM, Supplément GlutaMAXThermoFisher Scientific41090-028
MgSO4 ReagentPlus, &ge ; 99,5 %SigmaM7506
Opti-MEM I Sérum réduit moyenThermoFisher Scientific51985-026
Solution aqueuse de paraformaldéhyde, 32 %,Microscopie électronique15714
Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/mL)ThermoFisher Scientific15140122
Plasmidesnon disponibles dansle commerceVoir la référence 21. Rameix-Welti et al., 2014
Voir Saw RockerVWR444-0341
Si RNA GAPDHDharmaconON-TARGETplus siRNA
D-001810-10-05		SMARTpool et 3 des 4 siRNA individuels conçus par Dharmacon.
Si RNA IMPDH2DharmaconON-TARGETplus siRNA IMPDH2 Pool- Human
L-004330-00-0005		SMARTpool de 4 siRNA individuels conçus par Dharmacon.
Références et séquences individuelles
J-004330-06 : GGAAAGUUGCCCAUUGUAA ;
J-004330-07 : GCACGGCGCUUUGGUGUUC ;
J-004330-08 : AAGGGUCAAUCCACAAAUU ;
J-004330-09 : GGUAUGGGUUCUCUCGAUG ;
Si RNA RSV NDharmaconON-TARGETplus siRNA personnaliséUUCAGAAGAACUAGAGGCUAU et UUUCAUAAAUUCACUGGGUUA
SiRNA NTDharmaconON-TARGETplus Non-targeting Pool
SiRNA refection reagentDharmaconDharmaFECT 1 Ref : T-2001-03Le protocole des étapes 5.1.et 5.1.2 est optimisé pour ce réactif.
Bicarbonate de sodium 7,5 % solutionThermoFisher Scientific25080094
SpectrofluorimètreTecanTecan infinite M200PRO
Microscope à fluorescence à 11668019 de qualité EM Sciences

Références

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Mots-clés

Virus respiratoire syncytial recombinantsyst me de g n tique inverseamplification de stock viralessai de titrage par plaquescellules BSR T7 5infection de cellules HEp 2suivi de la fluorescence GFPrecouvrement la cellulose microcristallinecong lation pour la r colte viraleunit s formant des plaques

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