Analyse des Trisaccharides lait Fucosylées homme dans contexte biotechnologique génétiquement encodé biocapteurs

Résumé

Nous décrivons ici la détection haut débit et la quantification des oligosaccharides de lait humain fucosylées (HMO) à l’aide d’un biocapteur à germes entiers. Nous démontrons ici, l’adaptation de cette plate-forme vers l’analyse des souches de production HMO, mettant l’accent sur l’amélioration du rapport signal sur bruit.

Résumé

Le lait humain oligosaccharides (HMO) sont les composants de hydrate de carbone complexe du lait maternel humain qui présentent de nombreux avantages sur la santé infantile. Cependant, l’optimisation de leur synthèse biotechnologique est limitée par le débit relativement faible de détection et de quantification des monosaccharides et des liens. Les techniques classiques d’analyse glycane comprennent des méthodes chromatographiques /-spectrométrie de masse avec le débit de l’ordre de plusieurs centaines d’échantillons par jour sans automation. Nous démontrons ici, un biocapteur bactérien génétiquement codé de haut-débit, assemblage spécifique de détection et de quantification des structures fucosylées HMO, 2'-fucosyllactose et 3-fucosyllactose, qui nous atteint via hétérologue expression de fucosidases. Comme la présence de lactose dans le lait ou dans les procédés biotechnologiques pourrait conduire à de faux positifs, nous démontrons également la réduction du signal du lactose en utilisant des stratégies différentes. En raison du débit élevé de cette technique, beaucoup de conditions de réaction ou de paramètres de bioréacteur pourraient être dosés en parallèle en quelques heures, ce qui permet l’optimisation de la fabrication de HMO.

Introduction

Oligosaccharides de lait maternel (HMO) sont des oligosaccharides dérivé de lactose, généralement composée de trois à huit monomères de sucre. Ils ont une réduction de lactose (Gal-β1, 4-Glc) fin et sont plus allongées par des liaisons glycosidiques (β-1, 3 - ou β-1, 6-) de glucose (Glc), galactose (Gal) ou le N-acétylglucosamine (GlcNAc). En outre, fucose (Fuc, α-1, 2 - ou α-1, 3-) ou l’acide sialique (Sia ou NeuAc, α-2,3 - ou α-2, 6-) résidus sont souvent ajoutés¹.

Analyse actuelle des oligosaccharides et des autres glucides est limité en débit et en portée par la nécessité d’une chromatographie/spectrométrie de ma....

Protocole

1. cellules des conditions de culture et de l’induction

Remarque : Dans les expériences suivantes, trois souches sont utilisés : e. coli BL21 (DE3) avec un vecteur vide, e. coli BL21 (DE3) avec plasmides pAfcA¹⁴ et pET28:green protéine fluorescente (GFP) et e. coli BL21 (DE3) avec des plasmides pAfcB¹⁴ et pET28:GFP. Toutes les souches sont cultivées dans le bouillon Luria-Bertani (LB) ou un milieu minimal avec des antibiotiques appropriés. Préparer les solutions de 1 000 x kanamycine (50 mg/mL) et de la carbénicilline (100 mg/mL) dans désionisée (DI) l’eau.

1. Préparation des ....

Résultats

Nous avons conçu un biocapteur à germes entiers spécifique à 2'-FL qui peut être utilisé en conjonction avec la production biotechnologique de l’oligosaccharide. Celle-ci repose sur le clivage enzymatique spécifique de modifier des sucres terminaux générant au lactose et donc l’activation de l’opéron lac , conduisant à l’expression d’une protéine fluorescente journaliste sous un promoteur inductible au lactose, dans proportionnelle à la quantité de 2'-FL. Pour démontrer sa spécif.......

Discussion

Nous présentons une stratégie haut-débit pour la détection de liaison spécifique de fucosylées oligosaccharides de lait maternel. Cela a été accompli en construisant des biocapteurs à germes entiers par génie génétique e. coli , qui, après induction par glycanes spécifiques, répondre avec un signal fluorescent. Le protocole détaille également sur comment le biocapteur peut être utilisé pour détecter et quantifier les HMO dans une souche bactérienne métaboliquement modifiée.

Notre prot.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
2'-Fucosyllactose  ;	Carbosynth  ;	41263-94-9
3-Fucosyllactose  ;	Carbosynth  ;	41312-47-4
Agar	Fisher Scientific	BP9744500
Chlorure de calcium, dihydraté	Fisher Scientific	C79-500
Carbenicilline  ;	Fisher Scientific	BP26481
Dextrose (D-Glucose), anhydre	Fisher Scientific	D16-1
Cytomètre en flux	BD		FACSCanto Plus RUO
HPLC	Agilent Technologies		1100 Series Système HPLC
Colonne HPLC	Luna		C18 Colonne en phase inversée
Kanamycin	Fisher Scientific
LB Bouillon, Miller  ;	Fisher Scientific	12-795-027
Lactose	Fisher Scientific	64044-51-5
M9, Sels minimaux, 5x	Sigma-Aldrich	M6030
Sulfate de magnésium, anhydre	Fisher Scientific	M65-500
MS	Agilent Technologies		Piège sélectif de masse Détecteur SL
Chlorure de sodium	Sigma-Aldrich	7647-14-5
Phosphate de sodium dibasique	Sigma-Aldrich	7558-79-4
Phosphate de sodium monobasique	Sigma-Aldrich	13472-35-0

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