Méthode de préparation d'échantillons de microscope électronique de balayage et de transmission pour les appendices du bec de bois

Summary

Afin d'observer l'ultrastructure de la sensibilité d'insecte, le protocole de préparation d'échantillon de balayage et de transmission d'électron (SEM et TEM, respectivement) ont été présentés dans l'étude. Tween 20 a été ajouté dans le fixatif pour éviter la déformation de l'échantillon dans LA microscopie de fluorescence DE SEM a été utile pour améliorer la précision de tranchage dans TEM.

Abstract

Ce rapport décrit les méthodes de préparation d'échantillon qui scannent et canalysent des observations de microscope électronique, démontrées en préparant des appendices du coléopter de bois, Chlorophorus caragana Xie et Wang (2012), pour les deux types de microscopie électronique. Le protocole de préparation de l'échantillon de microscopie électronique à balayage (SEM) était basé sur la fixation chimique de l'échantillon, la déshydratation dans une série de bains d'éthanol, le séchage et le revêtement par pulvérisation. En ajoutant Tween 20 (Polyoxyethylene sorbitan laurate) au fixatif et à la solution de lavage, la surface du corps d'insecte du scétis boisé a été lavée plus proprement dans SEM. La microscopie électronique de transmission de cette étude (TEM) comprenait une série d'étapes, y compris la fixation, la déshydratation de l'éthanol, l'intégration dans la résine, le positionnement à l'aide de la microscopie à fluorescence, la sectionnement et la coloration. Fixative avec Tween 20 permis pénétrer la paroi du corps d'insecte de colégon boisé plus facilement qu'il ne l'aurait été sans Tween 20, et par la suite de meilleurs tissus fixes et organes dans le corps, ainsi donné des observations électroniques de microscope de transmission claire des ultrastructures de sensilla d'insecte. L'étape suivante de cette préparation a été de déterminer les positions des insectes sensilla dans l'échantillon incorporé dans le bloc de résine en utilisant la microscopie de fluorescence pour augmenter la précision du positionnement sensilla cible. Cette précision de découpe améliorée.

Introduction

La microscopie électronique de balayage est un outil important dans beaucoup d'études de morphologie, que SEM montre des structures de surface^1,2. L'attrait de la microscopie électronique de transmission est qu'elle peut être utilisée pour étudier un large éventail de structures biologiques à l'échelle nanométrique, de l'architecture des cellules et de l'ultrastructure des organites à la structure des complexes macromoléculaires et des protéines. TEM montre les structures intérieures^3,4,5.

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Protocol

CAUTION : Consultez les fiches de données sur la sécurité des matériaux des réactifs avant de les utiliser. Plusieurs des produits chimiques utilisés lors de la préparation de l'échantillon sont toxiques, mutagènes, cancérigènes et/ou reprotoxiques. Utilisez de l'équipement de protection individuelle (gants, blouse de laboratoire, pantalon sépuldage et chaussures à boutfermé) et travaillez sous une hotte de fumée tout en manipulant l'échantillon.

1. Préparation et imagerie de l'échantillon SEM

1. Fixation et nettoyage d'échantillon
   1. Travailler dans une zone où C. caragana se produisent, attirer les adultes dans les pi....

Results

En utilisant le nettoyage et la solution fixative avec Tween 20, une image SEM plus propre a été observée que celle sans Tween 20 (Figure 3). La solution de fixation de tween 20 a pénétré la solution de fixation de glutaraldéhyde dans le tissu. La structure de microtubule a été clairement vue. L'image TEM de la structure interne de l'échantillon a été floue sans Tween 20 (Figure 4).

Discussion

Dans cet article, nous avons présenté un schéma de préparation d'échantillon pour la microscopie électronique de balayage et de transmission pour le colégon laborieux. En utilisant l'appendice d'insecte comme sujet représentatif d'étude, nous avons démontré plusieurs améliorations au-dessus des méthodes traditionnelles de préparation d'échantillon.

L'huile liquide détachée de la surface solide est émulsionnée en petites gouttelettes, qui peuvent être bien dispersées et suspendues dans le milie.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lentille anatomique	Chongqing Auto Optical société à responsabilité limitée	1425277
Ruban adhésif en carbone	SPI Supplies, Division de Structure Probes, Inc.	7311
Tétrachlorure	de carbone Sigma	56-23-5
Grilles de cuivre	GilderGrids	G300
Hydrogénophosphate disodique	Sinopharm group chemical reagent co., LTD	10039-32-4
Éthanol	J.T. Baker	64-17-5
Moules d’enrobage plats	Hyde Venture (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.	70900
Microscope à fluorescence	LEICA	DM2500
Glutaraldéhyde	Sigma-Aldrich	111-30-8	Anhydre EM Grade
Isophorone	Sigma	78-59-1
Citrate	de plomb Sigma	512-26-5
Méthanol	Sigma	67-56-1
Phosphate de sodium monobasique	Its group chemical reagent co., LTD	7558-80-7
Micromètre objectif	Olympus	0-001-034
Tétroxyde d’osmium	Sigma	541-09-3
Boîte de Pétri	Aldrich	1998
Lame de rasoir	Gillette
Resin	Spurr	ERL4221
Scalpel	Lianhui	GB/ T19001-2008
SEM	Hitachi	S-3400
Gel de silice déshydratant	Suzhou Longhui Desiccant Co., Ltd.	112926-00-8
Petite brosse	Martol	G1220
Hydroxyde de sodium	Sigma	1310-73-2
Instrument de pulvérisation ionique	Hitachi Koki Co. Ltd., Tokyo, Japon	E-1010
Stéréomicroscope	Leica	EZ4 HD
TEM	Hitachi	H-7500
Tween 20	Tianjin Damao Réactif chimique	9005-64-5
Ultramicrotome	Leica	UC6
Nettoyeur à ultrasons	GT Sonic	GT-X1
Acétate d’uranyle	Sigma	6159-44-0