Croissance et caractérisation des organoïdes irradiés des glandes mammaires

Résumé

Les organoïdes développés à partir de glandes mammaires de souris ont été irradiés et caractérisés pour évaluer les traits épithéliaux et les interactions avec les cellules immunitaires. Les organoïdes irradiés peuvent être utilisés pour mieux évaluer les interactions de cellules cellulaires qui peuvent conduire au recrutement de cellules tumorales dans le tissu normal irradié.

Résumé

Les organoïdes dérivés du tissu digéré sont des constructions tridimensionnelles (3D) multicellulaires qui mieux récapitulent les conditions in vivo que les monocouches cellulaires. Bien qu’ils ne puissent pas complètement modéliser la complexité in vivo, ils conservent certaines fonctionnalités de l’orgue d’origine. Dans les modèles de cancer, les organoïdes sont couramment utilisés pour étudier l’invasion de cellules tumorales. Ce protocole vise à développer et caractériser les organoïdes du tissu de la glande mammaire de souris normale et irradiée pour évaluer la réponse de rayonnement dans les tissus normaux. Ces organoïdes peuvent être appliqués à de futures études de cancer in vitro pour évaluer les interactions des cellules tumorales avec des organoïdes irradiés. Les glandes mammaires ont été retouchées, irradiées à 20 Gy et digérées dans une solution de collagénase VIII. Les organoïdes épithéliaux ont été séparés par une différenciation centrifuge, et des organoïdes 3D ont été développés dans des microplaques à faible adhérence à 96 puits. Les organoïdes ont exprimé la cytokératine du marqueur épithélial caractéristique 14. L’interaction macrophage avec les organoïdes a été observée dans des expériences de co-culture. Ce modèle peut être utile pour étudier les interactions tumeur-stromale, l’infiltration des cellules immunitaires et la polarisation des macrophages dans un microenvironnement irradié.

Introduction

Environ 60% des patients atteints de cancer du sein à triple négatif (TNBC) choisissent une thérapie de conservation du sein (BCT) comme forme de traitement¹. Dans cette modalité de traitement, la tumeur contenant une partie du tissu mammaire est enlevée, et le tissu normal environnant est exposé aux rayonnements ionisants pour tuer les cellules tumorales résiduelles. Le traitement réduit la récurrence dans une grande partie de la population de cancer du sein; Cependant, environ 13,5% des patients traités par TNBC éprouvent des récidives locorégionales². Par conséquent, étudier comment le rayonnement peut recruter des ce....

Protocole

Des études sur les animaux ont été réalisées conformément aux directives et protocoles institutionnels approuvés par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université Vanderbilt.

1. préparation des souris et acquisition de cellules (adapté de Nguyen-Ngoc et al.¹¹)

1. Sacrifiez des souris nu/nu athymiques (8-10 semaines) en utilisant l’asphyxie du CO₂ suivie d’une dislocation cervicale. Nettoyez la peau à l’aide de 70% d’éthanol.
2. Resect glandes mammaires abdominales et inguinaux de souris à l’aide de ciseaux pré-stérilisés et forceps. Enlevez les ganglions lymph....

Résultats

Les organoïdes épithéliaux mammaires irradiés ont été obtenus avec succès à partir de glandes mammaires de souris, traitées et cultivées sur des plaques à faible adhérence (figure 1). Le rendement organoïde a été testé par ensemencement dans différents environnements de croissance (figure 2a-G). Les cellules ensemencées directement sur la culture tissulaire traitée sur des plaques cellulaires de 10 cm ont donné une prolifération de cellules fibroblastes. Les fibroblastes ont.......

Discussion

Dans ce protocole, nous avons développé une méthode pour la croissance reproductible et la caractérisation des organoïdes des mammaires irradiés (figure 1). Une dose d’irradiation de 20 GY a été appliquée pour refléter les précédents modèles in vivo de recrutement de cellules tumorales⁵. L’irradiation des glandes mammaires ex vivo avant la formation organoïde a permis l’isolement des effets de dommages de rayonnement sans infiltration correspondante des cellules immun.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
10 % Neutre Buffered Formalin	VWR	16004-128
Anti-cytokératine 14	abcam	AB181595	Lot : GR3200524-3
Bovin Serum Albumin	Sigma	A1933-25G
Collagène de type I	Corning	354236
Collagénase de Clostridium histolyticum, Type VIII	Sigma	C2139
Collagénase I	Gibco	17018029
DMEM/F12	Thermofisher	11320-033
DNAse	Roche	10104159001
DPBS	Fisher	14190250
E-Cadhérine	Signalisation cellulaire	24E10	Lot : 13
FBS	Sigma	F0926
Gentamicine	Gibco	15750
Chèvre anti-lapin secondaire	abcam	AB150077	vert Lot : GR3203000-1
Chèvre anti-lapin secondaire	abcam	ab150080	rouge Lot : GR3192711-1
Hoechst 33342	Fisher	62249	Lot : TG2611041
Insuline (10 mg/mL)	Sigma	I9278
Insuline-Transferrin-Selenium, 100x	Gibco	51500-056
Matrigel Membrane basale (membrane basale extraite du sarcome de souris Engelbreth-Holm-Swarm)	Corning	356237
Normal Goat	Serum Vector Laboratories	S-1000
Nuclon Sphera 96 plaques	de puits Thermo	174927
PBS	VWR	10128-856
Pen/streptocoque	Fisher
Phalloidin		abcam ab176757	Lot : GR3214582-16
Protéine de jonction serrée 1	Novus	NBP1-85047	Lot : C115428
Triton X-100 (4-(1,1,3,3-Tétraméthylbutyl)phényl-polyéthylène glycol)	Sigma	X100-100ML
Trypsine	Gibco	27250-018
Tween-20 (monolaurate de sorbitan de polyéthylène glycol)	Sigma	P1379-100ML

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