Cet article présente une méthode chirurgicale dissection Drosophila pupes rétines ainsi que de protocoles pour le traitement du tissu pour l’immunohistochimie, l’Ouest analyse et extraction de l’ARN.
Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.
Article de méthode
Dissection de la rétine de pupes de drosophile pour immunohistochimie, analyse occidentale et isolement d’ARN
Dans cet article
Résumé
Résumé
La rétine de pupes de Drosophila fournit un système excellent modèle pour l’étude des processus morphogénétiques pendant le développement. Dans cet article, nous présentons un protocole fiable pour la dissection de la rétine de pupes de Drosophila délicate. Notre approche chirurgicale utilise des outils de microdissection facilement disponibles pour ouvrir des pupes et extraire précisément complexes de l’oeil-cerveau. Ces peuvent être fixe, soumis à l’immunohistochimie et rétines puis montés sur lames de microscope et imagés si l’objectif est de détecter les structures cellulaires ou infracellulaires. Alternativement, interprétations rétines peuvent être isolées du tissu cérébral, lysées dans les tampons appropriés et utilisés pour gel électrophorèse ou ARNm extraction de protéine (évaluer l’expression de protéines ou de gènes, respectivement). Patience et pratique importante est requise pour maîtriser le protocole de microdissection décrit, mais une fois maîtrisé, le protocole permet d’isolement relativement rapide des rétines essentiellement intacts.
Introduction
La rétine de la drosophile est composée d’environ 750 ommatidies entourés de cellules pigmentaires disposés en nid d’abeilles trellis1,2,3,4. Chaque Ommatidie contient les neurones photorécepteurs huit, quatre cellules de cône sécrétant des lentilles et deux cellules de pigment primaires. Entourant chaque Ommatidie est les cellules productrices de pigment de treillis et de groupes de soies sensorielles. En raison de sa nature post-mitotique et stéréotypée arrangement hexagonal, la rétine de pupes de Drosophila fournit un sy....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Protocole
1. préparation du tissu
- Mise en place de Drosophila traverse (comme décrit plus haut20) ou la culture de certaines souches de Drosophila afin d’obtenir des nymphes du génotype désiré. Pour s’assurer qu’un grand nombre de nymphes émergence soit dit en passant, mettre en place ces cultures voler en double sur les médias d’aliments riches en nutriments ou norme alimentaire généreusement additionnée de levure-pâte.
- Maintenir les cultures de la drosophile à 25 ° C. Pour les croisements utilisant le système de GAL4-UAS, GMR-GAL4 est un pilote idéal exprimé dans des cellules de le œil larvaire di....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Résultats
Le œil nymphal est un tissu facile d’accès qui sert un excellent modèle pour étudier les processus de développement de la morphogenèse de ce lecteur. Ici, nous avons disséqué les rétines et immunofluorescence permettant de détecter les jonctions adherens apicale (Figure 3 a, C) ou la caspase Dcp-1 (Figure 3D) qui est activé au cours de l’apoptose (Figure 3)25. Ces approches permettent d’obser.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Discussion
La méthode de dissection de pupes oeil Drosophila décrite ici permet l’isolement des complexes d’oeil-cerveau 6 à 10 de 10 à 15 min. Cependant, patience et pratique sont indispensables afin de maîtriser la technique de dissection et d’améliorer la qualité et la rapidité des dissections. Ce temps de dissection court s’assure que chaque oeil est approximativement le même stade de développement, réduisant la variabilité dans l’expression de phénotype ou gène des rétines dans un ensemble de données. Tandis que d’aut.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Nous remercions Zack tambour et nos évaluateurs des commentaires utiles sur le manuscrit. Ce travail a été soutenu par R15GM114729.
....Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Adobe Photoshop | Logiciel de traitement d’images | Adobe | |
| Attelles en bambou, 6" ; | Ted Pella Inc | 116 | |
| Bêta-mercaptoéthanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Phosphate de bêta-glycérol | Sigma-Aldrich | 50020 | |
| Plat | Boîte de Pétri en verre remplie jusqu’au bord de SYLG170 ou de SYLG184 (colorée en noir avec de la poudre de charbon de bois finement moulue). Laisser à température ambiante pendant 24-48 h pour polymériser. | ||
| Porte-lame | Fine Science Tools | 10053 | |
| Albumine sérique bovine | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| comprimés cocktail d’inhibiteurs de protéase sans EDTA Roche | 4693132001 | ||
| Microscope confocal (Zeiss LSM 501) | Microscope Carl Zeiss | ou similaire | |
| Pyrocarbonate de diéthyle (DEPC) | Sigma-Aldrich | 40718 | |
| Ruban adhésif double face | 3M | 665 | |
| Drosophila supports alimentaires, riches en nutriments ; | 7,5 % de saccharose, 15 % de glucose, 2,5 % d’agar, 20 % de levure de bière, 5 % de peptone, 0,125 % de MgSO4.7H2O, 0,125 % de CaCl2.2H20 | ||
| Drosophila milieux alimentaires, recette standard de | semoule de maïs Bloomington Drosophila Stock Center. ; (https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html) | ||
| Acide éthylènediaminetétraacétique | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Solution | de formadehyde à 4 % dans du PBS, pH 7,4. | ||
| Microscope à fluorescence (microscope TCS SP5 DM) | Leica Microsystems | ou microscope similaire | |
| Pinces ; | Outils de sciences fines | 91150-20 | Les pinces doivent être affûtées fréquemment. |
| Formaldéhyde | Thermo Scientific | 28908 | |
| Verre Plats 9 puits ; | Corning | 7220-85 | Aussi connu sous le nom de plats à 9 puits ; |
| Lamelles en verre (22 x 22 mm) | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Lames de microscope en verre (25 x 75 x 1 mm) | Fisher Scientific | 12-550-413 | |
| Boîte de Pétri en verre | Corning | 3160-100BO | |
| Glycérol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Logiciel Image Studio version 5.2.5 | LI-COR Biosciences | Logiciel de traitement d’images pour la quantification des Western blots. | |
| Tampon d’échantillon Laemmli | Bio-Rad | 161-0737 | Tampon d’échantillon de protéines concentré 2X, supplément de bêta-mercaptoéthanol selon les instructions du fabricant. |
| Marqueur de voie réduisant le tampon d’échantillons ; | ThermoFisher Scientific | 39000 | 5X tampon d’échantillon de protéines concentrées. |
| Tubes microcentrigures ; | Axygen | MCT-175-C | |
| Ciseaux de microdissection. | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| Plateaux Microwell (72 x 10 & micro ; Puits en L) | Nunc | 438733 | |
| Média | 0,5 % de N-propylgallate et 80 % de glycérol dans du | ||
| PBS N-propylgallate | Sigma-Aldrich | P3130 | |
| PBS sans nucléases (PBS en 0,1 % de DEPC, pH 7,4) | Ajouter un volume approprié de DEPC au PBS, bien mélanger et incuber toute la nuit à température ambiante en remuant constamment. Autoclave pendant au moins 20 minutes. Stocker à 4° ; C | ||
| PBS (solution saline tamponnée au phosphate pH 7,4) | Sigma-Aldrich | P5368 | Préparer selon les instructions du fabricant |
| PBS+pi (PBS plus inhibiteurs de la protéase et de la phoshatase) | 10 mM de NaF, 1 mM de bêta-glycérol phosphate et 1 mM de Na3VO4 dans du PBS, pH 7,4. ; | ||
| PBT | 0,15 % TritonX et 0,5 % d’albumine sérique bovine dans PBS, pH 7,4 | ||
| Porte-broche | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Anticorps primaire : chèvre anti-GAPDH | Imgenex | IMG-3073 | Pour le western blot. Utilisé à 1:3000 |
| Anticorps primaire : lapin anti-clivé Dcp-1 | Signalisation cellulaire | 9578S | Pour l’immunofluorescence. Utilisé à 1:100 |
| Anticorps primaire : anti-DEcad de rat | Études de développement Banque d’hybridomes | DCAD2 | Pour l’immunofluorescence. Utilisé à 1:20 |
| Anticorps primaire : rat anti-DEcad | DOI : 10.1006/dbio.1994.1287 | DCAD1 | ; Don de Tadashi Uemura. Utilisé à 1:100. |
| Kit d’extraction d’ARN : Relia Prep Kit Miniprep pour les tissus d’ARN ; | Promega | Z6110 | |
| Réactif de décontamination à la RNASE (RNase Away) | Molecular BioProducts | 7002 | |
| Lames de scalpel | Outils de science fine | 10050 | Casser un petit morceau de lame de scapel et le fixer dans le porte-lame. |
| Anticorps secondaire : 488-conjugué à l’âne anti-rat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 712-545-153 | Pour l’immunofluorescence. Utilisé à 1:200 |
| Anticorps secondaire : chèvre conjuguée cy3 anti-lapin IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-165-144 | Pour l’immunofluorescence. Utilisé à 1:100 |
| Anticorps secondaire : IgG (H+L) de chèvre anti-rat conjugué à HRPtechnologie | de signalisation cellulaire | 7077 | Pour le western blot. Utilisé à 1:3000 |
| Anticorps secondaire : IgG (H+L) anti-chèvre de lapin conjugué à HRPjackJackson | ImmunoResearch | 305-035-003 | Pour le western blot. Utilisé à 1:3000 |
| Chlorure de sodium | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Fluorure de sodium | Sigma-Aldrich | 215309 | |
| Vanadate de sodium | Sigma-Aldrich | 50860 | |
| Spectrophotomètre (NanoDrop) | ThermoFisher Scientific | 2000c ; | |
| Microscope stéréo de dissection (M60 ou M80) | Leica Microsystems | ou microscope similaire | |
| Sylgard (noir) | Dow Corning | SYLG170 | |
| Sylgard (transparent) | Dow Corning | SYLG184 | Couleur noir avec poudre de charcol finement broyée |
| Tissu : Kimwipes | KIMTECH | 34120 | |
| TritonX | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Chlorhydrate de trizma pH 7,5 | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Aiguille en tungstène, fine | Fine Science Tools | 10130-10 | Insérer dans le porte-goupille |
| Aiguille en tungstène, robuste Fine | Science Tools | 10130-20 | Insérer dans le porte-goupille |
| WTLB (tampon de lyse des tissus occidentaux) | 150 mM de NaCl, 1,5 % de Triton X-100, 1 mM d’EDTA, 20 % de glycérol, 10 mM de NaF, 1 mM de bêta-glycérol phosphate et 1 mM de Na3VO4 dans 50 mM de Tris-HCl (pH 7,5). Compléter avec une table de cocktail à protéase complète par solution de 10 ml. | ||
| Pâte de levure | (supermarché local) | Environ 2 cuillères à soupe de levure Fleischmann’s ActiveDry (ou similaire) dissoute dans ~20 mL distillé H2O |
Références
- Cagan, R. L., Ready, D. F. The emergence of order in the Drosophila pupal retina. Developmental biology. 136 (2), 346-362 (1989).
- Wolff, T., Ready, D. The development of Drosophila melanogaster. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Plainview. 1277-1325 (1993).
- Carthew, R. W.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Réimpressions et autorisations
