Transplantation intraventriculaire de précurseurs neuronaux artificiels pour les études de neuroarchitecture In Vivo

Résumé

Basée sur l'ingénierie lentivirale in vitro des précurseurs neuronaux, leur co-transplantation dans des cerveaux de type sauvage et l'évaluation morphométrique appariée des dérivés « test » et « contrôle », cette méthode permet une modélisation précise du contrôle des gènes in vivo du néocortical morphologie neuronale d'une manière simple et abordable.

Résumé

Le contrôle génique de la cytoarchitecture neuronale fait actuellement l'objet d'une enquête intensive. Décrit ici est une méthode simple développée pour étudier le contrôle in vivo de gène de la morphologie néocortical de neurone de projection. Cette méthode est basée sur (1) l'ingénierie lentivirale in vitro des précurseurs neuronaux comme cellules « d'essai » et de « contrôle », (2) leur co-transplantation dans les cerveaux sauvages-type, et (3) l'évaluation morphométrique paire de leurs dérivés neuronaux. Plus précisément, des précurseurs pallial E12.5 provenant de donneurs panneuronaux, génétiquement étiquetés, sont utilisés à cette fin. Ils sont conçus pour tirer parti de certains promoteurs et de la technologie tetON/OFF, et ils sont transplantés à la main libre dans des ventricules latéraux néonatals. Plus tard, sur le profilage d'immunofluorescence des cerveaux receveurs, des silhouettes des neurones transplantés sont introduites dans le logiciel open source NeurphologyJ, leurs paramètres morphométriques sont extraits, et la longueur moyenne et l'index de ramification sont calculés. Comparé à d'autres méthodes, celle-ci offre trois avantages principaux : elle permet la réalisation d'un contrôle fin de l'expression transgène à des coûts abordables, elle ne nécessite que des compétences chirurgicales de base, et elle fournit des résultats statistiquement fiables sur analyse d'une nombre d'animaux. En raison de sa conception, cependant, il n'est pas suffisant pour aborder le contrôle non cellulaire-autonome de la neuroarchitecture. En outre, il devrait être de préférence employé pour étudier le contrôle de morphologie neurite après l'achèvement de la migration neuronale. Dans sa formulation actuelle, cette méthode est exquisement accordée pour étudier le contrôle génique de l'architecture néocortical de neurone glutamatergic. Profitant des lignées transgéniques exprimant l'EGFP dans d'autres types spécifiques de cellules neurales, il peut être réconçu pour aborder le contrôle génétique de leur architecture.

Introduction

Ici nous décrivons une méthode simple que nous avons développée pour disséquer le contrôle in vivo de gène de cytoarchitecture neuronale. Basé sur l'ingénierie in vitro des précurseurs neuronaux, leur transplantation dans le cerveau néonatal et l'évaluation morphométrique couplée des cellules « d'essai » et de « contrôle », il permet de dévoiler des implications fonctionnelles des gènes de test dans le contrôle fin de la morphologie neuronale dans un moyen rapide et abordable. Pour étudier le contrôle in vivo des gènes de l'architecture neuronale, trois questions techniques clés doivent être abordées : (1) la réalisation d'une expression de gène d'intérêt (GOI) correc....

Protocole

Toutes les méthodes et procédures décrites ici ont été approuvées par le SISSA Organismo preposto al Benessere Animale (SISSA IACUC).

1. Génération de piscines d'ancêtres « vertes » d'ingénierie

1. Préparation de la piscine « verte »
   1. Mate une femelle CD1 de type sauvage avec un fondateur Mtapt^{EGFP / 16}. Euthanasier la mère enceinte par luxation cervicale à 12,5 jours après le coitum (le jour 0 est déterminé par inspection vaginale des prises) et récolter les embryons de 12,5 (E12.5) embryons. Les mettre dans des puits individuels d'une plaque de 24 multipuits dan....

Résultats

Il existe cinq ensembles de données primaires fournissant des informations utiles sur les aspects clés de la procédure, le premier étant (1) l'efficacité de la transduction des précurseurs neuronaux et la co-transduction par les vecteurs lentiviraux. (2) Exemple des principales caractéristiques des promoteurs employés pour piloter le « gène d'essai ». (3) Exemple de cellules modifiées prêtes à être rectifiées. (4) Un dessin animé comprenant les détails procéduraux principaux de la microin.......

Discussion

Les aspects/étapes spécifiques de cette procédure sont essentiels et nécessitent une attention particulière. Premièrement, a) les opérateurs doivent être suffisamment préformés pour manipuler en toute sécurité les lentivirus dans un environnement de laboratoire conforme au BSL-2. Deuxièmement, b) avant de mélanger les préparations neuronales « test » et « contrôle », il est obligatoire de laver soigneusement les deux suspensions de neurosphère correspondantes telles que décrites, afin d'éviter toute infection croisée ret.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Seringue de 0,3 mL	BD	320840	en magasin chez RT
0,45 &mu ; m filtre stérile	Millex-HV	SLHU033RS	magasin chez RT
12 plaque multipuits	Falcon	353043	magasin chez RT
1X PBS	Gibco	14190-094	magasin chez RT
24 plaque multipuits	Falcon	351147	magasin chez RT
anticorps anti-EGFP, poulet polyclonal, RRID :AB_371416	Tebubio	GTX13970	magasin à -20 ° ;
Anticorps anti-RFP C, monoclonal de rat, anticorps RRID :AB_10795839	en ligne	ABIN334653	magasin à -20 ° ;
Anticorps anti-Tubb3 C, souris monoclonale, RRID :AB_2313773	Covance	MMS-435P	se conservent à -20 ° ; C
Kit d’assemblages de tubes d’aspirateur pour pipettes microcapillaires calibrées	Sigma	A5177-5EA	magasin chez RT
Lampe à lumière bleue	Nightsea	BLS2	magasin chez RT
Capillaires en borosilicate	Kwik-Fil	TW150-4	magasin chez RT
BSA	Sigma	A9647	magasin à -20 ° ; C
Bü ; Chambre de	Sigma	BR719520	0.0025 mm2, 0.100 mm
Milieu de cryo-inclusion (Killik)	Bio-Optica	05-9801	magasin chez RT
DAPI	Sigma	D9542	magasin à -20 ° ; C
Moule d’encastrement jetable	Bio-Optica	07MP7070	magasin chez RT
DMEM/F-12	Gibco	31331-028	magasin à +4 ° ; C
Dnase I	Roche	10104159001	magasin à -20 ° ; C
Doxycicline	Sigma	D1822	magasin à -20 ° ; C
Pince Dumont #3c	Fine Science Tools	11231-20	magasin chez RT
Pince Dumont #5	Outils de sciences fines	11251-20	magasin chez RT
EGF	Gibco	PHG0311	magasin à -20 ° ; C
EGTA	Sigma	E3889	magasin chez RT
FGF	Gibco	PHG0261	magasin à -20 ° ; C
Ciseaux fins - Sharp	Fine Science Tools	14060-09	magasin chez RT
Fungizone (amphotéricine B)	Gibco	15290018	magasin à -20 ° ; C
Glucose	Sigma	G8270	magasin chez RT
GlutaMAX Supplement	Gibco	35050061	magasin chez RT
Goat anti-poulet Alexa 488	Invitrogen	A11039	magasin à -20 ° ; C
Chèvre anti-rat Alexa 594	Invitrogen	A11007	se magasine à -20 ° ; C
Heparine Solution	Stem Cell Technologies	07980	magasin à -20 ° ; C
N2 Supplément	Gibco	17502048	magasin à -20 ° ; C
Fibres optiques	Leica	CLS150X
P1000 extracteur	Sutter Instruments	P-1000 modèle
Parafilm	Bemis	PM-996	magasin chez RT
Pen Strep	Sigma	P0781	magasin à -20 ° ; C
Boîte de Pétri	Falcon	353003	magasin chez RT
PFA	Sigma	158127	magasin chez RT
Plasmid #363 [LV_TREt_(IRES)PLAP]	construit in house		store à -20 ° ; C
Plasmid #386 [LV_pTa1_mCherry]	construit in house		store à -20 ° ; C
Plasmide #401 [LV_pTa1_rtTA(M2)]	construit en magasin maison		à -20 ° ; C
Plasmid #408 [LV_Ppgk1p_rtTA(M2)]	construit in house		store à -20 ° ; C
Plasmid #484 [LV_lacZ]	Addgene	12108	se stocke à -20 ° ; C
Plasmid #529 [LV_Pgk1p_mCherry]	construit in house		store à -20 ° ; C
Plasmid #730 [LV_pSyn_rtTA(M2)]	construit in house		store à -20 ° ; C
Scalpel	Braun	BB515	magasin chez RT
Stéromicroscope	Leica	MZ6	magasin chez RT
Trypan bleu	Gibco	15250-061	magasin chez RT
Trypsin	Gibco	15400-054	magasin à -20 ° ; C
Trypsin inhibitor	Sigma	T6522	se conserve à -20 ° ; L

refroidissement