Étudier le Stress oxydatif causé par les streptocoques de groupe Mitis chez Caenorhabditis elegans

Résumé

Le nématode Caenorhabditis elegans est un excellent modèle pour disséquer les interactions hôte-pathogène. Décrit ici est un protocole visant à infecter le ver avec des membres des mitis streptocoques et déterminer l’activation de la réponse au stress oxydatif contre H₂O₂ produites par ce groupe d’organismes.

Résumé

Caenorhabditis elegans (c. elegans), un nématode libre, est devenue un modèle attrayant pour étudier les interactions hôte-pathogène. Le protocole présenté utilise ce modèle pour déterminer le caractère pathogène causé par le streptocoque du groupe mitis via la production de H₂O₂. Les streptocoques de groupe mitis sont une menace émergente qui provoquent de nombreuses maladies humaines telles que bactériémie, endocardite et orbitaire. Décrit ici est un protocole pour déterminer la survie de ces vers en réponse à H₂O₂ produit par ce groupe d’agents pathogènes. Utilisant le skn-1 gène codant pour un facteur de transcription de réponse de stress oxydatif, on montre que ce modèle est important pour l’identification des gènes hôtes essentiels contre une infection à streptocoque. En outre, il est démontré que l’activation de la réponse au stress oxydatif peut être surveillée en présence de ces agents pathogènes en utilisant une souche de ver journaliste transgéniques, dans lequel SKN-1 est fusionnée à la protéine fluorescente verte (GFP). Ces tests fournissent l’occasion d’étudier la réponse au stress oxydatif H₂O₂ résultant d’une source biologique par opposition à un exogène ajouté réactives de l’oxygène (dro) sources.

Introduction

Streptocoques du groupe Mitis sont commensaux humaine de la cavité oropharyngée¹. Toutefois, ces organismes peuvent échapper à ce créneau et causer une variété de maladies invasives². Les infections provoquées par ces micro-organismes incluent une bactériémie, endocardite et orbitaire^2,3,4,5,6. En outre, ils font leur apparition des agents comme responsables de bactériémies à neutropéniques immunodéprimés et cancéreux qui ont subi une chimiothérapie^5,7,8,9 .

Les mécanismes sous-jacents pathogenèse de groupe mitis est obscur, parce que quelques-uns des facteurs de virulence ont été identifiés. Le groupe de la mitis est connu pour produire H₂O₂, qui a montré à jouer un rôle important dans les communautés microbiennes orale¹⁰. Plus récemment, plusieurs études ont mis en évidence un rôle pour H₂O₂ comme une cytotoxine qui induit des cellules épithéliales mort^11,12. Pneumonie de S., qui appartient à ce groupe, a été démontré pour produire des niveaux élevés de H₂O₂ qui induit des lésions de l’ADN et l’apoptose dans les cellules alvéolaires¹³. À l’aide d’un modèle animal de pneumonie aiguë, les mêmes chercheurs ont démontré que la production de H₂O₂ par les bactéries confère un avantage de virulence. Études sur la méningite à pneumocoques ont également montré que dérivé de pathogène H₂O₂ agit en synergie avec pneumolysin pour déclencher des cellules neuronales mort¹⁴. Ces observations établissent clairement que l’H₂O₂ produites par ce groupe de bactéries est important pour leur pouvoir pathogène.

Fait intéressant, il a également été démontré que les membres de la mitis du groupe S. mitis et s. oralis entraînent la mort de la nématode c. elegans , via la production de H₂O₂^15,16. Ce nématode libre a été utilisé comme un modèle simple, génétiquement tractable pour étudier de nombreux processus biologiques. Plus récemment, le ver est devenue un modèle pour l’étude de^17,des interactions hôte-pathogène¹⁸. En outre, plusieurs études ont souligné l’importance d’étudier le stress oxydatif, à l’aide de cet organisme^19,20,21. Son cycle de vie court, la capacité de knockdown gènes présentant un intérêt par Arni et l’utilisation de la protéine fluorescente verte (GFP)-fusible reporters pour contrôler l’expression des gènes sont quelques-uns des attributs qui en font un système modèle attrayant. Plus important encore, les voies qui régulent le stress oxydatif et l’immunité innée dans la vis sans fin sont hautement conservées avec mammifères^20,22.

Dans le présent protocole, on démontre comment utiliser le c. elegans pour élucider le pouvoir pathogène causé par le streptocoque dérivés H₂O₂. Un test de survie mis à jour l’apparaît, tandis que les membres du groupe mitis sont capables de tuer les vers rapidement via la production de H₂O₂. À l’aide des membres du groupe mitis, une source biologique durable des espèces réactives de l’oxygène (ROS) est fourni, par opposition aux sources chimiques qui provoquent le stress oxydatif dans les vers. En outre, les bactéries sont capables de coloniser les vers rapidement, ce qui permet pour H₂O₂ à cibler directement les cellules intestinales (par rapport à d’autres sources qui ont à franchir plusieurs obstacles). L’essai est validé soit 1) par détermination de la survie de la souche mutante skn-1 ou 2) en abattant de skn-1 à l’aide d’Arni en vers par rapport à la N2 sauvage et vector control traité vers. SKN-1 est un facteur de transcription importante qui régule la réponse de stress oxydatif chez c. elegans^23,24,25. En plus des essais de survie, une souche ver exprimant un journaliste transgénique SKN-1 b/C::GFP est utilisée pour contrôler l’activation de la stress oxydatif réponse via la production de H₂O₂ par le groupe de la mitis.

Protocole

1. préparation de tes plaques de gélose (extrait de levure de Todd-Hewitt)

1. Pour 1 L de médias, ajouter 30 g de poudre de Todd-Hewitt, 2 g d’extrait de levure et 20 g d’agar dans un Erlenmeyer de 2 L. Ajoute le contenu de la fiole de 970 mL d’eau désionisée et comprend un bar de remuer. Autoclave les médias à une température de 121 ° C et une pression de 15 lb/po² pendant 30 min. Par la suite, mettre les médias sur une plaque de remuer et le laisser pour refroidir en agitant doucement.
2. Versez les médias dans des plats de pétri stérile fluxsol (plats de 100 x 15 mm pour la croissance et le maintien des bactéries, mets 35 x 10 mm pour le meurtre de dosages) sous une hotte à flux laminaire. Autoriser les médias à sécher pendant 2 h sous la hotte laminaire. Par la suite, les plaques peuvent être stockés à 4 ° C pendant 1 mois.

2. préparation du milieu de croissance nématode (NGM) et Arni alimentation plaques (Arni NGM)

1. À l’aide d’une barre de remuer, dissoudre 2,5 g de peptone et 3 g de NaCl dans 970 mL d’eau désionisée dans une fiole d’Erlenmeyer de 2 L. Ajouter 20 g de gélose aux médias. Autoclave les médias à une température de 121 ° C et une pression de 15 lb/po² pour 30 min. mettre les médias sur une plaque de remuer et laisser pour le refroidissement en remuant doucement.
2. Ajouter les solutions suivantes aux médias pour la préparation des plaques NGM : 25 mL de tampon de phosphate de potassium 1 M (pH = 6,0), 1 mL de 1 M MgSO₄, 1 mL de 1 M CaCl₂, 1 mL de cholestérol (5 mg/mL dans l’éthanol à 95 %) , 1 mL de nystatine (10 % v/w dans l’éthanol) et 1 mL de 25 mg/mL de streptomycine.
3. Ajouter les solutions suivantes aux médias pour la préparation de l’ARNi NGM alimentation des plaques : 25 mL de tampon de phosphate de potassium 1 M (pH = 6,0), 1 mL de 1 M MgSO₄, 1 mL de 1 M CaCl₂, 1 mL de cholestérol (5 mg/mL dans l’éthanol à 95 %) , 1 mL de nystatine (10 % v/w dans l’éthanol), 1 mL de carbénicilline 50 mg/mL et 1 mL de IM IPTG.
4. Versez les médias dans 60 x 15 mm plats de pétri stérile sous hotte à flux laminaire. Autoriser les médias à sécher pendant 2 h sous la hotte laminaire. Par la suite, les plaques peuvent être stockés à 4 ° C pendant 1 mois.

3. entretien de c. elegans

1. Semences les plaques NGM de détachage 50 µL de nuit cultivées OP50 d’e. coli dans le centre des plaques. La culture d’e. coli est préparée auparavant en milieu Luria-Bertani (LB) et stockée à 4 ° C pendant plusieurs mois. Recouvrir les plaques et les laisser sécher pendant 24 heures sous une hotte laminaire et ensuite stocker les plaques en polystyrène contenant.
2. Sous un microscope à dissection, relever 10 à 12 adultes gravides à l’aide d’une pique de ver stérile et transférer les vers à un e. coli OP50 ensemencées plaque NGM. Incuber les plaques à 20 ° C jusqu’au lendemain.
3. Le lendemain, retirer les adultes à l’aide d’une pique de ver stérile et laisser les embryons à développer pour les larves de L4 à 20 ° C (~2.5 jours).

4. préparation de Population synchrone en âge de Worms

1. Laver les adultes gravides de deux à quatre plaques NGM utilisant M9W et à leur rassemblement dans un tube conique de 15 mL.
   1. Pour préparer le M9W : mélanger 3 g de NaCl, 6 g de Na₂HPO₄et 3 g de KH₂PO₄ et à dissoudre dans un volume final de 1 litre d’eau désionisée. Autoclave la solution et ajouter 1 mL de 1 M MgSO₄.
2. Faites tourner le tube à 450 x g pendant 1 min, puis décanter le liquide surnageant tout en veillant à ce que le culot de ver reste intact.
3. Ajouter 400 µL de 8,25 % d’hypochlorite de sodium (eau de Javel domestique) et 100 µL de 5 N NaOH pour préparer la solution de lyse ver. Ajouter la solution de lyse au culot ver et mélanger le contenu en effleurant le tube jusqu'à ce que 70 % vers adultes sont lysées. Périodiquement, observer le contenu du tube sous un microscope à dissection pour assurer il n’y a aucun surlessivage des oeufs.
4. Diluer le mélange d’eau de Javel en ajoutant 10 mL de M9W au contenu du tube conique.
5. Faites tourner le tube à 450 x g pendant 1 min. décanter surnageant, puis ajouter 10 mL de M9W.
6. Répétez l’étape 4.5 deux fois plus.
7. Resuspendre le culot de œuf qui en résulte dans 3 à 5 mL de M9W. Placer le tube sur un rotateur de tube. Laisser les tubes à tourner à une vitesse de 18 t/mn à température ambiante (RT) du jour au lendemain.
8. Le lendemain, faites tourner le tube à 450 x g pendant 1 min granuler les larves L1. Supprimer la plupart des M9W par aspiration, laissant derrière eux de ~ 250 µL de liquide dans le tube. Remettre en suspension les larves L1 et gouttes de lieu trois 5 µL de la suspension de ver sur un couvercle de boîte de pétri, puis l’estimation du nombre de vers par µL à l’aide d’un microscope à dissection.

5. l’induction de l’ARNi dans Worms

1. En utilisant une solution stérile de boucle ou pick, strie sur les souches désirés d’Arni contenant e. coli provenant des stocks congelés (bibliothèques Ahringer et Vidal) sur des plaques d’agar 100 x 15 mm LB contenant 50 µg/mL carbénicilline et 15 µg/mL de tétracycline. Incuber les plaques à 37 ° C pendant 24 h.
2. Choisissez et ensemencer une colonie isolée de la souche de RNAi désirée tubes coniques stérile de 15 mL, 2 ml de LB additionné de 50 carbénicilline µg/mL. Incuber les tubes à 37 ° C pendant 16 h dans un agitateur orbital à 150 tr/min.
3. Le lendemain, étaler 150 µL de nuit cultivée culture sur plaques alimentation de 65 mm x 15 mm NGM Arni à l’aide d’un épandeur stérile. Incuber les plaques à 37 ° C pendant 24 h.
4. Laisser les plaques refroidir jusqu'à RT après incubation à 37 ° C. Ajouter un volume approprié de M9W contenant des larves L1 ~ 200 (obtenus auprès de la population en âge de synchrone des étapes vers) pour les e. coli graines NGM Arni plaques d’alimentation. Incuber les plaques à 20 ° C jusqu'à ce que les larves atteignent le stade de L4 (~2.5 jours).

6. préparation des streptocoques du groupe Mitis pour Infection

1. -Ensemencer sur désiré souches de streptocoques sur le 100 mm x 15 mm ton agar (si les plaques étaient stockés à 4 ° C, préchauffer les plaques à 37 ° C avant les souches respectives des stries), puis incuber les plaques à 37 ° C pendant la nuit (~ 18 h) dans un pot de bougie fournissant un microaérophiles fr vironment pour la croissance des streptocoques (les géloses ensemencées peuvent être stockés pendant une semaine à 4 ° C).
2. Pour repropager les isolats cliniques de streptocoques, utilisez gélose trypticase soja au sang. Incuber les plaques à 37 ° C dans un pot de bougie toute la nuit (~ 18 h).
3. Le lendemain, enlever les plaques à partir du pot de bougie et prélever des colonies isolées à l’aide d’une anse stérile. Ensemencer le stériles tubes coniques 15 mL 2 mL de ton bouillon. Pour propager des isolats cliniques des streptocoques, compléter le THY bouillon avec 5 % v/v de sang de mouton. Fermer les bouchons étanches et incuber les tubes à 37 ° C dans des conditions statiques.

7. des analyses de survie

Remarque : Les étapes de ce test sont représentés dans la Figure 1. Pour démontrer que l’H₂O₂ dérivé de la mitis groupe est responsable du meurtre du ver, de compléter les médias avec la catalase ou la souche mutante ΔspxB et de complément souche ΔspxB ; spxB + de S. gordonii peut être utilisé. SpxB code pour une oxydase de pyruvate, qui est responsable de la production de H₂O₂ dans le groupe de la mitis.

1. 35 x 10 mm pour les préchauffer tes plaques à 37 ° C. Ajouter 80 µL de nuit cultures cultivées des souches de streptocoques désirés et transmettre la bactérie complètement à travers la surface de la gélose à l’aide d’un épandeur stérile. Incuber les plaques à 37 ° C dans un pot de bougie toute la nuit (~ 18 h). Comme contrôle, graine deux 35 mm x 10 mm NGM plaques 80 µl de nuit cultures cultivées d’e. coli OP50. Incuber les plaques à 37 ° C pendant la nuit.
2. Pour confirmer que la H₂O₂ produites par le groupe de la mitis est responsable de la mise à mort vers, ajouter 50 µL contenant 1 000 unités de catalase c sur la ta plaque. Répandre la solution de catalase, à l’aide d’un épandeur stérile et laisser les plaques sécher dans l’écoulement laminaire pour 30 min. semences les plaques par la suite avec les souches de streptococcus respectifs comme indiqué au point 7.1.
3. Le lendemain, retirer les plaques du pot bougie et permettent de choisir les plaques refroidir à RT pendant 10-15 min. à l’aide d’un ver stérile, transfert 30 larves de L4 de la NGM ou RNAi NGM alimentation des plaques le streptocoque graines tes plaques. Utilisez les deux graines tes plaques avec un total de 60 vers par la souche de streptocoques. Incuber les boîtes à 25 ° C.
4. À l’aide d’un microscope à dissection, compter le nombre de morts et vivants larves de L4 sur chaque plaque à plusieurs points. Au départ, marquer les vers comme morte ou vivre chaque 30 min. Par la suite, lorsque les vers commencent rapidement à mourir, leur score à intervalles de 15 min. Utiliser le prélèvement stérile ver doucement prod les vers et déterminer s’ils sont morts ou vivants. Un ver est considérée comme morte s’il n’y a aucun mouvement en réponse à l’insistance.
5. L’analyse prendra 5-6 h pour terminer. Répétez l’expérience deux fois plus. À l’issue du test, mettre en commun les données provenant des deux plaques. Entrez les données de chaque groupe, comparer les courbes de survie et effectuer l’analyse de survie de Kaplan-Meier à l’aide d’un logiciel de statistique.

8. préparation des coussinets de gel d’Agarose pour la microscopie

1. Dissoudre 2 % p/v d’agarose dans l’eau désionisée en chauffant la solution dans un four à micro-ondes. Un volume de 5 mL de solution est suffisant pour préparer 20 diapositives.
2. Bande de laboratoire tenir sur la longueur le long de deux lames de verre. Ceci déterminera l’épaisseur des plaquettes d’agarose. Placez une lame de verre propre entre les deux diapositives collées.
3. Place 100 µL d’agarose fondu sur le centre de la lame propre. Placer immédiatement un autre verre propre sur le dessus de l’agarose fondu et appuyer doucement pour faire un coussin. Permettre l’agarose à solidifier et à retirer par la suite la glissière supérieure. Le coussin de gel d’agarose est prêt à l’emploi.

9. l’observation de la localisation de SKN-1 en réponse à l’Infection à streptocoque

Remarque : Les étapes de ce test sont représentés dans la Figure 2. Localisation de SKN-1 a été déterminée à l’aide de la souche de ver transgéniques SKN-1 b/C::GFP. Pour démontrer la localisation de SKN-1 en raison de la production de H₂O₂ par le groupe de la mitis, sauvage (WT), ΔspxB et le complément souche ΔspxB ; spxB + de S. gordonii ont été utilisés. Par ailleurs, le journaliste transgéniques souche SKN-1 b/C::GFP et la technique d’interférence d’Arni ont servi à démontrer que les composantes de la voie MAPK p38 réglementent la localisation de SKN-1.

1. 35 x 10 mm pour les préchauffer tes plaques à 37 ° C. Ajouter 80 µL de nuit cultures cultivées des souches de streptocoques désirés et transmettre la bactérie complètement à travers la surface de la gélose à l’aide d’un épandeur stérile. Incuber les plaques à 37 ° C dans un pot de bougie toute la nuit (~ 18 h). Comme contrôle, graines trois 35 x 10 mm NGM plaques 80 µl de nuit cultures cultivées d’e. coli OP50. Ces incuber à 37 ° C pendant environ 18 h.
2. Le lendemain, enlever les plaques à partir du pot de bougie et laisser les plaques refroidir à RT pendant 10-15 min. L4 lavage larves à l’aide de M9W de NGM et Arni NGM alimentation. Recueillir les vers dans les tubes coniques 15 mL.
3. Faites tourner les tubes à 450 x g pendant 1 min. décanter le liquide surnageant et ajouter 10 mL de M9W.
4. Répétez l’étape 9.3 trois fois plus.
5. Remettre en suspension les vers en ~ 250 µL de M9W et place gouttes trois 5 µL de la suspension de ver sur un couvercle de boîte de pétri propre et estimer le nombre de vers par µL à l’aide d’un microscope à dissection.
6. Ajouter 100 ~ L4 larves à chacun ton streptococcus épépiné et plaques NGM e. coli graines. Utiliser trois plaques par la souche de la bactérie. Incuber les boîtes pendant 2 à 3 h à 25 ° C.
7. Par la suite, enlever les plaques de l’incubateur, lavez-les avec M9W et recueillir les vers dans les tubes coniques 15 mL.
8. Laver les vers 3 x tel que décrit dans les étapes 9.3.
9. Enlever la plupart de la M9W par aspiration et ajouter 500 µL de M9W contenant 2 mM sodium azide ou 2 mM tétramisole chlorhydrate au culot ver. Cela va anesthésier les vers, en veillant à ce qu’aucun mouvement ne lorsqu’imagée sous le microscope.
   Mise en garde : Utiliser l’équipement de protection individuelle (EPI) lors de la manipulation de l’azide de sodium. Préparer la solution d’azoture sous une hotte chimique.
10. Incuber les pellets ver à ta pendant 15 min. Ensuite, repérez les 15 µL de la suspension de ver sur un bloc de prêts d’agarose. Placez délicatement un lamelle couvre-objet no 1.5 sur le pad d’agarose contenant les vers anesthésiés.
11. À l’aide d’un microscope à fluorescence, visualiser la localisation de l’utilisation de SKN-1 filtre FITC et DAPI. Image vers à 10 x et 20 x grossissements.
12. Marquer les vers selon le niveau de la localisation de SKN-1. Aucune localisation nucléaire, localisation de SKN-1 b/C::GFP dans l’antérieur ou postérieur du ver et localisation nucléaire de SKN-1 b/C::GFP dans toutes les cellules intestinales ne sont classés comme faible, moyen et des niveaux élevés de localisation, respectivement.
13. Après avoir marqué la microscopie fluorescente, déterminer les différences statistiques par chi-squared et tests exacts de Fisher, à l’aide d’un logiciel de statistique.

Résultats

De la mitis, les membres du groupe S. mitis, S. oralis et S. gordonii rapidement tué les vers, par opposition à S. mutans, S. salivarius et non pathogène e. coli OP50 (Figure 3A). La médiane de survie pour S. mitis, S. oralis et S. gordonii était de 300 min 300 min et 345 min, respectivement. Pour déterminer si le meurtre a été véhiculé par H₂O₂

Discussion

Les méthodes décrites peuvent être utilisés pour d’autres bactéries pathogènes telles que Enterococcus faecium, qui produit aussi H₂O₂ cultivés en anaérobie ou²⁶des conditions microaérophiles. En général, pour les plus pathogènes, il faut plusieurs jours à semaines pour réaliser les essais de survie. Toutefois, en raison de la production robuste de H₂O₂ par les membres du groupe mitis, ces épreuves pourraient être complétées dans les 5-6 h, dans...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
forts et produits chimiques
;	Sigma Aldrich	A9539-50G
Bacto peptone  ;	Fisher Scientific	DF0118-17-0
BD Bacto Bouillon Todd Hewitt	Fisher Scientific	DF0492-17-6
BD BBL Sang de mouton, défibriné  ;   ;	Fisher Scientific	B11947
BD Difco Agar  ;	Fisher Scientific	DF0145-17-0
BD Difco LB Bouillon	Fisher Scientific	DF0446-17-3
Gélose au sang (TSA avec sang de mouton)	Fisher Scientific	R01200
Chlorure de calcium	Fisher Scientific	BP510-500
Carbenicilline	Fisher Scientific	BP26481
Catalase  ;	Sigma Aldrich	C1345-1G
Cholestérol	Fisher Scientific	ICN10138201
IPTG	Fisher Scientific	MP21021012 Sulfate de
magnésium	Fisher Scientific	BP213-1
Nystatine	Acros organics	AC455500050
Phosphate de potassium Dibasic	Fisher Scientific	BP363-500
Phosphate de potassium monobasique	Fisher Scientific	BP362-500
Azoture de sodium	Sigma Aldrich	S2002-25G
Chlorure de sodium  ;	Fisher Scientific	BP358-1
Hydroxyde de sodium	Fisher Scientific	SS266-1
8,25 % Hypochlorite
de sodium Phosphate de sodium dibasique	Fisher Scientific	BP332-500
Sulfate de streptomycine  ;	Fisher Scientific	BP910-50
Tétracycline	Sigma Aldrich	87128-25G
(&minus ;)-Chlorhydrate de tétramisole	Sigma Aldrich	L9756
Extrait de levure	Fisher Scientific	BP1422-500  ;
puissants" nbsp ;
15 mL Tubes à centrifuger coniques stériles en polypropylène  ;	Fisher Scientific	12-565-269
Pipettes sérologiques jetables en polystyrène 10 mL	Fisher Scientific	07-200-574
Pipettes sérologiques jetables en polystyrène 25 mL	Fisher Scientific	07-200-575
Boîtes de Pétri bactériologiques Falcon avec couvercle (35 mm x 10 mm)	Fisher Scientific	08-757-100A
n° 1,5 x 18 mm Couvercle Boîtes	Fisher Scientific	12-541A
avec couvercle transparent (60 mm x 15 mm)	FB0875713A		Fisher Scientific
avec couvercle transparent (100 mm x 15 mm)	Lames	en verre ordinaire Fisher Scientific FB0875712
(75 mm x 25 mm)	Fisher Scientific	12-544-4
strong  ;
Prism	Graphpad
Bacterial Strains
S. oralis ATCC 35037
S. mitis ATCC 49456
S. gordonii DL1 Challis  ;   ;
E. coli OP50
E. coli HT115
Worm Strains
Strain	Genotype	Transgene	Source
N2		sauvage de C. elegans	CGC
EU1	skn-1(zu67) IV/nT1 [unc- ?( n754) let- ?] (IV ; V)		CGC
LD002	IdIs1	SKN-1B/C ::GFP + rol-6(su1006)	Keith Blackwell