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Article de méthode

Régulation spécifique du circuit d'analyse des cellules neuronales neuronales hippocampales adultes

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DOI :

10.3791/59237

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24 juillet 2019

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1Department of Pharmacology, University of North Carolina Chapel Hill, 2Neuroscience Center, University of North Carolina Chapel Hill, 3Neuroscience Curriculum, University of North Carolina Chapel Hill

Dans cet article

Résumé

Le but de ce protocole est de décrire une approche pour analyser le comportement des cellules neurales adultes de tige/progéniteur en réponse à la manipulation chimiogénétique d'un circuit neural local spécifique.

Résumé

La neurogenèse adulte est un processus dynamique par lequel les cellules souches neurales nouvellement activées (NSC) dans la zone subgranulaire (SGZ) du gyrus denté (DG) génèrent de nouveaux neurones, qui s'intègrent dans un circuit neuronal existant et contribuent à des fonctions hippocampales spécifiques . Fait important, la neurogenèse adulte est très sensible aux stimuli environnementaux, ce qui permet une régulation dépendante de l'activité de diverses fonctions cognitives. Une vaste gamme de circuits neuronaux de diverses régions du cerveau orchestre ces fonctions cognitives complexes. Il est donc important de comprendre comment des circuits neuronaux spécifiques régulent la neurogenèse adulte. Ici, nous décrivons un protocole pour manipuler l'activité de circuit neural utilisant le récepteur de concepteur exclusivement activé par la technologie de drogues de concepteur (DREADDs) qui règle des NSC s'est néréiade et la progéniture nouveau-née chez les rongeurs. Ce protocole complet inclut l'injection stéréotaxique des particules virales, la stimulation chimiogénétique des circuits neuronaux spécifiques, l'administration analogique de thymidine, le traitement de tissu, l'étiquetage d'immunofluorescence, l'imagerie confocale, et l'imagerie l'analyse de divers stades des cellules précurseurs neuronales. Ce protocole fournit des instructions détaillées sur les techniques de récupération d'antigènes utilisées pour visualiser les CNS et leur progéniture et décrit un moyen simple, mais efficace, de moduler les circuits cérébraux à l'aide de l'oxyde de clozapine N (CNO) ou de l'eau potable contenant du CNO et Virus exprimant des DREADDs. La force de ce protocole réside dans son adaptabilité à étudier une gamme variée de circuits neuronaux qui influencent la neurogenèse adulte dérivée des CNS.

Introduction

La neurogenèse adulte est un processus biologique par lequel de nouveaux neurones naissent chez un adulte et s'intègrent dans les réseaux neuronaux existants1. Chez l'homme, ce processus se produit dans le gyrus denté (DG) de l'hippocampe, où environ 1.400 nouvelles cellules naissent chaque jour2. Ces cellules résident dans la partie intérieure de la DG, qui abrite une niche neurogène, appelée zone sous-granulaire (SGZ). Ici, les cellules souches neurales adultes hippocampal (NSC) subissent un processus développemental complexe pour devenir des neurones entièrement fonctionnels qui contribuent à la régulation des fonctions spécifiques de cerveau, y compris l'apprentissage et la mémoire, la régulation d'humeur, et la réponse d'effort3 ,4,5,6. Pour influencer les comportements, les NSC adultes sont fortement réglementés par divers stimuli externes d'une manière dépendante de l'activité en répondant à un éventail de signaux chimiques locaux et distal. Ces indices chimiques comprennent les neurotransmetteurs et les neuromodulateurs et agissent d'une manière spécifique de circuit de diverses régions du cerveau. Fait important, la large convergence de ces indices chimiques sur les CNS permet une régulation unique et précise de l'activation des cellules souches, de la différenciation et des décisions relatives au sort.

L'un des moyens les plus efficaces d'interroger la régulation des circuits des CNS adultes in vivo est de jumeler l'analyse de l'immunofluorescence avec des manipulations à l'échelle du circuit. L'analyse d'immunofluorescence des CNS adultes est une technique couramment utilisée, où des anticorps contre des marqueurs moléculaires spécifiques sont utilisés pour indiquer le stade de développement des CNS adultes. Ces marqueurs incluent : nestin comme cellule de glia le radiale et marqueur neural tôt d'ancêtre, Tbr2 comme marqueur intermédiaire d'ancêtre, et dcx comme marqueur de neuroblaste et immaturedeneurone 7. En outre, en administrant des analogues thymidine tels que BrdU, CidU, Idu, et Edu, les populations cellulaires subissant la phase S peuvent être individuellement étiquetés et visualisés8,9,10. En combinant ces deux approches, un large éventail de questions peuvent être étudiées, allant de la façon dont la prolifération est réglementée à des stades de développement spécifiques, à la façon dont divers indices affectent la différenciation du CNS et la neurogenèse.

Plusieurs options existent pour manipuler efficacement les circuits neuronaux, y compris la stimulation électrique, l'optogénétique et la chimiogénétique, chacun e avec ses propres avantages et inconvénients. La stimulation électrique implique une chirurgie étendue où des électrodes sont implantées à une région spécifique du cerveau qui sont plus tard utilisées pour transmettre des signaux électriques pour moduler une région cérébrale ciblée. Cependant, cette approche manque à la fois de spécificité cellulaire et de circuit. L'optogénétique implique la livraison de particules virales qui codent un récepteur activé par la lumière qui est stimulé par un laser émis par une fibre optique implantée, mais nécessite des manipulations étendues, un coût élevé, et des chirurgies complexes11. La chimiogénétique implique la livraison de particules virales qui codent un récepteur de concepteur exclusivement activé par des médicaments de concepteur ou DREADDs, qui sont ensuite activés par un ligand spécifique et biologiquement inerte connu sous le nom de clozapine N-oxyde (CNO)12 . L'avantage d'utiliser des DREADD s'adressent pour manipuler les circuits neuronaux locaux qui régulent les CNS adultes réside dans la facilité et les différentes voies d'administration du CNO. Cela permet une approche moins longue avec une manipulation réduite des animaux, qui est facilement adaptable pour les études à long terme pour moduler les circuits neuronaux.

L'approche décrite dans ce protocole est une collection complète de divers protocoles requis pour interroger avec succès la régulation de circuit de la neurogenèse hippocampal adulte qui combine des techniques d'immunofluorescence et des manipulations de circuit en chimiogénétique. La méthode décrite dans le protocole suivant est appropriée pour stimuler ou inhiber un ou plusieurs circuits simultanément in vivo pour déterminer leur fonction de régulation sur la neurogenèse adulte. Cette approche est mieux utilisée si la question n'a pas besoin d'un degré élevé de résolution temporelle. Les questions nécessitant un contrôle temporel précis de la stimulation/inhibition à une certaine fréquence, peuvent être mieux traitées en utilisant l'optogénétique13,14. L'approche décrite ici est facilement adaptée pour des études à long terme avec une manipulation minimale des animaux, surtout lorsque le stress est une préoccupation majeure.

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Protocole

Toutes les procédures, y compris les sujets animaux, ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (IACUC) de l'Université de Caroline du Nord Chapel Hill.

1. Injection stéréotaxique de particules virales

  1. Déterminer les circuits neuronaux en question. Ceci déterminera le virus et la ligne de souris utilisé pour la procédure suivante.
    REMARQUE: Pour cet exemple, les projections contralatérales de cellules moussues sont stimulées pour analyser ses effets sur la neurogenèse adulte. Les particules virales codant AAV5-hSyn-DIO-hM3Dq-mCherry sont livrées à la DG des souris 5ht2A-Cre15.
  2. Administrer méloxicam (5 mg/kg, sous-cutané) au moins 30 min préopératoirement pour fournir une analgésie préventive à une souris heterozygous 5ht2A-Cre mâle de 8 semaines.
  3. Anesthésiez la souris à l'aide d'un mélange d'oxygène isoflurane de 4 % jusqu'à ce que sa respiration ralentisse et que la souris soit inconsciente à l'aide d'une chambre isoflurane. Orteil pincer la souris pour s'assurer qu'il n'est pas réactif.
  4. Placez la souris dans le stéréotaxe sur un petit coussin chauffant animal pour la régulation thermique et appliquez le lubrifiant pour les yeux à chaque œil. Réduire l'isoflurane à 1,5 % une fois que l'animal est à l'intérieur du stéréotaxe.
    REMARQUE: Le placement de la barre d'oreille pendant cette étape est important. Assurez-vous que la tête est de niveau après le placement de la barre d'oreille. Des instructions plus détaillées peuvent être trouvées dans Geiger et al.16.
  5. Placer le produit d'épilation sur la tête et laisser s'asseoir jusqu'à 1 min maximum. Enlever les cheveux en essuyant la tête avec des lingettes à l'éthanol. Si les cheveux ne sont pas complètement enlevés, répétez ce processus jusqu'à ce que le haut de la tête soit glaçant.
  6. Désinfecter la zone glaçante avec une solution povidone-iode au moins 3 fois.
  7. Placez la solution topique de lidocaïne sur la peau glaçante de la tête et attendez 1 min. Enlevez la lidocaïne topique de la tête et faites une petite incision sur la tête du début des yeux au début des oreilles environ 2 mm à l'aide d'un scalpel chirurgical.
    REMARQUE: Orteil pincer la souris pour s'assurer qu'il est complètement sédatif avant de faire des incisions.
  8. Retirez le cuir chevelu et nettoyez le tissu conjonctif sur le dessus de la tête en utilisant des cotons-tiges stérilisés jusqu'à ce que le bregma soit facilement identifiable.
  9. Localisez le bregma et ajustez la tête de sorte que le bregma et le lambda soient tous deux au même plan en plaçant la perceuse aux deux coordonnées et en assurant qu'elles s'alignent. En outre, alignez l'hémisphère gauche et droit en plaçant la perceuse à gauche/droite d'une région entre bregma et lambda.
    REMARQUE: Cette étape est très importante; le placement de tête mal aligné perturbera des coordonnées stéréotaxiques.
  10. Percer aux coordonnées suivantes à partir de bregma à l'aide d'un bit de forage de 0,5 mm : axe postérieur antérieur (AP) -2,00 mm, axe latéral médial (ML) de 1,50 mm. Faire un trou de forage de 0,5 mm à 1 mm de diamètre.
    REMARQUE: Modifier cette étape avec des coordonnées spécifiques au circuit en question. Cet exemple vise un gyrus denté unilatéral contenant des cellules moussues et détermine leur effet sur les cellules souches neurales adultes du côté contralatéral.
  11. Passer la perceuse à une seringue de 5 l et à une aiguille de 26 à 33 G. Zéro à bregma, puis injecter aux coordonnées suivantes en plaçant l'aiguille dans le trou de forage à l'axe postérieur antérieur -2,00 mm, axe latéral médial -1,50 mm, axe ventral dorsal -2,3 mm.
  12. Infuser 500 nL de virus adéno-associé (AAV) d'un noyau viral ou d'une source commerciale à l'hémisphère approprié, à 50 à 100 nL/min à l'aide d'une pompe à perfusion (Tableau des matériaux). Attendez au moins 5 minutes après injection avant d'enlever lentement l'aiguille du cerveau.
    REMARQUE: Ces coordonnées peuvent nécessiter un ajustement en fonction de l'âge et de la taille de la souris. Certains sérotypes viraux ont des modèles de diffusion différents, il est préférable d'effectuer des expériences pilotes pour tester la propagation virale avant une expérience complète.
  13. Nettoyer le cuir chevelu et la peau autour de l'incision à l'aide de salin, puis sceller l'incision à l'aide d'adhésif tissulaire (Table des matériaux) tout en tenant la peau avec une pince à épiler. Effectuer toutes les procédures postopératoires telles que la surveillance pendant la récupération sur un coussin chauffant jusqu'à ce que la souris soit active, l'application d'analgésiques sur la plaie et l'administration d'analgésiques pendant deux jours.
    REMARQUE: Beaucoup d'expériences exigent le temps d'attente de deux/4 semaines après l'infusion virale pour l'expression virale appropriée.

2. Administration de l'oxyde de clozapine

  1. Préparer une solution CNO stock en dissolvant 10 mg de CNO dans 100 L de sulfoxide de diméthyle (DMSO) et de vortexing.
    REMARQUE: Si la solution ne se dissout pas complètement, augmenter le volume de DMSO, mais trop de DMSO peut rendre l'eau amère. Ne dépassez pas 0,1 % de DMSO dans la solution d'eau CNO ou plus de 200 L de DMSO pour une solution de 200 ml. La solution de stock CNO peut être stockée à -20 oC pendant une durée pouvant aller jusqu'à deux semaines.
  2. Ajouter une solution de bouillon CNO de 10 à 50 l à chaque 200 ml d'eau pour une concentration finale de 1 à 5 mg/200 ml. Préparer le mélange d'eau CNO frais tous les jours.
    REMARQUE: Certains groupes ont complété jusqu'à 1% de saccharine dans l'eau pour masquer l'amertume si les souris s'abstiennent de boire. Le circuit étudié a montré une réponse différente basée sur l'étendue de l'activation. En général, 1 mg CNO/200 ml est suffisant pour stimuler la plupart des circuits17.
  3. Placez la solution CNO dans un contenant couvert de papier d'aluminium ou protégé par la lumière lors de l'administration à des souris deux semaines après la récupération de l'injection stéréotaxique de l'étape 1.13 sur une période de 4 jours.
    REMARQUE: CNO est sensible à la lumière; réduire l'exposition à la lumière pendant tout le processus.
  4. Mesurer et enregistrer la solution d'eau CNO consommée tous les jours lors de la préparation d'une solution CNO fraîche. En moyenne, une souris adulte consommera environ 4 ml de mélange d'eau CNO. En outre, enregistrez le poids de la souris tous les jours pour vous assurer qu'ils boivent.
  5. Assurez-vous que des contrôles appropriés sont utilisés pour chaque expérience. Inclure à la fois un contrôle CNO et DREADD. Un exemple d'une configuration expérimentale comprendrait : (1) véhicule - véhicule amphibie autonome (AAV) avec journaliste viral aucun DREADD, (2) CNO - AAV avec journaliste viral aucun DREADD, et (3) CNO - AAV DREADD.
    REMARQUE: Tous les groupes incluent DMSO dans la solution. Les contrôles DMSO ne sont pas inclus parce que les animaux reçoivent moins de 0,1% de DMSO, ce qui n'a pas été démontré pour avoir des effets indésirables sur les cellules souches neurales adultes chez la souris. S'il y a des préoccupations concernant l'utilisation de DMSO dans l'eau potable, ajoutez un autre aucun DMSO et contrôle salin.

3. Étiquetage analogique Thymidine

  1. Le jour de la collecte des tissus, 4 jours après l'administration de CNO, étiquetez les cellules proliférantes en effectuant une série d'injections intrapéritoyales de thymidine, 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (Edu).
    REMARQUE:     Ce protocole utilise Edu. Cependant, il existe plusieurs analogues thymidine qui peuvent étiqueter efficacement les populations de cellules proliférantes, y compris Brdu, Idu, et Cidu8.
    1. Peser Edu et dissoudre dans la solution d'injection de chlorure de sodium de qualité vétérinaire 0,9% à 4 mg/mL en vortexant et en plaçant sur un rotor pendant 15 min.
      REMARQUE: Les analogues de la thymidine sont toxiques et sensibles à la lumière. Suivez les fiches de données sur la sécurité des matériaux (MSDS) lors de la manipulation et de la solution de couverture de l'exposition à la lumière à l'aide de papier d'aluminium.
    2. Administrer Edu intraperitoneally à 40 mg/kg ou 0,1 ml/10 g de poids corporel de la solution Edu 4 mg/mL 4 fois tous les 2 h.
      REMARQUE: Les doses supérieures à 50 mg/kg atteignent des niveaux de saturation proches et n'augmenteront pas la quantité de cellules proliférantes étiquetées de manière significative18. Il est crucial que toutes les souris reçoivent la même quantité d'injections Edu depuis l'étiquetage incorrect peut fausser les résultats.

4. Préparation et traitement des tissus

  1. Deux heures après la dernière injection d'Edu, anesthésier la souris à l'aide d'une chambre isoflurane jusqu'à ce que la respiration soit considérablement réduite et que l'orteil soit complètement sédatif.
  2. Fixez la souris à la surface en utilisant des aiguilles et faites une petite incision exposant le cœur. Insérez une aiguille de 25 G à l'aorte gauche et coupez le ventricule droit pour la perfusion transcardique avec la solution saline tamponnée de phosphate (PBS) à un débit de 1 à 4 ml/min jusqu'à ce que le tissu hépatique soit éliminé.
  3. Passez la solution de perfusion au paraformaldéhyde (PFA) de 4 % et perflez environ 15 à 20 ml pour fixer le tissu cérébral.
    REMARQUE: Des instructions plus détaillées sur le processus de perfusion peuvent être trouvées dans Gage et al.19. Les tremblements d'animaux seront observés lorsqu'ils sont bien cuits.
  4. Retirez la tête à l'aide d'une paire de gros ciseaux, puis effectuez une série d'incisions minutieuses pour libérer le cerveau du crâne. Conserver les tissus cérébraux à 4 oC dans 4 % de PFA pendant la nuit pour continuer à réparer.
  5. Retirez le tissu cérébral de la solution PFA de 4 % et placez-le dans une solution de saccharose de 10 % dans le PBS pour cryoprotéger les tissus pendant 24 h à 4 oC. Transférer ensuite le tissu à une solution PBS de saccharose de 30 % pendant 24 h à 4 oC avant la section.
    REMARQUE: Le tissu cérébral coulera dans le saccharose lorsqu'il sera prêt pour la section du microtome. Le tissu cérébral peut être stocké à long terme dans 30% de saccharose.
  6. Section tissu cérébral coronally en sections de 40 m à l'aide d'un microtome. Recueillir les sections commençant au début du gyrus denté, environ -1,20 mm de bregma, et se terminant après la plaque est complète avec la première section étant la plus antérieure et la dernière section étant la plus postérieure. Consultez un atlas du cerveau de souris pour identifier avec précision les coordonnées de la DG et de la collecte des tissus.
  7. Entreposez en série chaque section en rangées de 6 dans une assiette de puits de 48 remplie de solution antigel (tableau 1).
Solution antigelEthylene-glycol 150 ml de saccharose 150 g de remplissage à 500 ml 0,1 M PB pour une solution de 500 mL
Tampon de citrate9 ml de stock d'acide citrique 41 ml de tampon de citrate tri-sodium 450 ml de ddH2O
Stock d'acide citrique[0.1 M] Acide citrique 21 g/1 L ddH2O
Stock de citrate de tri-sodium[0.1 M] Citrate tri-sodium 29,4 g/1 L ddH2O
Tris Buffered Saline -Triton (TBS -Triton)0,05 % 100 x Triton dans le SCT
Tampon de perméabilisation0,5 % 100 x Triton dans le SCT
Blocage du tampon0,33 ml de sérum d'âne en 10 mL TBS-Triton
Solution de réaction EduFaire une solution CuSO4x 5H2O en ajoutant 1 mg de CuSO4x 5H2O dans une solution de 4 ml de [0,1 M] Tris pH 8,5. Ensuite, ajoutez 1:40 d'une solution Alexa488-azide de 600 M et 10 mg/mL de L-Na, ascorbate à la solution CuSO4x 5H2O avant de l'appliquer sur les tissus.

Tableau 1 : Solutions utilisées pour l'immunohistochimie.

5. Immunohistochimie

  1. Protocole flottant de base
    REMARQUE: Si vous colorez la nidine, sautez la section 5.1 et passez à l'article 5.2. Le protocole flottant de base est pour Tbr2 ou doublecortin (DCX) seulement sans thymidine analogique Edu coloration.
    1. Transférer les sections de la solution antigel à la solution saline tamponnée Tris (TBS) dans l'ordre de série dans une plaque de 48 puits.
    2. Laver les sections deux fois dans le triton du SCT (0,05 % tbs-triton, tableau 1) pendant 5 min en aspirant la solution à chaque fois en secouant ou sur un rocker à basse vitesse.
    3. Sections perméabilize s'utilisant de tampon de perméabilisation (0,5 % tbs-triton, tableau 1) pendant 20 à 30 minutes tout en secouant à basse vitesse.
    4. Faire le tampon de blocage en ajoutant 0,33 l de sérum d'âne à 10 ml de TBS-triton. Faire frais et utiliser dans les 3 jours.
    5. Aspirez les sections tampon de perméabilisation et d'incubation en bloquant le tampon pendant 30 min à 1 h à température ambiante (RT).
    6. Faire la solution d'anticorps primaire en bloquant tampon et ajouter à chaque puits. 500 l/puits est suffisant pour que toutes les sections de tissu soient complètement submergées. Incuber toute la nuit à RT sur un rocker ou un shaker.
    7. Aspiratez les sections de solution et de rinçament dans TBS-triton 3x pendant 10 min chacune pour enlever les traces d'anticorps primaires.
    8. Incubate dans le fluorophore a conjugué l'anticorps secondaire contre les anticorps primaires préparés en bloquant la solution tampon pendant 2 h à RT sur un rocker.
    9. Les sections de lavage 3x pour 5 min chacune dans TBS-triton et puis incuber les sections dans 4-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) solution (300 M solution à 1:100) dilué en PBS pendant 15 min.
    10. Lavez les sections 3x dans les sections PBS et les sections de montage maintenant l'ordre en série de antérieur à postérieur sur une diapositive chargée positivement. Laissez sécher les tissus à RT jusqu'à ce que l'humidité soit visiblement partie, habituellement environ 2 à 5 minutes, avant de se couvrir de supports de montage.
  2. Récupération d'antigène
    REMARQUE: Cette section est requise pour la nidine seulement. Si vous colorent la nidine, effectuez cette section avant la coloration analogique thymidine (section 5.3). Passer pour Tbr2 ou DCX coloration avec Edu.
    1. Placez les sections de tissu dans PBS et montez les sections 5-8 sur une diapositive chargée positivement en maintenant l'ordre en série de l'antérieur au postérieur. Laissez les sections de tissu sécher à RT pour adhérer complètement aux glissières, qui prennent environ 2-5 min. Le tissu devrait être visiblement absent de l'humidité.
    2. Préparer le tampon de citrate (tableau 1) dans un récipient, habituellement une boîte de tuyauterie de 1 000 l.
    3. Chauffer le tampon de citrate dans un four à micro-ondes (1 000 W) pendant 5 minutes jusqu'à ce que la solution soit bouillante. Pendant que la solution est le chauffage, placez les sections montées dans un support de glissière en verre de 20 diapositives. Après 5 min, placez soigneusement le porte-glissière avec des sections dans la boîte de pipette.
    4. Mettre le four à micro-ondes à 50 % et cuire 7 min. Démarrer une minuterie pendant 7 min et regarder le micro-ondes. Pendant ces 7 minutes, arrêter le four à micro-ondes lorsque la solution commence à bouillir et continuer le four à micro-ondes après l'arrêt d'ébullition.
      REMARQUE: L'objectif de cette étape est de maintenir la température de l'eau juste en dessous de la température d'ébullition pendant 7 min. Arrêtez après l'arrêt de la minuterie, même si le temps de cuisson sur le micro-ondes n'est pas terminé. Des instructions plus détaillées peuvent être trouvées dans Hussaini et al.20.
    5. Sortez la boîte chaude avec un tampon de citrate et des lames de tissu et placez-la dans un seau à glace pour refroidir. Couvrez-le pour empêcher la glace ou d'autres matériaux d'entrer dans la solution. Attendez environ 30 min ou jusqu'à ce que la solution soit fraîche au toucher.
    6. Procédez à l'étape de coloration analogique thymidine 5.3.2 si vous utilisez l'analogique thymidine.
  3. Toiles analogiques Thymidine
    REMARQUE: Commencez ici si la coloration Edu et Tbr2 ou Edu et DCX.
    1. Placez les sections de tissu dans PBS et montez les sections 5-8 sur une diapositive chargée positivement en maintenant l'ordre en série de l'ordre antérieur au postérieur et à la même orientation. Laissez sécher les sections de tissus pour adhérer complètement aux toboggans, puis dessinez une bordure à l'aide d'un stylo hydrophobe ou d'un stylo PAP.
    2. Sections perméabilize avec tampon de perméabilisation (0,5 % TBS-triton) pendant 20 à 30 min. Ensuite, laver les sections 2x à l'aide de TBS-triton pendant 5 min chacun.
      REMARQUE: La perméabilisation facilite la pénétration des anticorps intracellulaires. Le temps de perméabilisation peut être ajusté en fonction de l'épaisseur des tissus et de l'efficacité des anticorps. Alternativement, on peut augmenter la concentration de détergent pour augmenter la puissance de perméabilisation. Cependant, il faut prendre soin de ne pas perméabisiser trop longtemps puisque la fragilité des tissus augmente avec un temps de perméabilisation prolongé.
    3. Préparer la solution de réaction Edu selon le tableau 1. La concentration finale d'Alexa488-azide est de 15 M m dans 1 ml de solution de réaction Edu.
    4. Incuber les sections dans la solution de réaction Edu pendant 30 min à 1 h, puis laver 3x dans tbS-triton pendant 5 min chacun. Couvrir les glissières dans du papier d'aluminium pour se protéger de la lumière après cette étape. À ce stade, vérifiez si la réaction edu fonctionne à l'aide d'un microscope fluorescent. Les cellules étiquetées Edu fluorésous un microscope à épifluorescence.
  4. Protocole de section de tissu monté
    1. Bloquer les sections de tissu montées sur une glissière de l'étape 5.3.4 à l'aide d'un tampon de blocage élevé chez les mêmes animaux que l'anticorps secondaire, par exemple, le sérum d'âne, pendant 30 min à 1 h, puis laver 2x dans le triton du SCT pendant 5 min chacun.
    2. Préparer la solution d'anticorps primaires (c.-à-d. anti-nestin de poulet) pendant l'étape de blocage en mélangeant les anticorps primaires dans la solution tampon de blocage à 1:200. 250 L par diapositive suffisent pour s'assurer que le tissu est complètement immergé dans la solution.
    3. Incuber les sections de tissu dans une solution primaire d'anticorps pendant la nuit à RT après le blocage des lavages. Modifiez cette étape en fonction de l'anticorps principal utilisé.
      REMARQUE: Si les anticorps ont un arrière-plan élevé ou une liaison non spécifique, l'incubation à 4 oC au lieu de LART peut améliorer les résultats. Les anticorps avec une faible pénétration des tissus peuvent être laissés à incuber pendant 2 jours si nécessaire.
    4. Incuber les sections de tissu 3x dans TBS-triton pendant 5 min pour enlever l'anticorps primaire excédentaire. Ensuite, incuber les sections de tissu dans les anticorps secondaires conjugués au fluorophore (c.-à-d., Alexa 647 anti-poulet à 1:200) préparés en bloquant la solution tampon pendant 2 h à RT.
    5. Incuber les sections de tissu 3x dans tbS-triton pendant 5 min pour enlever l'excès d'anticorps secondaires et appliquer la solution DAPI de 300 M à 1:100 dans PBS pendant 15 min à RT.
    6. Incuber les sections de tissu 3x dans PBS pendant 5 min pour enlever l'excès de DAPI et enlever le cercle de stylo de pap autour du tissu utilisant un écouvillon de coton ou une lingette délicate de tâche. Laisser sécher les sections, puis appliquer le support de montage et le bordereau de couverture. Laissez sécher les supports de montage avant l'imagerie.

6. Collection d'images

  1. Groupes expérimentaux aveugles de groupes témoins en couvrant les étiquettes de diapositives et l'image du même côté de DG à l'aide d'un microscope confocal (Tableau des matériaux) avec 40x lentille optique de grossissement de l'huile à 1 'm taille d'étape ou un zoom 20x 2x à 1 'm.
    REMARQUE: Le grossissement d'huile 40x donnera une résolution accrue, mais prendre plus de temps que le zoom 20x 2x.
  2. Placez l'objectif objectif à 40x, puis cliquez sur l'onglet localiser sur le coin supérieur gauche dans le logiciel confocal (Tableau des matériaux) et définir la section DG souhaitée au milieu du champ de vision.
  3. Localiser DG, passer à l'onglet d'acquisition dans le coin supérieur gauche, et cocher les cases suivantes: Z-pile, carrelage-scan, et la position.
  4. Définir les paramètres du canal entre le gain de 600 à 750, l'intensité laser de 1 % à 15 % et la compensation de 1 à 10. Ne dépassez pas 20% d'intensité laser pour l'un des canaux. Assurez-vous qu'aucun pixel n'est sursaturé lors de la mise en gain et l'intensité.
    REMARQUE: Ces plages varient en fonction de l'efficacité de l'équipement utilisé et de l'efficacité de coloration.
  5. Définir les tuiles à 7 horizontale par 3 verticale dans la fenêtre de balayage de la tuile et l'image d'aperçu de balayage de la presse en utilisant les mêmes paramètres que ceux actuellement utilisés. Par exemple, utilisez 7 horizontale par 3 verticale et l'objectif 20x avec zoom 2x.
  6. Assurez-vous que le DG est complètement dans l'image prévue après l'analyse de vue d'ensemble. Si ce n'est pas le cas, ajustez la vue du DG jusqu'à ce qu'elle soit complètement dans l'image de vue d'ensemble puisqu'il s'agit d'une image représentative que l'on va obtenir.
  7. Définir la profondeur d'imagerie en faisant défiler différentes piles Z à l'aide du bouton de mise au point fine. Assurez-vous que l'ensemble de la DG est dans les points de départ et de fin. En supposant une taille d'étape de 1 m, chaque image doit être d'environ 40 étapes.
  8. Régler la vitesse de numérisation à 9 avec la numérisation bidirectionnelle et aucune moyenne dans la fenêtre de mode d'acquisition. Ajouter ensuite la position dans la fenêtre de position.
    REMARQUE: Répétez les étapes 6.3-6.8 pour imager plusieurs DG à la fois. L'augmentation de la vitesse d'analyse réduit la qualité de l'image, mais réduit le temps d'imagerie global. Si la qualité de l'image est trop faible, réduisez la vitesse d'analyse ou augmentez la moyenne.
  9. Cliquez sur le bouton d'expérience de démarrage lorsqu'il est prêt. Numériser 5 sections de DG par souris le long de l'axe antérieur à postérieur. Par exemple, si le DG gauche est représenté pour la première section, imagez le DG gauche le plus postérieur suivant pour la section deux.
  10. Coudre des images séparées ensemble pour former une image complète du gyrus denté en utilisant la fonction de point sous l'onglet processus dans le logiciel confocal. Alternativement, utilisez FIJI (ImageJ) pour coudre des images ensemble pour former un gyrus denté complet.
  11. Enregistrez les images cousues pour la quantification.

7. Analyse d'image

  1. Ouvrez chaque image de chaque section de gyrus denté en utilisant FIJI à la fois comme projection maximale et comme une image composite avec les canaux fusionnés dans des couleurs distinctes pour visualiser facilement la colocalisation.
  2. Mesurer la zone de DG pour chaque section de l'image de projection maximale à l'aide de l'outil de sélection du polygone (troisième boîte à partir de la gauche) et enregistrer pour chaque section de chaque souris. Ce sera la zone de DG utilisée pour calculer la densité.
  3. Enregistrez le nombre de cellules en DG à partir de l'image composite qui ont colocalisé l'anticorps primaire (c.-à-d. la nestine) et l'edu analogique thymidine, en utilisant le compteur de cellules de plugin FIJI trouvé sous les plugins. analyser le compteur cellulaire et le compteurcellulaire. En outre, enregistrez le nombre total de cellules positives et de nestine Edu avec un processus radial.
    REMARQUE: Dans le cas de la nidine, il est très important de prêter attention à la morphologie. Si vous quantifiez les cellules souches neurales, assurez-vous que seules les cellules ayant un processus radial sont quantifiées. Lors de la quantification des sections de gyrus dentés, appliquez les mêmes critères à tous, en particulier lors de la visualisation des cellules à l'extérieur d'un plan focal. Si les cellules ne sont pas dans le plan focal, ne les comptez pas. Veuillez consulter West et coll.21 pour obtenir des instructions plus détaillées sur la quantification stéréologique.
  4. Entrez le nombre de cellules dans un logiciel de tableur pour compiler toutes les données pour analyse ultérieure.
  5. Calculer la densité des cellules colocalisées pour chaque section en divisant le nombre total de cellules colocalisées par le volume total pour chaque section de chaque animal. Par exemple, obtenir la densité des cellules souches en divisant la somme des cellules nestinmD/eduMD d'un animal par la somme du volume de la DG chez un animal. Calculez le volume de chaque section en multipliant la zone avec des incréments totaux de Z-step en supposant que chaque étape est de 1 m.
    REMARQUE: Dans ce protocole, le nombre total d'étapes devrait être de près de 40, puisque le tissu est sectionné à 40 m. Assurez-vous que chaque animal est un point de données puisque l'objectif de cette approche est d'estimer la quantité totale de cellules colocalisées dans un hémisphère d'un hippocampe.
  6. Effectuez d'autres calculs nécessaires pour la question que l'on essaie d'aborder. Dans cet exemple, calculer le nombre total de cellules proliférantes, la population totale de cellules souches et le pourcentage de cellules souches proliférantes après avoir stimulé les cellules moussues contralatérales.

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Résultats

Suivant les procédures expérimentales décrites ci-dessus (Figure 1A,B), nous avons pu déterminer les effets des projections contralatérales de cellules moussues sur la niche neurogène dans l'hippocampe. En utilisant un gq-couplé Gq-couplé GREADD virus couplé avec une cellule moussue étiquetant 5-HT2A Cre-line, nous avons pu activer sélectivement des projections excitatrices des cellules moussues sur le DG contralatéral et déterminé que la cellule mousseuse forte stimulation ...

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Discussion

Le but de ce protocole est d'évaluer comment la manipulation des circuits neuronaux spécifiques régule la neurogenèse hippocampique adulte in vivo à l'aide d'une série de techniques d'immunohistochimie. La régulation dépendante de l'activité de la neurogenèse adulte médiée par des circuits neuronaux spécifiques est une technique précieuse avec un grand potentiel de modifications pour étudier une gamme variée de circuits neuronaux. Le succès de ces types d'expériences dépend de plusieurs facteurs, y compris l'administrati...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

L.J.Q. a reçu l'appui de l'Institut national de santé mentale des National Institutes of Health dans le cadre du Supplément de diversité R01MH11773 ainsi que d'une subvention de formation T32NS007431-20. Ce projet a été soutenu par des subventions accordées à J.S. par les NIH (MH111773, AG058160 et NS104530).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Plaque à 24 puitsThermo Fisher Scientific07-200-84
Plaque à 48 puitsDenville ScientificT1049
5-éthynyl-2'-désoxyuridine (Edu)CarbosynthNE08701
Alcool 70 % isopropyleThermo Fisher Scientific64-17-5
Tampons de préparation à l’alcoolThermo Fisher Scientific13-680-63
Alexa-488 AzideThermo Fisher ScientificA10266
Anti-Poulet NestinAvesNES ; RRID : AB_2314882
Anti-Chèvre DCXSanta CruzCat# SC_8066 ; RRID : AB_2088494
anti-souris Tbr2Thermo Fisher Scientific14-4875-82 ; RRID : AB_11042577
Bétadine Solution (povidone-iode)
[.1M] Acide citrique (21g/L d’acide citrique)Sigma-Aldrich251275
Clozapine N-OxideSigma-AldrichC08352-5MG
Logiciel confocal (Zen Black)Zeiss MicroscopyZen 2.3 SP1 FP1 (noir)
Sulfate de cuivre (II) PentahydrateThermo Fisher ScientificAC197722500
cotons-tiges Amazone
CoverslipDenville ScientificM1100-02
Delicate Task Wipe KimwipesKimtech Science7557
Foret 0,5 mmFine Science Tools19007-05
Ethylene GlycolThermo Fisher ScientificE178-1
Aiguille Hamilton 2 poucesHmailton Company7803-05
Seringue Hamilton 5 &mu ; L Modèle 75 RNHmailton CompanyRéf : 87931
Foret à grande vitesseForedom1474
Pompe à perfusionAppareil Harvard70-4511
Solution saline injectableMountainside Health CareNDC 0409-4888-20
Seringue à insulineBD Seringues
IsofluraneHenry Schein29405
Stereotax Pour Petits AnimauxKOPF InstrumentsModèle 942
Leica M80Leica
Leica MicrotomeLeicaSM2010 R
LSM 780Zeiss Microscopie
Nair (Produit d’épilation)Nair
Paraformaldahyde 4 %Sigma-Aldrich
Lame chargée 158127 PlusDenville ScientificM1021
Solution tamponnée au phosphate (PBS)Thermo Fisher Scientific10010031
Puralube Vet Ointment Puralube
Slide Rack 20unité de lames Microscopie électronique Science70312-24
Support de support de diapositivesMicroscopie électronique Science70312-25
Coussin chauffant pour petits animauxK& H
SucroseSigma-AldrichS0389
Super PAP Pen 4 mm pointePolySciences24230
Scalpel chirurgicalMedPride47121
Tris Buffered Solution (TBS)Sigma-AldrichT5912
Citrate tri-sodique Stock [0.1 M] Citrate tri-sodique (29.4g/L citrate tri-sodique)Sigma-AldrichC8532
Triton X-100Sigma-Aldrich93443
Pince à épilerAmazon
Vet Bond Tissu Adhésif3M1469SB
Stock d’acide citirique Amazon à insuline ultra-fines

Références

  1. Zhao, C., Deng, W., Gage, F. H. Mechanisms and Functional Implications of Adult Neurogenesis. Cell. 132 (4), 645-660 (2008).
  2. Spalding, K. L., et al. Dynamics of hippocampal neurogenesis in adult humans. Cell. 153 (6), 1219-1227 (2013).
  3. Hill, A. S., Sahay, A., Hen, R. Increasing Adult Hippocampal Neurogenesis is Sufficient to Reduce Anxiety and Depression-Like Behaviors. Neuropsychopharmacology. 40 (10), 2368-2378 (2015).
  4. Clelland, C. D., et al. A functional role for adult hippocampal neurogenesis in spatial pattern separation. Science. 325, (2009).
  5. Sahay, A., et al. Increasing adult hippocampal neurogenesis is sufficient to improve pattern separation. Nature. 472 (7344), 466-470 (2011).
  6. Anacker, C., et al. Hippocampal neurogenesis confers stress resilience by inhibiting the ventral dentate gyrus. Nature. , 1(2018).
  7. Kuhn, H. G., Eisch, A. J., Spalding, K., Peterson, D. A. Detection and Phenotypic Characterization of Adult Neurogenesis. Cold Spring Harb Perspect Biol. , (2016).
  8. Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis. Journal of Visualized Experiments. (98), 1-13 (2015).
  9. Podgorny, O., Peunova, N., Park, J. H., Enikolopov, G. Triple S-Phase Labeling of Dividing Stem Cells. Stem Cell Reports. 10 (2), 615-626 (2018).
  10. Taupin, P. BrdU immunohistochemistry for studying adult neurogenesis: Paradigms, pitfalls, limitations, and validation. Brain Research Reviews. 53 (1), 198-214 (2007).
  11. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  12. Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (12), 5163-5168 (2007).
  13. Sidor, M. M., Davidson, T. J., Tye, K. M., Warden, M. R., Diesseroth, K., Mcclung, C. A. In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System. J Vis Exp. , (2015).
  14. Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Primer Optogenetics in Neural Systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
  15. Yeh, C., Asrican, B., Moss, J., Lu, W., Toni, N., Song, J. Mossy Cells Control Adult Neural Stem Cell Quiescence and Maintenance through a Dynamic Balance between Direct and Indirect Pathways. Neuron. , 1-18 (2018).
  16. Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable Stereotaxic Surgery in Rodents. Journal of Visualized Experiments. (20), 20-22 (2008).
  17. Roth, B. L. Primer DREADDs for Neuroscientists. Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).
  18. Zeng, C., et al. Evaluation of 5-ethynyl-2 ′ -deoxyuridine staining as a sensitive and reliable method for studying cell proliferation in the adult nervous system. Brain Research. 1319, 21-32 (2010).
  19. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), 1-9 (2012).
  20. Hussaini, S. M. Q., Jun, H., Cho, C. H., Kim, H. J., Kim, W. R., Jang, M. Heat-induced antigen retrieval: an effective method to detect and identify progenitor cell types during adult hippocampal neurogenesis. J Vis Exp. , (2013).
  21. West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. G. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. The Anatomical Record. 231 (4), 482-497 (1991).
  22. Kuhn, H., Dickinson-Anson, H., Gage, F. Neurogenesis in the dentate gyrus of the adult rat: age-related decrease of neuronal progenitor proliferation. The Journal of Neuroscience. 16 (6), 2027-2033 (1996).
  23. Gomez, J. L., et al. Chemogenetics revealed: DREADD occupancy and activation via converted clozapine. Science. 357 (6350), 503-507 (2017).
  24. Thompson, K. J., et al. Dreadd Agonist 21 (C21) Is an Effective Agonist for Muscarnic-Based Dreadds in Vitro and in Vivo. ACS Pharmacology & Translational Science. 72 (3), (2018).

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