Vecteur lentiviral plate-forme pour la livraison efficace des outils d’édition épigénome dans l’homme induit des modèles de maladies dérivées de cellules souches pluripotentes

Lidia Tagliafierro; Ekaterina Ilich; Malik Moncalvo; Jeffrey Gu; Ahila Sriskanda; Carole Grenier; Susan  K. Murphy; Ornit Chiba-Falek; Boris Kantor

doi:10.3791/59241

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Article de méthode

Vecteur lentiviral plate-forme pour la livraison efficace des outils d’édition épigénome dans l’homme induit des modèles de maladies dérivées de cellules souches pluripotentes

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DOI :

10.3791/59241

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29 mars 2019

Lidia Tagliafierro¹^,² , Ekaterina Ilich³ , Malik Moncalvo³ , Jeffrey Gu¹ , Ahila Sriskanda¹^,² , Carole Grenier⁴ , Susan K. Murphy⁴ , Ornit Chiba-Falek¹^,² , Boris Kantor³

¹Department of Neurology, Duke University Medical Center, ²Center for Genomic and Computational Biology, Duke University Medical Center, ³Viral Vector Core, Duke University Medical Center, ⁴Division of Gynecologic Oncology, Department of Obstetrics and Gynecology, Duke University Medical Center

Dans cet article

Résumé

La cible ADN épigénome édition représente une approche thérapeutique efficace. Ce protocole décrit la production, purification et concentration des vecteurs lentiviraux all-in-one, hébergeant le transgène CRISPR-dCas9-DNMT3A pour applications d’édition épigénome dans les cellules souches humaines pluripotentes induites (hiPSC)-dérivé de neurones.

Résumé

L’utilisation de cellules dérivées d’hiPSC représente une approche utile pour étudier les maladies neurodégénératives humaines. Nous décrivons ici un protocole optimisé pour la différenciation des hiPSCs provenant d’un patient présentant la triplication du locus du gène (SNCA) d’alpha-synucléine dans la maladie de Parkinson (MP)-les populations neuronales dopaminergiques pertinentes. Accumuler des preuves a montré que des niveaux élevés de SNCA sont responsables pour le développement de PD. reconnaissant la non satisfaits ont besoin d’établir de nouvelles approches thérapeutiques pour PD, en particulier celles qui visent la régulation de l’expression SNCA , nous récemment mis au point un système CRISPR/dCas9-méthylation-basées sur l’ADN pour moduler épigénétiquement SNCA transcription en enrichissant les niveaux méthylation de la région régulatrice de SNCA intron 1. Pour fournir le système, composé d’un mort (désactivée) version de Cas9 (dCas9) a fusionné avec le domaine catalytique de l’ADN méthyltransférase enzyme 3 a (DNMT3A), un vecteur lentiviral est utilisé. Ce système est appliqué aux cellules avec la triplication du locus SNCA et réduit le SNCA-ARNm et protéines d’environ 30 % par le biais de la méthylation de l’ADN ciblée de SNCA intron 1. La diminution de l’expression affinée des niveaux SNCA sauve des phénotypes cellulaires liés à la maladie. Dans le protocole actuel, notre objectif est de décrire une procédure étape par étape afin de différencier les hiPSCs dans les cellules progénitrices neurales (PNJ) et l’établissement et la validation des tests pyrosequencing pour évaluer le profil de méthylation dans le SNCA intron 1. Pour connaître plus en détail le système de lentivirus-CRISPR/dCas9 utilisé dans ces expériences, ce protocole décrit comment produire, purifier et concentrer les vecteurs lentiviraux et de mettre en évidence leurs qualités pour les applications d’édition épigénome et génome utilisant hiPSCs et PNJ. Le protocole est facilement adaptable et peut être utilisé pour produire des lentivirus titre élevé pour les applications in vitro et in vivo.

Introduction

Plusieurs plates-formes d’édition épigénome ont été récemment mis au point pour cibler toutes les séquences d’ADN dans les régions qui contrôlent l’expression de gène¹^,². Les outils de retouche épigénome créés sont conçus pour (i) règlent la transcription, (ii) modifier les modifications post-traductionnelles histone, (iii) modifier la méthylation de l’ADN et (iv) modulent les interactions élément régulateur. L’approche d’ancrer les modificateurs de transcription/chromatine à un Cas9 (morts) désactivé (dCas9) proviendraient précédemment développés plates-formes édition épigénome comme zinc finger protéines (ZF....