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Article de méthode

Analyse des Trisaccharides lait Fucosylées homme dans contexte biotechnologique génétiquement encodé biocapteurs

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DOI :

10.3791/59253

⸱

13 avril 2019

 , 
1Department of Chemical and Biological Engineering, Iowa State University

Dans cet article

Résumé

Nous décrivons ici la détection haut débit et la quantification des oligosaccharides de lait humain fucosylées (HMO) à l’aide d’un biocapteur à germes entiers. Nous démontrons ici, l’adaptation de cette plate-forme vers l’analyse des souches de production HMO, mettant l’accent sur l’amélioration du rapport signal sur bruit.

Résumé

Le lait humain oligosaccharides (HMO) sont les composants de hydrate de carbone complexe du lait maternel humain qui présentent de nombreux avantages sur la santé infantile. Cependant, l’optimisation de leur synthèse biotechnologique est limitée par le débit relativement faible de détection et de quantification des monosaccharides et des liens. Les techniques classiques d’analyse glycane comprennent des méthodes chromatographiques /-spectrométrie de masse avec le débit de l’ordre de plusieurs centaines d’échantillons par jour sans automation. Nous démontrons ici, un biocapteur bactérien génétiquement codé de haut-débit, assemblage spécifique de détection et de quantification des structures fucosylées HMO, 2'-fucosyllactose et 3-fucosyllactose, qui nous atteint via hétérologue expression de fucosidases. Comme la présence de lactose dans le lait ou dans les procédés biotechnologiques pourrait conduire à de faux positifs, nous démontrons également la réduction du signal du lactose en utilisant des stratégies différentes. En raison du débit élevé de cette technique, beaucoup de conditions de réaction ou de paramètres de bioréacteur pourraient être dosés en parallèle en quelques heures, ce qui permet l’optimisation de la fabrication de HMO.

Introduction

Oligosaccharides de lait maternel (HMO) sont des oligosaccharides dérivé de lactose, généralement composée de trois à huit monomères de sucre. Ils ont une réduction de lactose (Gal-β1, 4-Glc) fin et sont plus allongées par des liaisons glycosidiques (β-1, 3 - ou β-1, 6-) de glucose (Glc), galactose (Gal) ou le N-acétylglucosamine (GlcNAc). En outre, fucose (Fuc, α-1, 2 - ou α-1, 3-) ou l’acide sialique (Sia ou NeuAc, α-2,3 - ou α-2, 6-) résidus sont souvent ajoutés1.

Analyse actuelle des oligosaccharides et des autres glucides est limité en débit et en portée par la nécessité d’une chromatographie/spectrométrie de masse (MS) technologie2,3,4,5, 6 , 7, qui peut prendre environ une heure par exemple, pour ne pas mentionner la nécessité d’équipements coûteux, colonnes spécialisées et agents de dérivatisation et expertise sur le fonctionnement de cet équipement8. Liens d’oligosaccharides sont particulièrement difficiles à déterminer, nécessitant des avancées MS9,10 ou de techniques de résonance magnétique nucléaire (RMN)11. Optimisation rapide de la synthèse de ces oligosaccharides est donc limitée par le débit de cette étape analytique lente.

Dans cette étude, nous démontrons la liaison spécifique détection fucosylées trisaccharide ossi à base de lactose, en se concentrant sur la 2'-fucosyllactose (2'-FL) qui est le plus abondant HMO dans le lait maternel, en utilisant un génétiquement encodé Escherichia coli cellules entières biocapteur avec une limite de détection à 4 mg/L. Une caractéristique importante de ce biocapteur est sa capacité à distinguer les isomères trisaccharides. Le principe de conception est basé sur l’expression des fucosidases spécifiques chez e. coli qui libèrent le lactose de HMO, dont la présence est détectée par l’opéron lac , qui à son tour génère un signal fluorescent. Nous y parviendrons en construisant un système de deux-plasmide, on nourrissait la fucosidase de liaison spécifique et l’autre une protéine fluorescente journaliste. Cette plateforme de biocapteurs est adaptée pour le criblage à haut débit par cytométrie en flux ou micro-lecteur. Nous démontrons également l’utilisation du biocapteur pour quantifier la 2'-FL produite par une souche modifiée12. Dans cette étude, nous présentons trois stratégies sur l’élimination sélective de lactose qui peut entraîner des faux signaux positif depuis le biocapteur, étant donné que la souche producteur machiné est cultivée sur le lactose.

Pris ensemble, les biocapteurs codés génétiquement nous permettent de détecter et quantifier les HMO dans une manière de liaison spécifique, qui est difficile même avec chromatographique, MS ou NMR techniques. En raison de son haut rendement et facilité d’utilisation, cette méthode devrait avoir de nombreuses utilisations dans l’ingénierie métabolique et la synthèse des HMO.

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Protocole

1. cellules des conditions de culture et de l’induction

Remarque : Dans les expériences suivantes, trois souches sont utilisés : e. coli BL21 (DE3) avec un vecteur vide, e. coli BL21 (DE3) avec plasmides pAfcA14 et pET28:green protéine fluorescente (GFP) et e. coli BL21 (DE3) avec des plasmides pAfcB14 et pET28:GFP. Toutes les souches sont cultivées dans le bouillon Luria-Bertani (LB) ou un milieu minimal avec des antibiotiques appropriés. Préparer les solutions de 1 000 x kanamycine (50 mg/mL) et de la carbénicilline (100 mg/mL) dans désionisée (DI) l’eau.

  1. Préparation des médias
    1. Préparer les milieux LB en ajoutant 25 g de stock de poudre LB à 1 L de l’eau distillée. Autoclave à 121 ° C pendant 20 min stériliser la solution de. Attendez que la température de médias LB stérilisée est inférieure à 60 ° C avant d’ajouter 1 µL d’antibiotique stock chaque 1 ml de médias LB.
    2. Pour préparer les plaques LB, ajouter 15 g de gélose aux médias avant la stérilisation LB. Attendez que la température de gélose LB stérilisée est inférieure à 60 ° C avant l’ajout d’antibiotique.
    3. 1.1.3 pour les cellules de biodétection, préparer les médias ou des plaques avec deux antibiotiques, kanamycine et carbénicilline.
  2. Inducteurs de glucides
    1. Préparer les solutions des inducteurs de glucides à molaires équivalents à 20 g/L de lactose : 29 g/L de 2'-FL et 3-FL.
      Remarque : Chaque 200 µL de cellules exigeront 20 µL de 2'-FL ou 3-FL.
    2. Induire des 200 µL de cellules avec une concentration finale de 2,0 g/L de lactose ou 2,9 g/L concentration finale de 2'-FL/3-FL. incuber à 37 ° C sous agitation continue et laisser pousser du jour au lendemain les cultures.
  3. Culture cellulaire
    1. La veille de la graine de l’expérience 5 mL de milieu LB additionné à la kanamycine et la carbénicilline provenant d’une colonie bactérienne fraîche, utilisant une technique stérile.
    2. Incuber à toutes les cultures à 37 ° C sous agitation et poussent les cultures du jour au lendemain.
    3. Transférer 50 µL de la culture au jour le jour dans 5 mL de supports LB/M9 neufs avec la kanamycine et la carbénicilline. Incuber à 37 ° C sous agitation continue et se développer jusqu'à ce que la culture a atteint une densité optique à 600 nm (OD600) de 0,5 à 0,7. Lors de cette phase logarithmique, les cellules peuvent être induites.

2. mesure de la fluorescence et les limites de détection

  1. Préparation des cellules pour la cytométrie en flux
    1. Transférer les cultures pendant la nuit pour tubes de 1,5 mL et centrifuger à 12 500 x g pendant 1 min.
    2. Jeter le surnageant et resuspendre le culot dans 500 µL de solution saline tamponnée au phosphate 1 x (PBS ; 6 mM Na2HPO4, 1,8 mM NaH2PO4, 145 mM NaCl dans l’eau distillée, pH 7,2) pour préparer une suspension monocellulaire et transférer la cellule unique suspension aux tubes de cytométrie de flux 5 mL.
    3. Garder les cellules dans l’obscurité à 4 ° C jusqu'à ce que les échantillons en cours d’exécution sur un cytomètre en flux. Pour de meilleurs résultats, analyser les cellules dès que possible.
    4. Choisissez les laser à 488 nm pour exciter la GFP. Recueillir des niveaux de fluorescence fluorescéine isothiocyanate (FITC) (20 000 – 40 000 événements dépendants pour scatter avant et latéraux pour éviter les débris et les cellules agrégées) avec un filtre passe-bande de 525/50 nm.
  2. Calibrer le biocapteur
    1. Pour faire une courbe d’étalonnage, préparer des dilutions de 8 à 10 de la norme 2'-FL dans la plage 0 – 2 500 mg/L.
    2. La culture des cellules de biodétection 2'-FL (contenant pAfcA et pET28:GFP) et amener avec les dilutions standards, tel que décrit précédemment dans la section 1.3. Effectuer trois réplicats biologiques pour chaque dilution.

3. détection et quantification de la 2'-FL chez une souche de producteur

  1. Culture de la souche de producteur
    1. Pour faire des médias un minimum, préparer des solutions distinctes de 1 M K2HPO4, FeSO4·7H2O, citrate de sodium et 1 M thiamine-HCl. stériliser les solutions à l’aide d’un filtre de 0,22 µm. Mélanger M9 médias poudre de bouillon avec 1 L de l’eau distillée. Autoclave la solution M9 à 121 ° C pendant 15 min. laisser refroidir la solution jusqu'à 50 ° C. Ajouter MgSO4, CaCl2, K2HPO4, FeSO4·7H2O, citrate de sodium et thiamine à la concentration finale de 2 mM, 0. 1 mM, 12 g/L, 11 mg/L, 75 mg/L et 7,5 µg/L, respectivement.
    2. Commencer une culture de la 2'-FL souche, par exemple, JM109 gwBC-F2, dans 5 mL de médias LB productrice et laisser pousser une nuit à 37 ° C, comme décrit dans Baumgartner et al.12.
    3. Repiquage à 1 % comme décrit précédemment dans l’étape 1.3.3 dans 250 mL des médias un minimum préparés à l’étape 3.1.1. Ajouter le glycérol à une concentration finale de 10 g/L et incuber la culture à 37 ° C.
    4. Lorsque la culture atteint une OD600 de 0,5 à 0,7, ajouter isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) à une concentration finale de 0,5 mM et le lactose à une concentration finale de 2 g/L.
    5. Incuber à 37 ° C sous agitation continue et laissez les cultures à pousser pendant 24 h.
  2. Extraction de 2'-FL
    1. Transférer les cultures pendant la nuit à tubes stériles 50 mL et centrifuger à 900 x g pendant 15 min.
    2. 3.2.2 jeter le surnageant et remettre en suspension l’extrait concentré dans l’eau distillée. Répétez l’étape de lavage trois fois pour enlever au lactose résiduel et enfin remettre en suspension dans 5 mL de l’eau distillée.
    3. Pour lyser la suspension cellulaire, utilisez un sonicateur à 30 % de puissance, en 30 s Pulse. Garder les cellules sur la glace à tout moment.
    4. Centrifuger les cellules lysées pendant 25 min à 2 000 x g. Retirer le surnageant, passer à travers une solution stérile (par exemple, 0,22 µm) filtrer et conserver à 4 ° C jusqu'à l’analyse.
  3. Quantification avec biocapteur
    1. Ensemencer une culture de cellules de 2'-FL biodétection et phase logarithmique, induisent avec équivalent lysat cellulaire à des concentrations estimées de 2'-FL utilisé pour fabriquer la courbe d’étalonnage comme indiqué au point 2.2. Effectuer l’étalonnage dans le même milieu que l’échantillon à analyser (par exemple, lysat cellulaire) en ajoutant des dilutions de 2'-FL au contrôle (c'est-à-dire non producteurs) lysat avant d’induire les cellules biocapteur filtrée cellulaire.
    2. Exécuter les exemples sur un cytomètre en flux. Générer une courbe dose-réponse en traçant la sortie de fluorescence contre la concentration d’oligosaccharides. Comparer la réponse des normes pour le lysat cellulaire.

4. sélective enlèvement du lactose

Remarque : Les cellules de biodétection sont sensibles au lactose et il est souhaitable que le biocapteur à détecter de manière sélective ossi plus de lactose. Une stratégie comprendrait lavage de cellules tel que décrit dans la section 3.2. Trois autres stratégies sont décrites ci-dessous.

  1. Traitement avec commerciale purifiée β-galactosidase
    1. Dissoudre la β-galactosidase lyophilisé pour 1 000 (lactase FCC) unités/mL, dans 1 mM MgCl2 ou utilisation commerciale de β-galactosidase en solution.
    2. Pour déterminer la concentration optimum de l’enzyme nécessaire, cultiver un inoculum de 2'-FL biodétection cellules et provoquer avec lactose 2 g/L et 2,9 g / L 2'-FL au milieu de la phase logarithmique.
    3. Aux 100 µL cultures, ajouter des quantités variables de la β-galactosidase, jusqu'à 12 unités et laisser les cultures poussent en une nuit à 37 ° C sous agitation continue.
    4. Mesurer la fluorescence tel que décrit dans la section 2.1 et calculer les unités optimales des enzymes nécessaires par détermination de la concentration de l’enzyme minimum pour atteindre l’atténuation souhaitée du signal.
    5. 2'-FL produisant des cellules cultivées pendant 24 h, ajouter des unités optimales de la β-galactosidase et incuber une nuit à 37 ° C. Aller de l’avant avec le protocole permettant de déterminer le titre de la 2'-FL comme décrit à la section 3.3.
  2. Avant le traitement avec la souche LacZ +
    1. Commencer une culture de 25 mL de la souche de la 2'-FL produisant et une fois induite à la phase logarithmique, incuber la culture à 37 ° C pendant 24 h.
    2. Ensemencer une e. coli BL21 (DE3) culture en LB, développez-le à phase logarithmique à 37 ° C et ajouter 50 mL de la culture (2:1) dans la culture de 24 h.
    3. Incuber à 37 ° C pendant 3 h. procéder avec le protocole permettant de déterminer le titre de la 2'-FL comme décrit à la section 3.3.
  3. Précipitation au lactose à l’éthanol
    Remarque : Cette section est une adaptation de Matsuki et al.12.
    1. Commencer une culture de 25 mL de la souche de la 2'-FL produisant et une fois induite à la phase logarithmique, incuber à 37 ° C pendant 24 h.
    2. Ajouter deux volumes d’éthanol à 100 % à la culture, bien agiter et laisser incuber à 37 ° C pendant 4 h.
    3. Centrifuger la suspension à 900 x g pendant 15 min. à frais virés le surnageant et incuber une nuit à 4 ° C, ce qui précipite le lactose.
    4. Supprimer le lactose précipité en passant la solution à travers un filtre en papier (11 µm). Recueillir le filtrat qui est la cellule lysate contenant la 2'-FL, qui peut être quantifié en suivant l’article 3.3.

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Résultats

Nous avons conçu un biocapteur à germes entiers spécifique à 2'-FL qui peut être utilisé en conjonction avec la production biotechnologique de l’oligosaccharide. Celle-ci repose sur le clivage enzymatique spécifique de modifier des sucres terminaux générant au lactose et donc l’activation de l’opéron lac , conduisant à l’expression d’une protéine fluorescente journaliste sous un promoteur inductible au lactose, dans proportionnelle à la quantité de 2'-FL. Pour démontrer sa spécif...

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Discussion

Nous présentons une stratégie haut-débit pour la détection de liaison spécifique de fucosylées oligosaccharides de lait maternel. Cela a été accompli en construisant des biocapteurs à germes entiers par génie génétique e. coli , qui, après induction par glycanes spécifiques, répondre avec un signal fluorescent. Le protocole détaille également sur comment le biocapteur peut être utilisé pour détecter et quantifier les HMO dans une souche bactérienne métaboliquement modifiée.

Notre prot...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par l’Iowa State University fonds de démarrage. F.E. a été partiellement financé par la NSF Trinect bourse et Manley Hoppe professorat. T a été partiellement prises en charge par le Karen et Denny Vaughn faculté Fellowship. Les auteurs remercient l’Iowa State University Flow Cytometry Facility et le laboratoire de recherche de métabolomique W.M. Keck d’assistance avec la fluorescence et SM-études.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
2'-Fucosyllactose  ;Carbosynth  ;41263-94-9
3-Fucosyllactose  ;Carbosynth  ;41312-47-4
AgarFisher ScientificBP9744500
Chlorure de calcium, dihydratéFisher ScientificC79-500
Carbenicilline  ;Fisher ScientificBP26481
Dextrose (D-Glucose), anhydreFisher ScientificD16-1
Cytomètre en fluxBDFACSCanto Plus RUO
HPLCAgilent Technologies1100 Series Système HPLC
Colonne HPLCLunaC18 Colonne en phase inversée
KanamycinFisher Scientific
LB Bouillon, Miller  ;Fisher Scientific12-795-027
LactoseFisher Scientific64044-51-5
M9, Sels minimaux, 5xSigma-AldrichM6030
Sulfate de magnésium, anhydreFisher ScientificM65-500
MSAgilent TechnologiesPiège sélectif de masse Détecteur SL
Chlorure de sodiumSigma-Aldrich7647-14-5
Phosphate de sodium dibasiqueSigma-Aldrich7558-79-4
Phosphate de sodium monobasiqueSigma-Aldrich13472-35-0
11815024

Références

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