Étudier les effets normaux du rayonnement tissulaire à l'aide d'hydrogels de matrice extracellulaire

Summary

Ce protocole présente une méthode pour la décellularisation et la formation suivante d'hydrogel des garnitures de graisse mammaire murine suivant l'irradiation ex vivo.

Abstract

La radiothérapie est une thérapie pour les patients atteints d'un cancer du sein triple négatif. L'effet du rayonnement sur la matrice extracellulaire (ECM) du tissu sain de sein et son rôle dans la répétition locale au site primaire de tumeur sont inconnus. Ici nous présentons une méthode pour la décellularisation, la lyophilisation, et la fabrication des hydrogels d'ECM dérivés des garnitures de graisse mammaire murine. Les résultats sont présentés sur l'efficacité du processus de décellularisation, et des paramètres rhéologiques ont été évalués. Les cellules de cancer du sein GFP- et luciferase-étiquetées encapsulées dans les hydrogels ont démontré une augmentation de la prolifération des hydrogels irradiés. Enfin, la coloration conjuguée de phalloidin a été employée pour visualiser l'organisation de cytosquelette des cellules encapsulées de tumeur. Notre objectif est de présenter une méthode de fabrication d'hydrogels pour l'étude in vitro qui imitent l'environnement in vivo des tissus mammaires et sa réponse au rayonnement afin d'étudier le comportement des cellules tumorales.

Introduction

Le cancer se caractérise par une prolifération excessive de cellules qui peuvent échapper à l'apoptose et métastasent également des sites éloignés¹. Le cancer du sein est l'une des formes les plus courantes chez les femmes aux États-Unis, avec environ 266 000 nouveaux cas et 40 000 décès en 2018². Un sous-type particulièrement agressif et difficile à traiter est le cancer du sein triple négatif (TNBC), qui manque de récepteur d'oestrogène (ER), de récepteur de progestérone (PR), et de facteur de croissance épidermique humain (HER2). La radiothérapie est couramment utilisée dans le cancer du sein pour éliminer les cellule....

Protocol

Les études sur les animaux ont été réalisées conformément aux lignes directrices et protocoles institutionnels approuvés par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux de l'Université Vanderbilt.

1. Préparation et irradiation ex vivo des MFP

1. Sacrifier les souris nu/Nu athymiques (8 à 10 semaines) en utilisant l'asphyxie au CO₂ suivie d'une luxation cervicale.
2. Nettoyer la peau à l'aide de 70 % d'éthanol.
3. Recueillir des coussinets de graisse mammaire (MPF) à l'aide de souris sacrifiées à l'aide de ciseaux et de forceps pré-stérilisés dans un tube conique de 15 ml contenant des milie....

Results

Les MFP ont été décellularisés à la suite de l'irradiation à l'aide de la procédure indiquée à la figure 1A. Les MPF pré-décellularisation (figure 1B) et post-décellularisation (figure 1C) sont montrés. La décellularisation a été confirmée à l'aide de l'hématoxylin et de l'éosine (H et E) tainingent, et 1-[4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol coloration a été utilisé pour évaluer la teneur en lipides (Figure 2). Les propriét.......

Discussion

Cette méthode de formation d'hydrogel dépend en grande partie de la quantité de tissu de départ. Les MPF murines sont petits, et le processus de décellularisation entraîne une réduction significative du matériel (tableau 1). Le processus peut être répété avec plus de MFP pour augmenter le rendement final. Le fraisage est une autre étape importante qui peut entraîner la perte de matériel. D'autres ont montré le succès avec un moulin cryogénique, mais ce protocole est basé sur le fraisage par l'intermédiai.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Formol tamponné neutre à 10 %, cube avec embout	VWR	16004-128-2-méthylbutane
	Alfa Aesar	19387-AR
2000ex Rhéomètre	TA Instruments	10D4335	rhéomètre
Albumine sérique bovine Sigma-Aldrich		A1933-25G-acécéine
acétoxyméthyle (calcéine AM)	Molecular Probes, Inc.	C1430-D-Luciferin
Lucifly, sel de potassium	Biosynth Chimie & Biologie	L-8820	(S)-4,5-Dihydro-2-(6-hydroxy-2-benzothiazolyl)-4-thiazolecarboxylique sel de potassium
DPX Mountant for Histology	Sigma-Aldrich	06522-500ML-Solution
saline tamponnée au phosphate de Dulbecco	Gibco	14040133-Eosin-Y
avec phloxine	Richard-Allan Scientific	71304	eosine
ethidium homodimère	Sondes moléculaires, Inc.	E1169	ethidium homodimère-1 (EthD-1)
Sérum de bovin fœtal	Sigma-Aldrich	F0926-500ML-Fisher
Healthcare Tissue-Plus O.C.T. Compound	Fisher Scientific	23-730-571	Milieu d’enrobage cryostat
Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-01	milieu d’enrobage aqueux
FreeZone 4.5	Labconco	7751020	lyophilisateur
Hoechst 33342 Solution (20 mM)	Thermo Scientific	62249	colorant fluorescent bleu
Acide chlorhydrique	Sigma-Aldrich	258148-500ML-IVIS
Lumina III	PerkinElmer	CLS136334	système d’imagerie par bioluminescence
Kimtech Science Kimwipes	Kimberly Clark		lingettes
délicatesn-Propanol (sans peroxyde/séquençage), Fisher BioReagents	Fisher Scientific	BP1130-500-Oil
Red O	Sigma-Aldrich	O0625-25G	1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphtol
OPS Diagnostics CryoGrinder	OPS Diagnostics, LLC	CG-08-02-PBS
(10X), pH 7.4	Quality Biological, Inc.	119-069-151	Solution saline tamponnée au phosphate
Pénicilline-Streptomycine	Gibco	15140-122-Pepsine
de muqueuse gastrique porcine	Sigma-Aldrich	P6887-5G	Pepsine
Acide peracétique	Sigma-Aldrich	77240-100ML-Réactif
Phalloidin-iFluor 594 (ab176757)	abcam	ab176757	Conjugué
de la phalloïdinePropylène glycol	Sigma-Aldrich	W294004-1KG-K-Richard-Allan
Scientific Signature Series Réactif de bleuissement	Richard-Allan Scientific	7301L	Agent bleuissant
Richard-Allan Scientific Signature Series Hématoxyline 7211	Richard-Allan Scientific	7211-RPMI
Medium 1640	Gibco	11875-093-Désoxycholate
de sodium, 98 %	Frontier Scientific	JK559522	acide désoxycholique
Saccharose	Sigma-Aldrich	S5016-Triton
x-100	Sigma-Aldrich	X100-100ML	em>t-Octylphénoxypolyéthoxyéthanol
Trypsine-EDTA (0,25 %), rouge de phénol	Gibco	25200-056-Whatman
papier filtre qualitatif, Grade 4	Whatman	1004-110	Papier filtre qualitatif de grade 4
Xylènes (certifié ACS), Fisher Chemical	Fisher Scientific	X5-4	-