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Article de méthode

Convection Enhanced Delivery of Optogenetic Adeno-associated Viral Vector to the Cortex of Rhesus Macaque Under Guidance of Online MRI Images Convection Enhanced Delivery of Optogenetic Adeno-associated Viral Vector to the Cortex of Rhesus Macaque Under Guidance of Online MRI Images Convection Enhanced Delivery of Optogenetic Adeno-associated Viral Vector to the Cortex of Rhesus Macaque Under Guidance of Online MRI Images Conve

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DOI :

10.3791/59232

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23 mai 2019

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1Departments of Bioengineering, University of Washington, 2Washington National Primate Research Center, 3Department of Electrical and Computer Engineering, University of Washington, 4Department of Physiology and Center for Integrative Neuroscience, University of California, San Francisco

Dans cet article

Résumé

Ici, nous démontrons la résonance magnétique (MR)-guidée convection a augmenté la livraison (CED) des vecteurs viraux dans le cortex comme approche efficace et simplifiée pour réaliser l'expression optogénétique à travers de grandes zones corticales dans le cerveau macaque.

Résumé

Dans l'optogénétique des primates non humains (PSN), infecter de grandes zones corticales avec des vecteurs viraux est souvent une tâche difficile et longue. Ici, nous démontrons l'utilisation de la résonance magnétique (MR)-guidée convection améliorée de livraison (CED) des vecteurs viraux optogénétiques dans les cortices somatosensory (S1) primaires (S1) et moteurs (M1) des macaques pour obtenir l'expression corticale efficace et répandue de canaux ioniques sensibles à la lumière. Des vecteurs viraux associés à l'adéno (AAV) codant l'opsine rouge-shifted il C1V1 fusionné à la protéine fluorescente jaune (EYFP) ont été injectés dans le cortex des macaques rhésus sous CED MR-guidé. Trois mois après l'infusion, la formation image épifluorescente a confirméde grandes régions de l'expression optogénétique (-130 mm 2) dans M1 et S1 dans deux macaques. En outre, nous avons pu enregistrer des réponses électrophysiologiques fiables évoquées par la lumière à partir des zones d'expression à l'aide de tableaux micro-électrocorticographiques. L'analyse histologique et l'immunostaining postérieurs contre le journaliste ont indiqué l'expression optogenetic répandue et dense dans M1 et S1 correspondant à la distribution indiquée par la formation image épifluorescente. Cette technique nous permet d'obtenir l'expression sur de grandes zones du cortex dans un délai plus court avec des dommages minimes par rapport aux techniques traditionnelles et peut être une approche optimale pour la livraison virale optogénétique chez les grands animaux tels que les PSN. Cette approche démontre un grand potentiel de manipulation au niveau du réseau des circuits neuronaux avec une spécificité de type cellulaire dans les modèles animaux évolutivement proches des humains.

Introduction

L'optogénétique est un outil puissant qui permet la manipulation de l'activité neuronale et l'étude des connexions réseau dans le cerveau. La mise en œuvre de cette technique chez les primates non humains (PSN) a le potentiel d'améliorer notre compréhension du calcul neuronal à grande échelle, de la cognition et du comportement dans le cerveau des primates. Bien que l'optogénétique a été mise en œuvre avec succès dans les PSN au cours des dernières années1,2,3,4,5,6,7, un défi qui chercheurs face est d'atteindre des niveaux élevés d'expression à travers de grandes zones du cerveau chez ces animaux. Ici, nous fournissons une approche efficace et simplifiée pour atteindre des niveaux élevés d'expression optogénétique à travers de grandes zones du cortex chez les macaques. Cette technique a un grand potentiel pour améliorer les études optogénétiques actuelles chez ces animaux en combinaison avec l'enregistrement de pointe8,9 et la stimulation optique10 technologies.

Convection livraison améliorée (CED) est une méthode établie de livraison d'agents pharmacologiques et d'autres grandes molécules, y compris les vecteurs viraux, au système nerveux central11,12,13. Alors que les méthodes d'administration conventionnelles impliquent de multiples infusions à faible volume réparties dans de petites régions du cerveau, le DEC peut obtenir une distribution plus large et plus uniforme des agents avec moins d'infusions. Le flux de fluide en vrac (convection) sous pression pendant la perfusion permet une transduction plus large et uniformément distribuée du tissu cible lors de la transmission de vecteurs viraux atteints de DEC. Dans des études récentes, nous avons démontré la transduction et l'expression optogénétique suivante de grandes zones du moteur primaire (M1) et des cortices somatosensory (S1)9 et thalamus14 utilisant la résonance magnétique (MR)-guidé CED.

Ici, nous décrivons l'utilisation du CED pour réaliser l'expression optogénétique à travers de grandes zones corticales avec seulement quelques injections corticales.

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Protocole

Toutes les procédures ont été approuvées par l'Université de Californie, San Francisco Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) et sont conformes au Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire. La procédure suivante a été effectuée à l'aide de deux macaques rhésus mâles adultes de 8 et 7 ans, pesant respectivement 17,5 kg et 16,5 kg (singe G et singe J).

REMARQUE : Utilisez des techniques aseptiques standard pour toutes les interventions chirurgicales.

1. Imagerie de base

  1. Sédentaire et intubée l'animal et maintenir une anesthésie générale sous isoflurane (concentration a changé entre 0 et 5% au besoin, selon les signes vitaux tels que la fréquence respiratoire et la fréquence cardiaque). Surveillez la température de l'animal, la fréquence cardiaque, la saturation en oxygène, les réponses électrocardiographiques et la pression partielle de co2 tout au long de la procédure.
  2. Placez l'animal dans un cadre stéréotaxique compatible MR (voir la Table des Matériaux)dans lequel il restera tout au long de la procédure. Connectez l'animal à un isoflurane portable compatible AVEC le MR et transportez-le au scanner IRM (3 T).
  3. Acquérir le T1 standard (angle de basculement de 9 degrés, temps de répétition/temps d'écho 668,6, taille de la matrice 192 x 192 x 80 , épaisseur de tranche - 1 mm) et T2 (angle de basculement à 130 degrés, temps de répétition/temps d'écho - 52,5, taille de la matrice ' 256 x 256 x 45, épaisseur de tranche ' 1 mm) images mMR anatomiques en tant qu'images de base référence et pour la planification chirurgicale.
  4. Récupérer l'animal de l'anesthésie et le transporter à la zone d'hébergement des animaux.
  5. Utilisez les images T1 et T2 acquises pour déterminer le placement de la craniotomie. L'emplacement de la craniotomie peut être déterminé avec précision en faisant correspondre la zone corticale d'intérêt de MR avec l'atlas du cerveau macaque (Paxinos, Huang, Petride, Toga 2nd Edition). En outre, ces images de base peuvent fournir une estimation de l'emplacement de l'infusion virale. Les régions corticales d'intérêt démontrées ici sont M1 et S1.

2. Implantation de chambre MR-Compatible

  1. Sédentaire et intuber l'animal et maintenir l'anesthésie générale avec une surveillance anesthésique standard comme dans 1.1.
  2. Placez l'animal dans le cadre stéréotaxique compatible MR dans lequel il restera tout au long de l'implantation de chambre et de la livraison de vecteur viral. Connectez l'animal à une machine isoflurane compatible MR portable.
  3. Créer une incision sagittale à environ 2 cm de la ligne médiane avec une longueur d'environ 5 cm avec un scalpel.
  4. Enlever le tissu mou sous-jacent du crâne à l'aide d'ascenseurs (voir Tableau des matériaux).
  5. Créer une craniotomie circulaire (2,5 cm de diamètre) pour couvrir les trajectoires pré-planifiées pour les injections à l'aide d'une tréphine (voir Tableau des matériaux).
    1. Abaissez le point de centrage de la trephine au-delà du bord de la tréphine. Créer une indentation au centre de la craniotomie prévue suffisamment profondément dans le crâne pour ancrer la tréphine à l'aide du point de centrage réglable de la tréphine. Faites preuve de prudence pour éviter de pénétrer complètement à travers la profondeur du crâne, car cela pourrait endommager le tissu neural sous-jacent.
    2. Rincer périodiquement la zone avec salin au besoin pour maintenir l'humidité des tissus tout au long de la craniotomie.
    3. Une fois que le centre a été fait, abaisser la trephine sur le crâne et faire pivoter la trephine dans le sens des aiguilles d'une montre et dans le sens inverse des aiguilles d'une montre tout en appliquant une pression vers le bas jusqu'à ce que le bouchon osseux peut être enlevé avec des forceps. Faites preuve de prudence pour éviter d'endommager le tissu sous-jacent avec la tréphine.
  6. Enfiler une fine suture (taille 6-0) à travers la dura au centre de la craniotomie et soulever la dura en tirant doucement la suture de la surface du cerveau créant une tente au centre de la craniotomie.
  7. Ensuite, perforez la dura près du centre de la tente à l'aide de ciseaux ophtalmiques fins pour éviter d'endommager le cerveau. Couper ensuite la dura du centre au bord de la craniotomie et continuer le long du bord avec de fines ciseaux opthalmiques.
  8. Montez la chambre CYlindrique compatible CED MR (figure1; voir la section 4 pour les instructions de production) au crâne au-dessus de la craniotomie pour fournir un soutien à la canule pendant l'infusion DEC de sorte que la courbure de la flange de chambre s'aligne bien avec la courbure du crâne.
  9. Fixez les implants au crâne à l'aide de vis en plastique et d'acrylique dentaire ou de quelques vis en titane.

3. Livraison de vecteurs viraux

  1. Peu de temps après l'implantation de la chambre compatible MR et l'insertion de la grille d'injection de canules (figure1A-B, figure supplémentaire 1) dans la chambre, remplissez la grille de salin (0,9% NaCl) pour visualiser les emplacements d'injection via des images anatomiques MR et remplir les cavités de la chambre de gélatine stérile humide absorbable pour maintenir l'humidité du cerveau (Figure 1F).
  2. Couvrir la peau et le cylindre d'un drapé d'incise antimicrobien stérile pour maintenir la stérilité des cylindres pendant le transport et les perfusions MR. Placez une capsule de vitamine E pour marquer le haut de la grille d'injection pour une identification positive.
  3. Pendant que l'animal reste intubé, détachez le tube endotrachéal du circuit d'anesthésie et rattachez-le à une machine isoflurane compatible AVEC le MR portable et transportez l'animal au scanner IRM.
  4. Acquérir des images T1 (angle de basculement de 9 degrés, temps de répétition/temps d'écho 668,6, taille de la matrice 192 x 192, épaisseur de tranche de 1 mm, 80 tranches) pour calculer la distance entre le haut de la grille d'injection et la surface corticale. La capsule de vitamine E est clairement visible dans les images T1 et doit être utilisée comme marqueur pour le haut de la grille d'injection (Figure 2A). Utilisez l'outil de règle du logiciel d'imagerie MR pour mesurer la distance entre le haut de la grille d'injection et la surface corticale.
  5. Acquérir des images T2 (angle de bascule à 130 degrés, temps de répétition/temps d'écho 52,5, taille de la matrice 256 x 256, épaisseur de tranche - 1 mm, 45 tranches) pour déterminer les guides de canule optimaux pour chaque site en fonction du site ciblé de perfusion (Figure 2B-C). Comme mentionné précédemment, la grille de canule est remplie de saline qui est le mieux visible dans les images T2. À l'aide du logiciel d'imagerie MR, faites défiler les plans coronal et sagittal pour trouver l'emplacement cible de l'infusion.
  6. Après avoir décongelé le vecteur viral pendant quelques heures à température ambiante, mélanger le vecteur viral avec l'agent de contraste MR gadoteridol (Ratio de 250:1; 2mM Gd-DTPA, voir Table of Materials) par pipette ou vortex de mélange.
    REMARQUE: La technique présentée a été testée pour les vecteurs AAV avec un promoteur CamKIIa conduisant l'expression de C1V1 fusionné à EYFP (AAV2.5-CamKII-C1V1-EYFP, titer: 2.5 x 1012 molécules de virus/mL; voir Tableau des matériaux).
  7. Chargez le virus mixte dans un tube IV haute pression de 0,2 ml (voir Tableau des matériaux).
  8. Établir un champ stérile à l'extérieur du scanner MR pour la préparation de la ligne d'infusion virale.
  9. À l'aide d'un tube IV à haute pression, connectez une longue ligne d'extension (environ 3 à 5 mètres, selon l'emplacement de la pompe à perfusion par rapport à l'alésage MR) à une seringue DE 3 ml compatible avec le MR et à la solution de premier plan avec saline.
  10. Connectez l'extrémité distale de la longue ligne d'extension à l'extrémité proximale du tube IV de 0,2 mL chargé du virus et attachez la canule résistante au reflux avec une pointe de 1 mm (figure2D; voir la section 5 pour les instructions de production de canules) à l'extrémité distale de cet assemblage avec un connecteur de cathéter de style pince (voir Tableau des matériaux) (Figure 2E).
  11. Enfin, mettre la seringue dans une pompe compatible MR (voir Tableau des matériaux). Placez le contrôleur de pompe dans la salle de commande du scanner car il n'est pas compatible AVEC le MR.
  12. À l'aide des images mMR anatomiques de base obtenues auparavant, sélectionnez l'emplacement de la grille d'injection de canules et la profondeur d'insertion nécessaires pour atteindre le site d'infusion cible. Marquez la profondeur d'insertion sur la canule à l'aide de ruban stérile.
  13. Commencer l'infusion à un taux de 1 l/min et valider visuellement le flux du liquide dans la ligne d'infusion en observant l'éjection du liquide de la pointe de la canule.
  14. Insérez la canule manuellement à travers la grille d'injection à la profondeur de la cible tout en maintenant le flux dans la ligne d'infusion, car cela empêchera le tissu pénétré de obstruer la canule pendant l'insertion.
  15. Acquérir des images rapides (2 minutes) flash T1 pondérées (angle de basculement à 30 degrés, temps de répétition/temps d'écho 3,05, taille de la matrice 128 x 128, épaisseur de tranche de 1 mm, 64 tranches) pour la surveillance en ligne de l'infusion du vecteur viral.
  16. Après l'infusion de 10 l du vecteur de sorte que suffisamment de virus est infusé pour détecter dans le scanner MR, obtenir des images MR pour vérifier le placement correct de la canule comme en témoigne la propagation observée du virus. Si la profondeur de la canule insérée est incorrecte, ajustez la profondeur en conséquence ou retirez lentement la canule et tentez à nouveau l'insertion comme dans 3.12.
  17. Surveillez l'infusion par l'intermédiaire des images MR en ligne (flash T1 pondéré) et augmentez le taux d'infusion à 5 l/min de 1 l/min toutes les quelques minutes (figure 3A).
  18. Après l'infusion d'environ 40 l du vecteur viral, commencez à réduire le taux d'infusion de 1 l/min et arrêtez l'infusion après l'injection de 50 l et laissez la canule en place pendant 10 minutes.
  19. Retirez lentement la canule du cerveau et passez à l'endroit suivant. Répétez les étapes 3.9 à 3.19 pour chaque emplacement.
  20. Couvrir le cylindre d'un drapé stérile à la fin des injections, avant le transport des animaux. Transportez ensuite l'animal à la salle d'opération.
  21. Soit explanter la chambre compatible MR et fermer l'incision chirurgicale en remplaçant le lambeau osseux et le muscle sus-déroulant et en suçant la peau en utilisant des techniques aseptiques standard ou remplacer la chambre par un cylindre de titane et dura artificiel (voir Yazdan-Shahmorad et coll. 20169) pour l'enregistrement et la stimulation neuronales.

4. Production de chambre compatible MR

  1. Fabriquer la grille d'injection de canules en nylon (Figure 1A-B) en usinant selon les dimensions spécifiées (Figure supplémentaire 1).
  2. Impression 3D du cylindre compatible MR à partir de styrène butadène acrylonitrile (ABS0 plastique (figure 1C-E) (voir Dossier supplémentaire 1-3;voir Tableau des matériaux pour l'imprimante 3D et les matériaux).
    REMARQUE: Une conception maintient une grille d'injection de canules fixes dans le cylindre compatible MR (Figure 1C), tandis qu'une autre permet la rotation de la grille, prolongeant la région d'injection (Figure 1D-E).
  3. Enfiler la grille d'injection de canules et appuyez sur la cavité correspondante de la chambre compatible MR de sorte que les deux pièces présentent le même filetage.
    REMARQUE: N'importe quel type de filetage peut être utilisé à condition que les deux composants ont le même filetage.
  4. Insérez la grille d'injection de canules en nylon en baisant dans le trou tapé du cylindre compatible MR.

5. Production de canule résistante au reflux13

  1. Couper un tube de silice de 30 cm de long avec 0,32 mm d'ID et 0,43 mm DMo pour le tube de silice interne (voir Tableau des matériaux) à l'aide d'une lame de rasoir.
  2. Couper un tube de silice de 7,5 cm de long et un tube de silice de 5 cm de long avec 0,45 mm d'ID et 0,76 mm d'OD pour le tube extérieur de silice (voir Tableau des matériaux).
  3. Adhérer à la tubulure externe de 7,5 cm à la tubulure intérieure de 30 cm avec cyanoacrylate de telle sorte que le tube intérieur s'étend 1 mm au-delà du tube externe, ce qui rend l'étape résistante au reflux (Figure 2D). Pour s'assurer que le cyanoacrylate n'entre pas à l'intérieur du tube intérieur, placez le cyanoacrylate à l'extérieur du tube intérieur loin de la pointe de la canule.
  4. Collez le tube de silice de 5 cm de long à l'autre extrémité du tube intérieur pour être attaché au connecteur de cathéter de style pince (voir l'étape 3.10).

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Résultats

Convection Enhanced Delivery (CED) dans le cadre de l'IRM

La propagation du vecteur viral a été surveillée lors de l'infusion de DEC sous la direction d'images MR en ligne (figure 3A). Dans cette étude, S1 et M1 de deux singes ont été ciblés (Figure 3B). Les volumes de distribution tridimensionnels ont été estimés dans une analyse post-hoc des images MR...

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Discussion

Ici, nous dénoncons une technique faisable et efficace pour réaliser l'expression optogénétique à grande échelle dans le cortex somatosensoriel et moteur primaire de NHP par LE CED MR-guidé. L'utilisation du CED MR-guidé présente des avantages significatifs au-dessus des méthodes traditionnelles de perfusion virale dans le cerveau de NHP. Un tel avantage est la capacité d'atteindre l'expression sur de grandes zones avec moins d'infusions requises. Par exemple, avec des méthodes conventionnelles, des injections multiples ...

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Déclarations de divulgation

PNS a un intérêt financier dans Neuralink Corp., une société qui développe des thérapies cliniques utilisant la stimulation cérébrale.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par american Heart Association postdoctoral fellowship (AY), Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) Reorganization and Plasticity to Accelerate Injury Recovery (REPAIR; N66001-10-C-2010), R01. NS073940, et par le Centre d'imagerie des neurosciences de l'UCSF. Ce travail a également été soutenu par l'Eunice Kennedy Shiver National Institute of Child Health and Human Development des National Institutes of Health sous le numéro de prix K12HD073945, le Washington National Primate Research Center (WaNPCR, P51 OD010425), et le Center for Neurotechnology (CNT, un national Science Foundation Engineering Research Center sous la fondation Grant EEC-1028725). Nous remercions Camilo Diaz-Botia, Tim Hanson, Viktor Kharazia, Daniel Silversmith, Karen J. MacLeod, Juliana Milani et Blakely Andrews pour leur aide dans les expériences et Nan Tian, Jiwei He, Peter Ledochowitsch, Michel Maharbiz et Toni Haun pour leur aide technique.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tube IV haute pression de 0,2 mlSmiths Medical Inc., Dublin, OH, États-Unis533640
Tube en silice de 0,32 mm de diamètre intérieur, 0,43 mm de diamètre extérieur Tube en silice1068150027
de 0,45 mm de diamètre intérieur, 0,76 mm de diamètre extérieur Tube en silicePolymicro Technologies1068150625
AAV2.5-CamKII-C1V1-EYFPPenn Vector Core, Université de Pennsylvanie
ABS plastiqueStratasys, MN, USAABSplus-P430
Champ incisé antimicrobien3M6650EZIoban Drape
Acrylique DentaireHenry Schein, Inc.1013117Ascenseurs d’agent de liaison acrylique
VWR International, LLC.10196-564Langenbeck Élévateur, pointe large
Suture fineMcKesson Medical-Surgical Inc.
GadoteridolProhance, Bracco Diagnostics, Princeton, NJ0270-1111-04
Laser pour la stimulation lumineuseOmicron-Laserage, AllemagnePhoxX 488-60
Compatible MR Seringue 3 ccAppareil de Harvard, Holliston, MA, USA59-8377
Logiciel d’imagerie MRPixmeoOsiriX MD 10.0
Compatible MR PompeHarvard apparatus, Holliston, MA, USAHarvard PHD 2000
Cadre stéréotaxique compatible MRKOPF1430M MRI
Perifix Clamp Style Catheter ConnectorB-Braun, Bethlehem, PA, USAN/A
Vis en plastiquePlastiques 10-80 x 1/8N Vis en nylon
Vis en titaneCrist Instrument Co., Inc.6-YCX-0312Vis à os autotaraudeuses
TrephineGerMedUSA Inc,SKU :GV70-42
uPrinter SE Imprimante 3DStratasys, MN, USAN/A
Capsule de vitamine EPure Encapsulations, LLC.DE1
Gélatine résorbable stérile humidePfizer Inc.AZL0009034201Gelfoam
1034505

Références

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