Imagerie des vésicules extracellulaires par microscopie de force atomique

Résumé

Une procédure étape par étape est décrite pour l'immobilisation sans étiquette des exosomes et des vésicules extracellulaires à partir d'échantillons liquides et leur imagerie par microscopie de force atomique (AFM). Les images de l'AFM sont utilisées pour estimer la taille des vésicules de la solution et caractériser d'autres propriétés biophysiques.

Résumé

Les exosomes et autres vésicules extracellulaires (VEV) sont des complexes moléculaires constitués d'une vésicule de membrane lipidique, de sa décoration de surface par des protéines membranaires et d'autres molécules, et d'un contenu luminaire diversifié hérité d'une cellule parente, qui comprend des ARN, protéines et les ANN. La caractérisation des tailles hydrodynamiques des véhicules électriques, qui dépend de la taille de la vésicule et de sa couche coronale formée par des décorations de surface, est devenue routinière. Pour les exosomes, le plus petit des véhicules électriques, la différence relative entre les tailles hydrodynamiques et vésicules est significative. La caractérisation de la taille des vésicules par l'imagerie par électron de transmission cryogénique (cryo-TEM), une technique d'étalon-or, demeure un défi en raison du coût de l'instrument, de l'expertise requise pour effectuer la préparation de l'échantillon, l'imagerie et data, et un petit nombre de particules souvent observées dans les images. Une alternative largement disponible et accessible est la microscopie de force atomique (AFM), qui peut produire des données polyvalentes sur la géométrie tridimensionnelle, la taille, et d'autres propriétés biophysiques des vésicules extracellulaires. Le protocole développé guide les utilisateurs dans l'utilisation de cet outil d'analyse et décrit le flux de travail pour l'analyse des véhicules électriques par l'AFM, qui comprend la préparation de l'échantillon pour l'imagerie des véhicules électriques sous forme hydratée ou desséchée, l'immobilisation électrostatique de vésicules sur un substrat, l'acquisition de données, son analyse et son interprétation. Les résultats représentatifs démontrent que la fixation des véhicules électriques sur la surface modifiée du mica est prévisible, personnalisable et permet à l'utilisateur d'obtenir des résultats de dimensionnement pour un grand nombre de vésicules. Le dimensionnement de la vésicule basé sur les données de l'AFM s'est avéré compatible avec l'imagerie cryo-TEM.

Introduction

Les vésicules extracellulaires (VE) sont présentes dans tous les liquides organiques, y compris le sang, l'urine, la salive, le lait et le liquide amniotique. Les exosomes forment une classe de district d'EV différenciés des autres véhicules électriques par la biogenèse endosomale, les marqueurs de la voie endosomal, et la plus petite taille parmi tous les véhicules électriques. La taille des exosomes est souvent rapportée avec une variabilité substantielle entre les études. Les résultats de dimensionnement ont été jugés dépendants de la méthode, reflétant la différence dans les principes physiques utilisés par différentes techniques analytiques pour estimer les taill....

Protocole

1. Isolement des véhicules électriques d'un biofluide

1. Isoler les véhicules électriques par l'une des méthodes établies, telles que l'ultracentrifugation différentielle⁸, précipitations, ou chromatographie de taille-exclusion⁹.
2. Confirmer la présence de biomarqueurs de surface et de lumière attendus et l'absence de biomarqueurs indiquant une contamination croisée de la préparation. Confirmer la morphologie bicouche lipidique des particules isolées par microscopie électronique.
   REMARQUE : Lors de l'isoler des exosomes, la distribution de la taille hydrodynamique mesurée par l'analyse ....

Résultats

La fixation de surface des véhicules électriques est une étape critique dans la séquence d'imagerie. L'immobilisation de surface électrostatique des exosomes, connue pour avoir un potentiel négatif de zeta, se produira robustement après que le substrat du mica soit modifié pour avoir une charge positive de surface. Sans le traitement avec NiCl₂ pour donner des changements positifs de surface, l'immobilisation des véhicules électriques sur le substrat s'est avérée inefficace. L'image de hauteur de

Discussion

L'immobilisation des véhicules électriques à partir d'un fluide biologique, d'un balayage de surface et d'une analyse d'image sont les étapes essentielles du protocole élaboré pour la caractérisation des véhicules électriques par aFM en liquide. Le nombre de vésicules propices aux échelles d'imagerie AFM avec la surface imageetée et la concentration de surface des vésicules immobilisées sur le substrat. Compte tenu d'un potentiel zeta négatif des véhicules électriques et des exosomes^18,nous précon.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Contrôleur AFM/STM  ;	Bruker	Multimode Nanoscope V	Ce contrôleur AFM prend en charge l’imagerie d’échantillons biologiques dans le liquide et dans l’air.
Disques d’échantillon métallique AFM/STM (10 mm)	TedPella	16207	Disque d’échantillon métallique sur lequel un disque de mica est fixé à l’aide d’un ruban adhésif double face ou d’un autre moyen.
Disques AFM/STM Mica (10 mm)	TedPella	50	Mica V1 de la plus haute qualité, 0,21 mm (0,0085") d’épaisseur. Entrelacés, par paquets de 10. Peut être monté sur des disques AFM/STM. Disponible en quatre diamètres
Sonde AFM pour l’imagerie dans l’air	Bruker	TESP-V2	Sondes en silicone gravé de haute qualité pour le mode de tapotement et le mode sans contact pour le balayage dans l’air.
Sonde AFM pour l’imagerie d’échantillons souples dans le liquide	Bruker	MLCT	Cantilevers souples en nitrure de silicium avec pointes en nitrure de silicium, qui sont bien adaptés au fonctionnement liquide.  ; La plage de constantes de force permet aux utilisateurs d’imager des échantillons extrêmement mous en mode contact ainsi qu’en spectroscopie charge élevée par rapport à distance.
Ruban adhésif double face	Spectrum	360-77705	Utilisé pour fixer le disque de mica sur le disque d’échantillon métallique.
ExoQuick-TC	System Biosciences	EXOTC50A-1	ExoQuick-TC est un kit exclusif à base de polymères conçu pour l’isolement d’exosomes à partir de milieux de culture tissulaire.
Support AFM de sonde en verre pour l’imagerie dans le liquide	Bruker	; MTFML-V2	Ce support de sonde en verre est conçu pour le balayage en fluide avec l’AFM multimode. Le support peut être utilisé en mode de taraudage de force maximale, en mode contact, en mode taraudage et en modulation de force. La sonde est entraînée acoustiquement par un oscillateur piézoélectrique séparé pour une modulation d’amplitude plus grande. Le support est fourni avec deux ports, les raccords nécessaires et le kit d’accessoires pour l’ajout et le retrait de fluides.
Institut tchèque de métrologie	de Gwyddion	Version 2.52	Logiciel Open Source pour la visualisation et l’analyse des champs de données obtenus par des techniques de microscopie à sonde à balayage.
Papier buvard non pelucheux	GE Healthcare Whatman  ;	Papier buvard de qualité GB003	Utilisez ce papier buvard pour éliminer le NiCl2 après la modification du substrat du mica.   ;
Lingettes non pelucheuses pour salles blanches	Texwipe	AlphaWipe TX1004	Utilisez ces lingettes en polyester pour le nettoyage des surfaces.
Chlorure de nickel(II) (NiCl2)	Sigma-Aldrich	339350	Poudre utilisée pour fabriquer 10 mM NiCl2 dans de l’eau DI
Phosphate Saline tamponnée (1x)	Gibco	10010023	PBS, pH 7,4

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