Post-différenciation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation

Summary

Ce protocole décrit une procédure détaillée pour resuspendre et cultiver les neurones dérivés de cellules souches humaines qui étaient précédemment différenciés des progéniteurs neuronaux in vitro pendant plusieurs semaines. La procédure facilite les essais basés sur l'imagerie des neurites, des synapses et des marqueurs neuronaux à expression tardive dans un format compatible avec la microscopie légère et le dépistage à haute teneur.

Abstract

Les neurones différenciés en deux dimensions de cellules progénitrices neurales (PNJ) dérivées de cellules souches humaines représentent un système modèle puissant pour explorer les mécanismes de la maladie et effectuer un dépistage à haute teneur (HCS) pour interroger le composé bibliothèques ou identifier les phénotypes de mutation génétique. Cependant, avec les cellules humaines, la transition du PNJ au neurone fonctionnel et mature nécessite plusieurs semaines. Les synapses commencent généralement à se former après 3 semaines de différenciation dans la culture monocouche, et plusieurs protéines spécifiques aux neurones, par exemple le marqueur pan-neuronal exprimant plus tard NeuN, ou la couche 5/6 cérébrale marqueur de neurone cortical CTIP2, commencent à exprimer environ 4-5 semaines après la différiliation. Ce temps de différenciation prolongé peut être incompatible avec les conditions de culture optimales utilisées pour les plates-formes HCS à petit volume et multi-puits. Parmi les nombreux défis, il y a la nécessité de cellules bien respectées et distribuées uniformément avec un amas cellulaire minimal, et des procédures de culture qui favorisent la viabilité à long terme et la maturation des synapses fonctionnelles. Une approche consiste à différencier les neurones dans un format grand volume, puis les replaquer à un moment ultérieur dans hCS compatible multi-puits. Certains défis majeurs lors de l'utilisation de cette approche de replaquage concernent la reproductibilité et la viabilité cellulaire, en raison de la perturbation stressante du réseau dendritique et axonal. Ici nous démontrons une procédure détaillée et fiable pour enzymatiquement resuspendre les neurones de cellules souches pluripotentes induites par l'homme (hiPSC) après leur différenciation pendant 4-8 semaines dans un format de grand volume, les transférant au microtiter de 384 puits plaques, et les cultiver pendant 1-3 semaines supplémentaires avec une excellente survie cellulaire. Ce replaquage des neurones humains permet non seulement l'étude de l'assemblage et de la maturation de synapse dans les deux semaines suivant le replaquage, mais permet également des études des caractéristiques de la régénération de neurite et du cône de croissance. Nous fournissons des exemples d'essais évolutifs pour la néuritogénèse et la synaptogénèse à l'aide d'une plate-forme de 384 puits.

Introduction

Les neurones dérivés des cellules souches pluripotentes humaines (hiPSC) sont de plus en plus pertinents dans les domaines de la recherche fondamentale, du développement de médicaments et de la médecine régénérative. Les workflows et les procédures pour optimiser leur culture et leur entretien, et améliorer l'efficacité de la différenciation en sous-types neuronaux spécifiques, évoluent rapidement^1,2. Afin d'améliorer l'utilité et la rentabilité des neurones dérivés des cellules souches humaines en tant que systèmes modèles propices à des analyses à haute teneur en matière de découverte de médicaments et de validation de cibles, il est utile de réduire le temps de culture requis pour générer des neurones, tout en conservant la robustesse maximale, la reproductibilité, et la pertinence de phénotype. Bien que les cultures organoïdes tridimensionnelles soient à l'origine de percées dans la recherche sur le neurodéveloppement³, les cultures monocouches bidimensionnelles sont particulièrement compatibles avec les applications automatisées basées sur l'imagerie en raison de leur épaisseur minimale des tissus.

Cependant, l'adaptation des méthodes de dépistage basées sur l'imagerie aux modèles de maladies neurologiques et neurodéveloppementales humaines fait face à un défi majeur. Le délai prolongé sur lequel le système nerveux humain mûrit in vivo nécessite un temps prolongé dans la culture pour accueillir les programmes naturels d'expression génique et atteindre la maturation neuronale.

Une conséquence pratique du long programme de différenciation neuronale est que le maintien des cultures de monocouches dérivées de hiPSC doit être soutenu pendant de nombreuses semaines pour atteindre la maturité synapse adéquate. Pendant ce temps, les progéniteurs neuronaux qui restent indifférenciés continuent de se diviser. Ceux-ci peuvent rapidement dépasser la culture et usurper la teneur en nutriments nécessaires pour maintenir des neurones postmitotiques viables. La division vigoureuse des cellules progénitrices neurales (PNJ) peut également rivaliser avec les neurones pour le substrat de croissance. Cela peut rendre ces cultures sujettes à des problèmes de mauvaise adhérence, une condition impropre aux essais basés sur l'imagerie. En outre, beaucoup d'investigateurs constatent que plus le volume de culture est petit, plus la difficulté à maintenir des populations saines de neurones différenciés assez longtemps pour observer les derniers stades de la différenciation neuronale est grande. En d'autres termes, les essais de maturation des synapses à l'aide d'approches de dépistage à haute teneur (HCS) peuvent être très difficiles pour les neurones d'origine humaine.

Pour contourner certains de ces problèmes, une procédure de re-suspension et de replaquage des neurones dérivés de hiPSC précédemment différenciés a été utilisée. Tout d'abord, il permet l'étude de la croissance neurite (ou, plus exactement, la régénération neurite) dans une population de neurones pleinement engagés. Deuxièmement, le replaquage de neurones précédemment différenciés d'un format de grand volume (comme des plaques de 10 cm ou plus), jusqu'à de petits formats de volume (comme les plaques de microtiter 96 ou 384 puits compatibles Avec le HCS) permet une réduction significative du temps total de culture dans l'état du petit volume. Ceci facilite l'étude de l'assemblage et de la maturation de synapse au cours des semaines suivantes in vitro.

Cependant, le replaquage des neurones matures qui ont déjà établi de longues neurites et un réseau de connectivité complexe présente plusieurs défis, dont l'un est le taux parfois élevé et variable de la mort cellulaire. Ici, nous décrivons une procédure de replating qui a comme conséquence la survie et la reproductibilité excellentes de cellules. Généralement, les neurones sont exposés à des enzymes protéolytiques pendant de courtes périodes d'incubation (généralement de 3 à 10 minutes) afin de détacher les cellules du substrat avant la trituration. Ce bref temps de protéolyse est habituellement utilisé pour resuspendre et transmettre de nombreux types de cellules de division, y compris les cellules non neuronales et les progéniteurs indifférenciés^4,5,6. Cependant, pour les neurones différenciés portant de longues néurites interconnectées, il est essentiel non seulement de détacher les cellules du substrat, mais aussi de perturber le réseau dendritique et axonal afin d'isoler les cellules individuelles tout en minimisant les dommages. En effet, un maillage épais de neurones tend généralement à se détacher du substrat comme une seule feuille, plutôt que comme des cellules individuelles. Si l'on ne fait pas attention à desserrer l'épais réseau de neurites, les neurones deviennent non seulement irrémédiablement endommagés pendant la trituration, mais beaucoup d'entre eux ne parviennent pas à passer à travers le filtre utilisé pour enlever les amas, ce qui entraîne un faible rendement cellulaire. Ci-dessous nous décrivons une modification simple à une procédure d'incubation de protéase largement utilisée pour contrer ces difficultés.

Dans le protocole décrit ci-dessous, les neurones sont incubés pendant 40-45 min avec une protéase douce, comme l'enzyme protéolytique (par exemple, Accutase). Pendant les 5-10 premières min après l'ajout de l'enzyme, le réseau neuronal se soulève du substrat comme une feuille. L'incubation avec la protéase se poursuit pendant 30-40 minutes supplémentaires avant de procéder à une trituration douce et au filtrage. Ce temps d'incubation supplémentaire permet de s'assurer que la digestion du matériau détend le réseau intercellulaire, assurant ainsi que la trituration ultérieure produit une suspension des cellules individuelles. Cette procédure maximise l'uniformité de la distribution cellulaire lors du replaquage tout en minimisant la mort cellulaire. Nous avons appliqué avec succès cette méthode de replaquage aux cultures neuronales hiPSC-dérivées générées par divers protocoles de différenciation^7,8 et de diverses lignes de hiPSCs. La procédure est nominalement appropriée pour une utilisation avec la plupart ou toutes les lignes de neurones dérivés de cellules souches. Nous avons observé qu'un temps d'incubation prolongé du protéase n'est pas absolument essentiel pour replaquer les cultures à partir de plaques de petit format (p. ex., 35 mm de diamètre); cependant, comme nous le montrons ici, il offre un avantage significatif lors du replatage des plaques de grand diamètre (par exemple, 10 cm de diamètre ou plus), probablement parce que les neurites dans ces plaques peuvent prolonger les processus très longs et former un tableau densément interconnecté.

Ici, nous démontrons cette méthode et illustrent brièvement son application dans les essais pour la néuritogénèse précoce et pour la maturation de synapse, qui implique le regroupement des protéines pré- et postsynaptic le long des dendrites et des axones, suivis par leurs plus tard colocalisation sur les sites synaptiques. Les exemples mettent en évidence les avantages que ce protocole offre dans la préservation de la viabilité et de la reproductibilité cellulaires. Tout d'abord, il permet aux chercheurs d'étudier les premières étapes de la néuritogénèse humaine. Le cadre expérimental est similaire aux cultures primaires couramment utilisées des neurones corticaux ou hippocampiques de rongeurs, où les cellules sont extraites du cerveau foetal tardif ou postnatal précoce, dissociées par trituration après le traitement doux de protéase, et ont permis de initier des neurites ou régénérer les névrites qui ont été sectionnées dans la procédure^9,10. Semblable à ces neurones primaires de rongeur, les neurones hiPSC-dérivés commencent à former ou régénérer leurs neurites dans les heures suivant le replaquage, permettant l'imagerie des cônes de croissance et de la morphologie neurite dans un environnement optimal pour l'imagerie spatiotemporal élevée avec moins de cellules indifférenciées. Nous avons observé que la croissance neurite est plus synchronisée par rapport aux retards variables et aux différents taux de croissance observés lorsque les neurones commencent à se différencier d'une population progénitrice. En outre, le replaquage permet d'évaluer les neurones exprimant des marqueurs de sous-type neuronaux qui apparaissent généralement plus tard dans le développement neuronal, tels que la couche corticale 5/6 facteur de transcription CTIP2 (Chicken ovalbumin upstream promoter transcription protéine d'interaction de facteur 2), ou le marqueur pan-neuronal NeuN^11. Une caractéristique particulièrement utile de l'approche de replaquage est que la synaptogénèse se déroule dans un délai compatible avec HCS.

Protocol

1. Période de différenciation avant le replaquage

1. Différencier les neurones sur les plats de 10 cm, en utilisant un protocole de choix^7,8 jusqu'à ce que les neurones ont formé un réseau épais avec leurs processus et d'exprimer non seulement les premiers marqueurs neuronaux tels que MAP2 ou TuJ1, mais aussi des marqueurs tardifs tels que NeuN.
2. Changez la moitié du milieu de choix tous les 4 jours pendant le processus de différenciation neuronale.
   REMARQUE : Des changements moyens plus étendus ou plus fréquents diluent les facteurs trophiques essentiels, et pourraient défavoriser la maturation.
   1. Pour les neurones WT126 dérivés d'iPSC, utiliser les supports de culture post-différenciation suivants : 5 mL 100x N2 supplément, 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL GDNF, 1 lamininine g/mL, 200 'M acide ascorbique, 1 'M dibutyryl-cAMP et 10 mL SM1 pour 500 mL Dulbecco's Eagle's mélange d'éléments nutritifs F-12 (DMEM/F12). Peu à peu, en utilisant des changements semi-médias, remplacer par le milieu basal neural (Tableau des matériaux) et les mêmes suppléments.
   2. Pour les neurones VB WT dérivés de l'iPSC, utilisez le milieu de culture post-différenciation suivant : 500 ml de milieu basal neural (Table of Materials) et 500 mL DMEM/F12 avec 2 'g/mL laminin, 10 mL de supplément de glutamine ( Tableau desmatériaux), 0,75 mg/mL de bicarbonate de sodium, 5 mL d'acides aminés non essentiels,5 mL, 0,2 mM d'acide ascorbique, 10 ng/mL de BDNF, 20 mL 50x B27 et 10 mL de supplément N2 100x.

2. Enduit multipuits

1. La veille du replatage, enrober de poly-L-ornithine (PLO). Dissoudre l'OLP dans de l'eau stérile pour faire une solution de stock (10 mg/mL). Entreposez ce stock à -20 oC. Diluer l'OLP 1:100 dans l'eau pour produire une concentration de 50 g/mL lors de l'enrobage du verre et du ratio 1:1 000 (10 g/mL) lors de l'enrobage du plastique.
2. Appliquer le revêtement directement sur les plaques cibles. Utiliser le volume de revêtement approprié à la taille de la plaque (c.-à-d. pour une plaque de 24 puits appliquer 500 L de solution PLO par puits).
3. Laisser les assiettes reposer dans l'obscurité toute la nuit à température ambiante.
4. Récupérer les plaques enduites le jour du replaqué et les transférer dans une armoire de biosécurité stérile.
5. Aspirez la solution PLO et rincez deux fois à l'eau stérile.
6. Diluer lalaminin (1.15 mg/mL) dans la saline phosphate-tamponnée (PBS) à 1:400 dilution.
   REMARQUE: Décongeler la laminine à 4 oC et ajouter rapidement au PBS pour éviter l'agrégation de lalaminine et de revêtement inégal.
7. Aspirez l'eau stérile et appliquez 500 l de revêtement de laminin sur des puits préalablement recouverts d'OLP.
8. Placer les assiettes dans un incubateur de 37 oC pendant au moins 4 à 6 h. Utiliser des incubations plus longues, jusqu'à 16 h, pour les surfaces vitrées. Utilisez des temps d'incubation constants.

3. Replating Neurones différenciés

1. Rincer la plaque des neurones différenciés avec PBS une fois doucement. Dispersez le PBS doucement le long de la paroi de la plaque, et non pas directement sur les cellules, pour éviter de les perturber.
2. Aspirez doucement PBS, en prenant soin d'éviter de toucher les cellules directement, mais d'aspirer du bord du plat tout en le faisant basculer vers le chercheur.
3. Appliquer au minimum 1 ml de l'enzyme protéolytique (tableaudes matériaux) par plaque de 10 cm et retourner les cellules à l'incubateur. Ajoutez des volumes légèrement plus élevés si la salle de culture tissulaire présente un taux d'évaporation élevé en raison d'une faible humidité.
4. Incuber les cellules avec l'enzyme protéolytique pendant 40-45 min afin de les détacher de la plaque et de les détacher des autres neurones dans le réseau neuronal.
   REMARQUE: Le moment à cette étape est crucial. L'étanchéité de la protéase trop tôt peut entraîner une augmentation de la mort cellulaire après le replaquage. Le fabricant d'enzymes protéolytiques recommande que des températures bien inférieures à 37 oC soient utilisées avec des périodes d'incubation plus longues pour le passage des lignées cellulaires (p. ex., pendant la nuit à 4 oC). Cependant, la manipulation des neurones à 4 oC devrait être évitée, car ils montrent souvent une faible survie après une exposition au froid. Le fabricant affirme également qu'une incubation de 60 min avec l'enzyme à 37 oC conduit à son inactivation enzymatique. Cependant, dans l'expérience des auteurs, une incubation de 40-45 min de cultures neuronales dérivées de hiPSC à 37 oC est suffisante pour une dissociation efficace et une excellente survie neuronale lors du replatage.
5. Vérifier les neurones sur un microscope à contraste de phase pendant le temps d'incubation et permettre au traitement de la protéase de continuer jusqu'à ce que le réseau neuronal se détache complètement de la plaque et commence à se briser en petites feuilles en secouant brièvement la plaque sous le microscope.
6. Désinguer l'activité de protéase en utilisant 5 ml de média DMEM frais par 1 ml de protéase dans la plaque de 10 cm pour arrêter la digestion. Triturate doucement les cellules contre la plaque 5-8 fois pour perturber le réseau, à l'aide de pipettes sérologiques. Veillez à ne pas appliquer trop de pression lors du triturating, car les neurones différenciés sont fragiles. N'utilisez pas une pointe P1000, car la fin est trop nette et étroite, et peut donc pure ou endommager les neurones.
7. Appliquer la solution avec des cellules à travers une passoire cellulaire avec un maillage de 100 m de diamètre dans un tube conique frais de 50 ml goutte par goutte.
8. Rincer la passoire avec 5 ml supplémentaires de supports DMEM frais, après que les cellules ont filtré à travers.
9. Faire tourner les cellules dans la centrifugeuse de banc à 1 000 x g pendant 5 min.
10. Retournez le tube conique dans l'armoire de biosécurité et aspirez la plupart des supports, en laissant environ 250 L pour s'assurer que les cellules retiennent l'humidité.
11. Resuspendre délicatement les cellules dans 2 ml de média DMEM frais. Ne pas pipette la boulette contre le côté du tube. Au lieu de cela, inverser doucement conique 2-3 fois et passer les cellules à travers la fin d'un tuyaut sérologique de 5 ml pour les déloger.
12. Appliquer 10 l de neurones en suspension sur le bord d'un hémocytomètre.
13. Ajouter 8-10 l de trypan bleu à gouttelettede de cellules pour évaluer la viabilité cellulaire au cours de cette étape de suspension. Appliquer 10 ll de ce mélange sur l'hémocytomètre ou d'autres compteurs cellulaires automatiques. Évaluer comme viable les cellules qui sont phase lumineux et exclure le colorant bleu trypan.
14. Déterminer la quantité de cellules viables/mL, et se préparer à diluer le contenu du tube conique en fonction de la densité cellulaire désirée.
15. Plaque de 10 000 cellules par puits pour une plaque de 384 puits; plaque de 150 000 à 200 000 cellules par puits pour une plaque de 24 puits.
16. Ajouter du DMEM frais au tube conique des cellules suspendues pour obtenir une dilution appropriée et ajouter des suppléments appropriés supplémentaires tels que B27 et/ou BDNF, selon les exigences de la lignée cellulaire spécifique.
17. Inclinez doucement le tube conique pour mélanger 2-3 fois.
18. Aspirez le revêtement de lamininin de la plaque de 24 puits, ou de la plaque multipuits de 384 puits à l'aide d'une tuyauterie de 16 canaux et rincez une fois avec PBS.
19. Aspirez PBS à l'aide d'un P1000 pour la plaque de 24 puits, ou de la pipette à 16 canaux pour les plaques de 384 puits.
20. Appliquer la solution cellulaire à chaque puits dans un mouvement de figure huit pour éviter l'agglutination. L'uniformité du placage peut également être optimisée à l'aide de dispositifs automatisés de manipulation liquide.
    REMARQUE: L'ajout de lamininine aux médias à partir de 2-4 jours après le replaquage contribue également à maintenir une distribution homogène des cellules.
21. Répétez les étapes 3.19 et 3.20 pour chaque puits.
22. Remettre la plaque dans l'incubateur fixé à37 oC et 5 % de CO 2.
23. Après 2 jours, commencez à changer la moitié du médium tous les 4 jours à l'aide des supports de culture post-différenciation décrits à la section 1.2. Après le temps de maturation souhaité, fixer les cultures en utilisant 3,7% de formaldéhyde à 37 oC et les cellules de tache selon les exigences expérimentales.

4. Tests de viabilité cellulaire post-replaquage

1. Ajoutez le reporter de mort cellulaire précoce (VivaFix : 0,5 L de la solution de stock de 50 L par 500 'L de culture par puits) après avoir brièvement vortexé la solution de stock.
2. Imagedes vivantes et mortes cultivées sur des multipuits à fond de verre, après 20 min, sans aucune étape de lavage, puisque le colorant ne fluore qu'une seule fois à l'intérieur des cellules, ou fixer et co-tacher avec 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) et/ou d'autres anticorps avant l'imagerie à l'aide d'un microscope confocal.

5. Immunostaining

1. Fixer les cultures avec 3,7 % de formaldéhyde en PBS plus 120 mM de saccharose pendant 20 min à 37 oC.
2. Rincer et perméabilizer avec 0,2 % de Triton X-100 pendant 5 min à température ambiante, puis bloquer pendant 30 min avec 2 % d'albumine de sérum bovin (BSA).
3. Aspirez le BSA sans rincer et incuber pendant 1 h à température ambiante avec un anticorps anti-MAP2 lapin 1:1 000, un anticorps anti-3 de souris (TuJ1) 1:2 000, un anticorps anti-NeuN de poulet (1:100) et un anticorps anti-CTIP2 (1:500) ou avec une souris anti-PSD95 ( 1:200), lapin anti-synapsin 1 (1:200) et poulet anti-MAP2 anticorps pour la coloration synaptique.
4. Rincer au PBS et incuber avec des anticorps secondaires conjugués par Alexa Fluor plus DAPI pendant 45 min à 37 oC.
5. Enfin, lavez-vous deux fois avec du PBS avant l'imagerie.

6. Imagerie calcique

1. Infecter les cellules cultivées avec AAV8-syn-jGCAMP7f-WPRE (The Salk Institute for Biological Studies, GT3 Core Facility) à 10 jours après le replaquage et l'image pour évaluer les transitoires spontanées de calcium à 3-4 semaines après le replaquage.

7. Acquisition et analyse d'images

REMARQUE: Pour plus de détails sur le système d'acquisition, veuillez consulter Calabrese et coll.¹².

1. Utilisez un module d'imagerie pour l'acquisition d'images manuelles ou automatisées, et un module logiciel d'analyse d'images, tel que CellProfiler¹³, pour des mesures morphométriques.
2. Calculer la longueur moyenne des neurites positives TuJ1 et des dendrites positives MAP2 en mesurant la longueur totale par champ de vision divisé par le nombre de neurones (cellules positives DAPI et MAP2 ou TuJ1) dans le même champ.

Results

Le replaquage des neurones dérivés des hiPSCs qui ont été différenciés pendant plusieurs semaines offre plusieurs avantages. Cependant, le détachage et le replaquage des neurones différenciés qui ont de longs dendrites et axones interconnectés (Figure 1A) peuvent entraîner une fraction élevée de neurones irrémédiablement endommagés.

Comme décrit dans la section de protocole, nous avons employé l'incubation avec une enzyme protéolytique pour détach...

Discussion

Nous avons démontré une procédure directe pour la resuspension et le replaquage des cultures neuronales humaines qui optimise la viabilité, le succès de différenciation, et l'imagerie subcellulaire d'une manière qui est compatible avec les plates-formes de criblage à haute teneur, et d'autres essais pertinents à la découverte de médicaments. La figure 6 illustre le flux de travail global et les exemples de ces applications.

Bien qu'ici nous nous sommes concentrés ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Média post-replaçage
L-Ascorbic Acid	Sigma	A4403	Ajouter 1 mL de stock de 200 mM à 1 L de média N2B27
Dibutyryl-cAMP	Sigma	D0627	Ajouter 1 µ ; M
Human BDNF	Peprotech	450-02	10 ng/ml concentration finale
B27 (50x)	Thermofisher Scientific	17504044	Ajouter 20 mL à 1 L N2B27
milieu DMEM/F12 avec Glutamax	Thermofisher Scientific	31331093	Ajouter N2 et distribuer en cônes de 50 mL ; couvercles parafilm
Energie GDNF	Peprotech	450-10	10 ng/mL concentration finale
Glutamax	Thermofisher Scientific	35050038	Ajouter 10 ml à 1 L de milieu N2B27 ; supplément de glutamine
Mouse Laminin	Sigma	P3655-10mg	Ajouter 100 µ ; L à 50 mL N2B27
MEM Acides aminés non essentiels	Thermofisher Scientific	11140035	Ajouter 5 mL à 1 L de milieu N2B27
N2 (100x) Supplément	Life Technologies	17502048	Ajouter 5 mL à 500 mL de milieu
Neurobasal A	Thermofisher Scientific	10888022	Combiner avec DMEM/F12 pour générer un milieu N2B27 pour les cellules CVB wt ; milieu neural basal A
Milieu	neurobasalThermofisher Scientific	21103049	pour cellules WT126 ; milieu basal neural
SM1 Supplément StemCell	Technologies	5711	Ajouter 1:50 au milieu
Bicarbonate de sodium	Thermofisher Scientific	25080-094	Ajouter 10 mL à 1 L N2B27 media
Plate Preparation
10 cm Boîtes de culture tissulaire	Fisher Scientific	08772-E	Boîtes en plastique traitées TC
Boîtes de culture tissulaire à 6 puits	Thomas Scientific	1194Y80	Plaques NEST
Mouse Laminin	Life Technologies	23017-015	Ajouter 1:400 sur du plastique
Poly-Ornithine	Sigma	P3655-10mg	Ajouter 1:1 000 sur du plastique
UltraPure Distilled Water	Life Technologies	10977-015	Pour diluer Poly-L-Ornithine
forts
100 mM	Corning	431752	Stérile, emballé individuellement
plaque de 384 puits,	6007550	PerkinElmer	avec PLO et laminine
DPBS	Life Technologies	14190144	solution saline
tamponnée au phosphate de DulbeccoPlaques pré-enduites de poly-D-Lysine 384 puits	PerkinElmer	6057500	Rincer avant d’enrober avec de la laminine
StemPro Accutase	Life Technologies	A1110501	Appliquer une plaque de 1 mL/10 cm pendant 30 à 45 min ; enzyme protéolytique
Matériaux de fixation37
Formaldéhyde	Fisher Scientific	F79-1	Dissous dans du PBS
Saccharose	Fisher Scientific	S5-12	0,8 g par 10 mL de fixateur
Immunocolorant Matériaux
Alexa Fluor 488 Chèvre anti-souris	Invitrogen	A-11001	anticorps secondaire
Alexa Fluor 568 Chèvre anti-poulet	Invitrogen	A-11041	anticorps secondaire
Alexa Fluor 647 Chèvre anti-poulet	Invitrogen	A-21449	anticorps secondaire
Alexa Fluor 561 Chèvre anti-rat	Invitrogen	A-11077	anticorps secondaire
DAPI	Biotium	40043	visualise l’ADN
Anticorps de souris contre la b3-tubuline (TuJ-1)	Neuromics	MO15013	marqueur neuronal précoce
Anticorps de rat contre CTIP2	Abcam	ab18465	couche 5/6 corticale neurones
Anticorps de poulet contre MAP2	LifeSpan Biosciences	LS-B290	neuronal précoce
Anticorps de poulet contre NeuN	Millipore	ABN91	marqueur neuronal avancé
Anticorps de lapin contre MAP2	Shelley Halpain	N/A	Marqueur neuronal précoce
Anticorps de souris contre PSD-95	Sigma	P-246	marqueur post-synaptique
Anticorps de lapin contre Synapsin 1	Millipore	AB1543	marqueur pré-synaptique
Albumine sérique bovine (BSA)	GE Healthcare Life Sciences	SH30574,02 10	% dans le PBS pour bloquer
Titon X-100	Sigma	9002931	Diluer à 0,2 % sur le PBS pour la perméabilisation
Viability Markers
Vivafix 649/660	Biorad	135-1118	marqueur de mort cellulaire
Calcium Imaging
Nom du réactif/de l’équipement Numéro de	catalogue	de l’entreprise	Commentaires/Description
AAV8-syn-jGCAMP7f-WPRE	THE SALK INSTITUTE, GT3 Core Facility	N/A	rapporteur calcique dans un système d’administration virale
hiPSC-derived NPCs
WT 126 (Y2610)	Gage lab	N/A	Marchetto et al., 2010
CVB WT24	Yeo and Goldstein labs	N/A	non publié