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Article de méthode

Croissance et caractérisation des organoïdes irradiés des glandes mammaires

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DOI :

10.3791/59293

⸱

3 mai 2019

 ,  ,  , 
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Vanderbilt University, 2Department of Biomedical Engineering, Vanderbilt University, 3Department of Radiation Oncology, Vanderbilt University Medical Center

Dans cet article

Résumé

Les organoïdes développés à partir de glandes mammaires de souris ont été irradiés et caractérisés pour évaluer les traits épithéliaux et les interactions avec les cellules immunitaires. Les organoïdes irradiés peuvent être utilisés pour mieux évaluer les interactions de cellules cellulaires qui peuvent conduire au recrutement de cellules tumorales dans le tissu normal irradié.

Résumé

Les organoïdes dérivés du tissu digéré sont des constructions tridimensionnelles (3D) multicellulaires qui mieux récapitulent les conditions in vivo que les monocouches cellulaires. Bien qu’ils ne puissent pas complètement modéliser la complexité in vivo, ils conservent certaines fonctionnalités de l’orgue d’origine. Dans les modèles de cancer, les organoïdes sont couramment utilisés pour étudier l’invasion de cellules tumorales. Ce protocole vise à développer et caractériser les organoïdes du tissu de la glande mammaire de souris normale et irradiée pour évaluer la réponse de rayonnement dans les tissus normaux. Ces organoïdes peuvent être appliqués à de futures études de cancer in vitro pour évaluer les interactions des cellules tumorales avec des organoïdes irradiés. Les glandes mammaires ont été retouchées, irradiées à 20 Gy et digérées dans une solution de collagénase VIII. Les organoïdes épithéliaux ont été séparés par une différenciation centrifuge, et des organoïdes 3D ont été développés dans des microplaques à faible adhérence à 96 puits. Les organoïdes ont exprimé la cytokératine du marqueur épithélial caractéristique 14. L’interaction macrophage avec les organoïdes a été observée dans des expériences de co-culture. Ce modèle peut être utile pour étudier les interactions tumeur-stromale, l’infiltration des cellules immunitaires et la polarisation des macrophages dans un microenvironnement irradié.

Introduction

Environ 60% des patients atteints de cancer du sein à triple négatif (TNBC) choisissent une thérapie de conservation du sein (BCT) comme forme de traitement1. Dans cette modalité de traitement, la tumeur contenant une partie du tissu mammaire est enlevée, et le tissu normal environnant est exposé aux rayonnements ionisants pour tuer les cellules tumorales résiduelles. Le traitement réduit la récurrence dans une grande partie de la population de cancer du sein; Cependant, environ 13,5% des patients traités par TNBC éprouvent des récidives locorégionales2. Par conséquent, étudier comment le rayonnement peut recruter des cellules tumorales circulantes (CTCS) mènera à des aperçus importants sur la récurrence locale3,4.

Des travaux antérieurs ont montré que le rayonnement du tissu normal augmente le recrutement de divers types de cellules5. Dans les modèles précliniques de TNBC, l’irradiation du tissu normal augmentait le macrophages et subséquemment le recrutement des cellules tumorales dans les tissus normaux5. Le statut immunitaire a influencé le recrutement des cellules tumorales sur les sites irradiés, avec la migration des cellules tumorales observée chez les sujets immunodéprimés. La récapitulation de ces interactions à l’aide d’organoïdes dérivés de glandes mammaires permettra l’observation de la migration cellulaire et des interactions cellules-stromales en temps réel avec la microscopie et l’imagerie cellulaire en direct afin de déterminer le rôle des dommages causés par les radiations lors de l’altération comportement des cellules tumorales.

Souris mammaires organoïdes ont contribué à élucider les étapes clés dans le développement de la glande mammaire. Un organoïde mammaire est une construction multicellulaire en trois dimensions de l’épithélium mammaire isolé qui est plus grand que 50 μM6,7,8,9,10. À l’aide d’organoïdes épithéliaux primaires, Simian et coll. ont évalué les facteurs nécessaires à la ramification dans la glande mammaire7. Shamir et coll. ont découvert que la dissémination peut se produire sans transition épithéliale à médéchymateuses, ce qui donne un aperçu de la cascade métastatique8. Les méthodes de production et de caractérisation des organoïdes du tissu de la glande mammaire sont bien établies6,11,12,13. Cependant, à notre connaissance, les méthodes de croissance des organoïdes irradiés des glandes mammaires n’ont pas été rapportées. Un protocole pour la culture et la caractérisation des organoïdes irradiés serait une étape cruciale dans la récapitulation du recrutement immunitaire et des cellules tumorales induite par le rayonnement.

Dans cet article, nous rapmettons une méthode pour cultiver et caractériser les organoïdes épithéliaux mammaires irradiés dans des microplaques à faible adhérence recouvertes d’un polymère hydrophile qui soutient la formation de sphéroïïdes. Ces organoïdes ont été co-cultivés avec des macrophages pour examiner la cinétique d’infiltration des cellules immunitaires. Ce travail peut être étendu pour inclure les organoïdes de co-culturing avec les cellules adipeuses pour récapituler les caractéristiques mammaires, les cellules cancéreuses du sein pour visualiser le recrutement de cellules tumorales, et les cellules de T + + T pour étudier les interactions de cellules de tumeur-immunes. Des protocoles préalablement établis peuvent être utilisés pour évaluer les organoïdes irradiés. Les modèles antérieurs co-culturant les organoïdes mammaires et les cellules immunitaires ont mis en lumière les mécanismes de métastase et de dissémination. DeNardo et coll. ont constaté que la régulation des lymphocytes T CD4 + des macrophages associés aux tumeurs a amélioré le phénotype métastatique des adénocarcinomes mammaires14. Des modèles de co-culture ont également été utilisés pour élucider les mécanismes de développement biologique. Plaks et coll. ont clarifié le rôle des lymphocytes T CD4 + comme régulateurs de bas de l’organogenèse mammaire15. Cependant, notre groupe est le premier à établir une procédure de visualisation de la façon dont l’irradiation tissulaire normale influe sur le comportement des cellules immunitaires. Parce que l’irradiation normale des tissus a été montré pour améliorer le recrutement de cellules tumorales5, ce protocole peut être développé pour analyser comment le comportement des cellules tumorales est altéré par l’irradiation des tissus normaux et des cellules, conduisant à une meilleure compréhension de récidive du cancer.

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Protocole

Des études sur les animaux ont été réalisées conformément aux directives et protocoles institutionnels approuvés par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université Vanderbilt.

1. préparation des souris et acquisition de cellules (adapté de Nguyen-Ngoc et al.11)

  1. Sacrifiez des souris nu/nu athymiques (8-10 semaines) en utilisant l’asphyxie du CO2 suivie d’une dislocation cervicale. Nettoyez la peau à l’aide de 70% d’éthanol.
  2. Resect glandes mammaires abdominales et inguinaux de souris à l’aide de ciseaux pré-stérilisés et forceps. Enlevez les ganglions lymphatiques avant la résection. Rincer dans une solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS) (figure 1a).
  3. Placez-le dans des tubes de 15 mL avec 10 mL de mélange de milieux/nutriments de Dulbecco modifié Eagle F12 (DMEM/F12) pour le transport. Les échantillons peuvent être conservés pendant la nuit à 4 ° c ou traités immédiatement. Continuez sur la glace.
  4. Irradier des échantillons à 20 Gy à l’aide d’une source de césium (figure 1b).
  5. 45 min après irradiation, placer les glandes mammaires dans une plaque de cellule stérile de 35 mm et émincer avec des scalpels (figure 1c, D). Hacher avec environ 40 coups jusqu’à ce que le tissu se détend et que les morceaux soient obtenus qui ne sont pas plus grands que approximativement 1 mm2 dans la zone.
  6. Transférer à la solution de collagénase dans un tube de centrifugation de 50 mL. La solution de collagénase se compose de 2 mg/ml de collagénase (voir tableau des matériaux), de 2 mg/ml de trypsine, de 5% v/v de sérum bovin fœtal (FBS), de 5 μg/ml d’insuline et de 50 μg/ml de gentamicine dans les milieux DMEM/F12. Utilisez une solution de collagénase de 10 mL par souris.
  7. Placer dans un bain d’eau à 37 ° c, Vortex toutes les 10 min pour 30-60 min. la digestion est complète lorsque la solution de collagénase est trouble (figure 1e, F).
  8. Faire tourner la solution digéré à 450 x g pendant 10 min à température ambiante (RT). Trois couches seront observées. Le surnageant est composé de graisse, la couche intermédiaire est une solution aqueuse, et le fond est un culot. Le culot apparaîtra en rouge car il s’agit d’un mélange de cellules épithéliales, de cellules stromales individuelles et de globules rouges (figure 1g).
  9. Préenduire toutes les pipettes, pointes de pipette et tubes à centrifuger avec une solution d’albumine sérique bovine (BSA) avant le contact. La solution BSA se compose de 2,5 w/v% de BSA dans le sérum physiologique tamponné au phosphate de Dulbecco (DPBS). Pour le pré-enrobage, il suffit d’ajouter puis de retirer la solution BSA à l’intérieur de la pointe de la pipette et des tubes. La solution BSA peut être réutilisée, bien qu’elle doive être filtrée stérile avant chaque expérience.
  10. Pour une récupération supplémentaire, transférer le surnageant dans un tube de 15 mL frais recouvert de BSA. Pipetter de haut en bas vigoureusement pour disperser la couche grasse. Centrifugez à 450 x g pendant 10 min à la RT. aspirate le surnageant, laissant une petite quantité de médias dans le tube pour éviter d’aspirer le culot de la cellule.
  11. Aspirer la couche aqueuse du tube avec le culot d’origine.
  12. Ajouter 10 mL de DMEM/F12 au tube avec le culot d’origine et le transférer dans le deuxième tube. Pipetter vigoureusement pour combiner et Resuspendre les deux pastilles.
  13. Centrifuger à 450 x g pendant 10 min à RT. aspirer le surnageant et ajouter 4 ml de DMEM/F12 au tube.
  14. Ajouter 40 μL de désoxyribonucléase (DNase) à la suspension et agiter doucement à la main pendant 2-5 min à la solution RT. DNase se compose de 4 U/mL de DNase dans le DMEM/F12.
  15. Ajouter 6 mL de DMEM/F12 et Pipetter soigneusement. Centrifuger le tube à 450 x g pendant 10 min à RT.
  16. Aspirate surnageant à la marque de 0,5 mL. Résuspendez dans 10 mL de DMEM/F12 et Pipettez soigneusement.
  17. Impulsion à 450 x g et arrêt 4 s après avoir atteint cette vitesse.
  18. Répétez les étapes 1.16-1.17 trois fois de plus pour purifier les organoïdes par différenciation centrifuge. Le culot doit maintenant être une couleur blanc cassé composée uniquement d’organoïdes épithéliaux (figure 1H).
    Remarque: les organoïdes peuvent également être filtrés à l’aide de filtres à mailles stériles 40 μm. Après l’étape 1,16, les milieux de pipette contenant des organoïdes dans un filtre dans un tube de centrifugation, puis rincer avec 5 à 10 mL de support DMEM/F12. Retournez le filtre sur un nouveau tube à centrifuger de 50 mL. Passez 10 mL de média DMEM/F12 à travers, en allant dans le sens inverse pour rincer tout retentate. Le rétentat doit consister en organoïdes, et le filtrat doit se composer principalement de cellules stromales, qui peuvent être jetées ou conservées si désiré.

2. détermination des organoïdes de densité et de placage

  1. Resuspendre le pellet dans 10 mL de DMEM/F12. Pipetter soigneusement pour créer une solution homogène.
  2. Transférer 50 μL dans une boîte de Petri de 30 mm et voir sous un microscope à contraste de phase à 20x. Comptez le nombre d’organoïdes avec un compteur de décompte.
    Remarque: ici, les pointes de pipette ont été systématiquement utilisées avec un diamètre minimal de 457 μm, soit 5-10 fois le diamètre des organoïdes qui sont ensemencés. Pour le transfert de volumes de 2 mL ou plus (par exemple, les étapes 1,16 et 2,1), utiliser des Pipettes sérologiques dont le diamètre de pointe est supérieur à 1 500 μm.
  3. Calculez la densité organoïde à l’aide de l’équation suivante:
    figure-protocol-1
    La densité souhaitée est de 1 000 organoïdes/mL pour simplifier la dilution. Si la densité est trop faible, centrifuger à 450 x g pendant 5 min et aspirer les médias. Ajouter le support nécessaire pour atteindre 1 000 organoïdes/mL, et Pipetter à fond pour créer un mélange homogène.
    1. Pour cultiver des organoïdes dans une matrice protéique, les organoïdes de semence à une concentration de 1 organoïde/L dans le collagène de type 1 dilué à 87% ou dans la membrane de sous-sol extraite du sarcome de souris Engelbreth-Holm-Swarm. Tout en travaillant avec des échantillons, garder sur la glace.
    2. Pour geler les organoïdes, transférer le volume désiré à un tube de centrifugation distinct. Tourner vers le bas à 450 x g pendant 5 min. aspirer les médias, puis ajouter le même volume de 90% FBS/10% de DMSO. Résuspendez les organoïdes, puis aliquote dans les CryoTubes. Transférer à-80 ° c, puis à l’azote liquide dans une semaine.
    3. Pour décongeler, réchauffer dans un bain d’eau 37 ° c pendant une minute. Centrifuger à 450 x g pendant 5 min, puis aspirer les fluides de congélation. Rincer avec le DPBS stérile, puis centrifuger à nouveau. Aspirate DPBS et ajouter des médias organoïdes.
  4. Pipetter 50 μL (50 organoïdes) dans chaque puits de la plaque à faible adhérence (figure 1I).
  5. Ajouter 150 μL de milieux organoïdes pour ramener le volume de travail total à 200 μL. les milieux organoïdes se composent de 1% de pénicilline-streptomycine et de 1% d’insuline-transferrine-sélénium (ITS) dans les milieux DMEM/F12.
  6. Tous les 2 jours, remplacez les médias avec précaution.
    Remarque: les plaques à faible adhérence ne sont pas traitées à la culture tissulaire; par conséquent, les cellules peuvent être facilement détachées. Aspirer les médias lentement en inclinant la plaque et en insérant l’embout de la pipette au bord de chaque puits. Laissez une petite quantité de médias dans le fond du puits. Ajouter un nouveau support lentement pour éviter d’appliquer des forces de cisaillement inutiles aux organoïdes.

3. co-culturing avec les macrophages

  1. Maintenir les macrophages bruts 264,7 marqués GFP ou dTomato dans les milieux DMEM additionnés de 10% de FBS et de 1% de pénicilline-streptomycine. Graine 1 x 104,5 x 104ou 1 x 105 cellules/ml dans un support organoïde.
  2. Utilisez le contraste de phase des cellules vivantes et l’imagerie fluorescente pour surveiller l’infiltration des macrophages au fil du temps.

4. coloration immunofluorescence des organoïdes

Remarque: les organoïdes peuvent être colorés dans des puits à faible adhérence ou peuvent être transférés sur des lames de chambre. Pour transférer, Pipetter doucement vers le haut et vers le bas jusqu’à ce que les organoïdes se détachent des plaques. Transférer aux lames de chambre et incuber pendant 4-8 h pour permettre aux organoïdes d’adhérer à la surface de la plaque.

  1. Retirer le milieu organoïde des puits en aspirant soigneusement. Fixer les échantillons avec 10% de formol tamponné neutre pendant 15 min à RT.
  2. Laver 3x 5 min en 1x PBS. Si désiré, des échantillons fixes peuvent être stockés à 4 ° c pendant une semaine pour une coloration ultérieure.
  3. Perméabilize avec 0,1% 4-(1, 1, 3, 3-tétraméthylbutyl) phényl-polyéthylène glycol pendant 5 min.
    NOTE: pour colorer l’actine F, incuber des échantillons avec de la phalloïdine diluée 1:1000 et 1,67 nM de colorant nucléaire de bisbenzimide dans 1% de PBS/BSA pendant 1 h à RT. Ensuite, passez à l’étape 4,8.
  4. Bermeabilize avec 0.5 PBS. Les échantillons peuvent être stockés sur des images 4opy et des images immunofluorescentes. les mécanismes qui contribuent à la rlock CTC avec 5% de sérum de chèvre normal dans 0,1% de PBS/polyéthylène glycol monolaurate de sorbitan (PBST) pendant 1 h à RT. laver 3x 5 min avec PBS.
  5. Incuber avec de l’anti-cytokératine 14 dilué 1:1000, E-cadherin dilué 1:200, ou protéine de jonction serrée One dilué 1:100 dans 1% NGS en PBST pendant 1 h à RT. laver 3x 5 min en PBST.
  6. Incuber avec goat anti-rabbit secondaire dilué 1:200 avec 1% NGS/PBST pendant 1 h à RT. recouvrir d’une feuille d’aluminium pour éviter toute exposition à la lumière.
  7. Laver 3x 5 min en PBS. Utiliser le colorant nucléaire (voir tableau des matériaux) pour colorer les noyaux.
  8. Laver 3x 5 min en PBS. Si vous utilisez une glissière de chambre, montez avec une lèvre. Conserver enveloppé dans une feuille d’aluminium à 4 ° c pendant 2 semaines.

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Résultats

Les organoïdes épithéliaux mammaires irradiés ont été obtenus avec succès à partir de glandes mammaires de souris, traitées et cultivées sur des plaques à faible adhérence (figure 1). Le rendement organoïde a été testé par ensemencement dans différents environnements de croissance (figure 2a-G). Les cellules ensemencées directement sur la culture tissulaire traitée sur des plaques cellulaires de 10 cm ont donné une prolifération de cellules fibroblastes. Les fibroblastes ont...

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Discussion

Dans ce protocole, nous avons développé une méthode pour la croissance reproductible et la caractérisation des organoïdes des mammaires irradiés (figure 1). Une dose d’irradiation de 20 GY a été appliquée pour refléter les précédents modèles in vivo de recrutement de cellules tumorales5. L’irradiation des glandes mammaires ex vivo avant la formation organoïde a permis l’isolement des effets de dommages de rayonnement sans infiltration correspondante des cellules immun...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous remercions le Dr Laura L. BRONSART d’avoir fourni des macrophages bruts 264,7 de GFP et de dTomato. Cette recherche a été financée financièrement par la subvention NIH #R00CA201304.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
10 % Neutre Buffered FormalinVWR16004-128
Anti-cytokératine 14abcamAB181595Lot : GR3200524-3
Bovin Serum AlbuminSigmaA1933-25G
Collagène de type ICorning354236
Collagénase de Clostridium histolyticum, Type VIIISigmaC2139
Collagénase IGibco17018029
DMEM/F12Thermofisher11320-033
DNAseRoche10104159001
DPBSFisher14190250
E-CadhérineSignalisation cellulaire24E10Lot : 13
FBSSigmaF0926
GentamicineGibco15750
Chèvre anti-lapin secondaireabcamAB150077vert
Lot : GR3203000-1
Chèvre anti-lapin secondaireabcamab150080rouge
Lot : GR3192711-1
Hoechst 33342Fisher62249Lot : TG2611041
Insuline (10 mg/mL)SigmaI9278
Insuline-Transferrin-Selenium, 100xGibco51500-056
Matrigel Membrane basale (membrane basale extraite du sarcome de souris Engelbreth-Holm-Swarm)Corning356237
Normal GoatSerum Vector LaboratoriesS-1000
Nuclon Sphera 96 plaquesde puits Thermo174927
PBSVWR10128-856
Pen/streptocoqueFisher
Phalloidinabcam ab176757Lot : GR3214582-16
Protéine de jonction serrée 1NovusNBP1-85047Lot : C115428
Triton X-100 (4-(1,1,3,3-Tétraméthylbutyl)phényl-polyéthylène glycol)SigmaX100-100ML
TrypsineGibco27250-018
Tween-20 (monolaurate de sorbitan de polyéthylène glycol)SigmaP1379-100ML
15140122

Références

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