Article de méthode

Étude sur le métabolisme de six insecticides systémiques dans une culture de suspension cellulaire nouvellement établie dérivée du thé (Camellia Sinensis L.) feuilles

DOI :

10.3791/59312

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15 juin 2019

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1State Key Laboratory of Tea Plant Biology and Utilization, School of Tea and Food Science & Technology, Anhui Province Key Lab of Analysis and Detection for Food Safety, 2School of Resource & Environment, Anhui Agricultural University, Key Laboratory of Agri-food Safety of Anhui Province

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail présente un protocole pour établir une culture de suspension cellulaire dérivée de feuilles de thé(Camellia sinensis L.) qui peut être utilisée pour étudier le métabolisme des composés externes qui peuvent être pris par l'ensemble de la plante, tels que les insecticides.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Une plate-forme pour étudier le métabolisme des insecticides à l'aide de tissus in vitro de la plante de thé a été développée. Les feuilles des plantulettes stériles de thé ont été induites pour former le callus lâche sur le média basal de Murashige et de Skoog (MS) avec les hormones végétales 2,4-dichlorophenoxyacetic acide (2,4-D, 1.0 mg L-1) et kinetin (KT, 0.1 mg L-1). Callus s'est formé après 3 ou 4 tours de sublituring, chacun d'une durée de 28 jours. Le callus lâche (environ 3 g) a ensuite été inoculé dans le support liquide B5 contenant les mêmes hormones végétales et a été cultivé dans un incubateur secouant (120 tr/min) dans l'obscurité à 25 à 1 oC. Après 3-4 sous-cultures, une suspension cellulaire dérivée de la feuille de thé a été établie à un rapport de sous-culture allant de 1:1 à 1:2 (suspension mère liquide: milieu frais). À l'aide de cette plate-forme, six insecticides (5 g mL-1 chaque thiaméthoxam, imidaclopride, acétamipride, imidaclothiz, diméthoate et omethoate) ont été ajoutés dans la culture de suspension cellulaire dérivée des feuilles de thé. Le métabolisme des insecticides a été suivi à l'aide de chromatographie liquide et de chromatographie gazeuse. Pour valider l'utilité de la culture de suspension de cellules de thé, les métabolites du thiaméthoxan et du diméthoate présents dans les cultures cellulaires traitées et les plantes intactes ont été comparés utilisant la spectrométrie de masse. Dans les cultures traitées de cellules de thé, sept métabolites du thiaméthoxan et deux métabolites du diméthoate ont été trouvés, tandis que dans les usines intactes traitées, seulement deux métabolites du thiamethoxam et un de dimethoate ont été trouvés. L'utilisation d'une suspension cellulaire a simplifié l'analyse métabolique par rapport à l'utilisation de plantes de thé intactes, en particulier pour une matrice difficile comme le thé.

Introduction

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Le thé est l'une des boissons non alcoolisées les plus consommées dans le monde1,2. Le thé est produit à partir des feuilles et des bourgeons de la forêt use use vivace Camellia sinensis L. Les plantes à thé sont cultivées dans de vastes plantations et sont sensibles à de nombreux insectes nuisibles3,4. Les insecticides organophosphorés et néonicotinoïdes sont souvent utilisés comme insecticides systémiques5 pour protéger les plants de thé contre les ravageurs tels que les mouches blanches, les larves de feuilles et certaines espèces de lépidoptères 6,7. Après l'application, ces insecticides sont absorbés ou translocalisés dans la plante. À l'intérieur de la plante, ces insecticides systémiques peuvent être transformés par hydrolyse, oxydation ou réactions de réduction par des enzymes végétales. Ces produits de transformation peuvent être plus polaires et moins toxiques que les composés parents. Cependant, pour certains organophosphates, les bioactivités de certains produits sont plus élevées. Par exemple, l'acéfate est métabolisé en methamidophos plus toxiques8,9, et le diméthoate en omethoate10,11. Les études métaboliques végétales sont donc importantes pour déterminer le sort d'un pesticide à l'intérieur d'une plante12.

Les cultures de tissus végétaux se sont avérées être une plate-forme utile pour étudier le métabolisme des pesticides, avec les métabolites identifiés similaires à ceux trouvés dans les plantes intactes13,14,15. L'utilisation des cultures tissulaires, en particulier les cultures de suspension cellulaire, présente plusieurs avantages. Tout d'abord, les expériences peuvent être menées sans micro-organismes, évitant ainsi l'interférence de la transformation ou de la dégradation des pesticides par les microbes. Deuxièmement, la culture tissulaire fournit des matériaux cohérents pour une utilisation à tout moment. Troisièmement, les métabolites sont plus faciles à extraire des cultures tissulaires que des plantes intactes, et les cultures tissulaires ont souvent moins de composés interring et une moindre complexité des composés. Enfin, les cultures tissulaires peuvent plus facilement être utilisées pour comparer une série de métabolisme des pesticides dans une seule expérience16.

Dans cette étude, une suspension de cellules dérivée des feuilles de la plante de thé stérile-cultivée a été avec succès établie. La culture de suspension de cellules de thé a été alors employée pour comparer les comportements de dissipation de six insecticides systémiques.

Ce protocole détaillé est destiné à fournir quelques conseils afin que les chercheurs puissent établir une plate-forme de culture de tissu végétal utile pour étudier le sort métabolique des xénobiotiques dans le thé.

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Protocole

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1. Culture de callus de thé

REMARQUE : Les feuilles stériles ont été dérivées de lignées végétales cultivées in vitro développées pour la première fois dans le groupe de recherche17. Toutes les procédures jusqu'à la section 5 ont été effectuées dans une hotte d'écoulement laminaire stérile, à l'exception du temps de culture dans un incubateur.

  1. Ajuster le pH des deux supports (le milieu basal de Murashige et Skoog [MS] et le milieu liquide B5 de Gamborg) à 5,8 avant l'autoclatage (121 oC, 20 min).
  2. Couper le long de la veine moyenne d'une feuille stérile à l'aide de ciseaux, puis subdiviser chaque moitié en petits morceaux d'environ 0,3 cm x 0,3 cm dans un plat de Pétri.
  3. Placez les explants stériles (les petits morceaux de feuilles) sur le support basal MS contenant les hormones végétales 2,4-D (1,0 mg L-1) et KT (0,1 mg L-1). Six explants peuvent être placés dans un flacon de 300 ml contenant 100 ml de supports basaux MS.
  4. Culture les explants ci-dessus à une température constante de 25 oC dans l'obscurité. Après 28 jours, sélectionnez la première génération de calus induit et transférez-la en flacon frais (une sous-culture). Acquérir le calus lâche et friable après 3-4 sous-cultures.

2. Culture de suspension de cellules de thé

  1. Couper les callosités vigoureuses, friables et lâches du milieu solide en petits morceaux (gamme ici 0,5 à 2 mm) à l'aide d'une lame chirurgicale stérile dans des conditions stériles.
  2. Peser environ 3 g des petits morceaux de callus. Placez le callus dans un flacon de 150 ml contenant 20 ml de b5 de supports liquides complétés par 2,4-D (1,0 mg L-1) et KT (0,1 mg L-1).
  3. La culture de la suspension des cellules liquides à une température constante (25 à 1 oC) dans un incubateur secouant à 120 tr/min dans l'obscurité.
  4. Après 7 à 10 jours de culture, retirer les flacons de culture et les laisser reposer quelques minutes.
  5. Prenez tout le supernatant comme matière de graine pour la sous-culture à la moyenne fraîche (rapport de sous-culture du liquide de mère de suspension au moyen frais s'est compris entre 1:1 et 1:2). Retirez les grandes callosités précipitées.
  6. Obtenir la dernière culture de suspension cellulaire bien cultivée après des cycles de sous-culture de 28 jours chacun.

3. Triphenyl tetrazolium chlorure d'un soud de la viabilité cellulaire

  1. Tuer un échantillon de cellules vivantes à 100 oC pendant 10 minutes comme cellule témoin avant la coloration de la viabilité.
  2. Centrifuge toutes les cultures de suspension cellulaire pendant 8 min à 6000 x g. Retirez le supernatant avant de suspendre les cellules dans 2,5 mL de tampon salin (PBS) tampon tampon tampon tampon (pH 7.3) et secouez-le pendant 1 min à la main.
  3. Ajouter 2,5 ml de la solution de chlorure de tétrasolide de 0,4 % et secouer à nouveau à la main.
  4. Incuber le mélange pendant 1 h dans un incubateur debout (30 oC).

4. Traitement et échantillonnage des cultures de suspension de cellules de thé avec des insecticides

  1. Ajouter une aliquot de 400 l de solution de stock stérilisée par filtre (500 mL-1) de quatre néonicotinoïdes (thiamethoxam, acetamiprid, imidacloprid et imidaclothiz) ou deux organophosphates (dimethoate et omethoate) dans les cultures de suspension cellulaire, respectivement.
    REMARQUE: Si le but est de comparer les comportements xénobiotiques, utilisez le même lot mère de suspensions cellulaires pour tester les différents composés.
  2. Culture des échantillons de suspensions cellulaires avec des insecticides à température constante (25 à 1 oC) et en secouant la vitesse de l'incubateur (120 tr/min). Prenez les échantillons (voir l'étape 4.3 ou 4.4) sur 0, 3, 5 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 et 75 jours.
  3. Pour tester un échantillon contenant un néonicotinoïde, retirer un aliquot de 1 ml de la culture cellulaire homogène, le placer dans un tube de centrifugeuse en plastique de 1,5 ml et la centrifugeuse à 4000 x g pendant 2 min.
    1. Passer les supernatants à travers une membrane de filtre de la taille d'un porre de 0,22 m avant l'analyse par la masse de chromatographie liquide-ultravioletde (HPLC-UV) et de chromatographie liquide ultra-haute performance-quadrupole temps de vol (UPLC-QTOF) spectrométrie (Tableau des Matériaux).
  4. Pour tester un échantillon contenant un organophosphate, retirer un aliquot de 500 L de la culture cellulaire et placer dans un tube centrifugede de 35 ml ou un tube de centrifugeuse en plastique de 1,5 ml (préparer ce dernier échantillon comme celui des néonicotinoïdes).
    1. Ajouter 0,1 g de chlorure de sodium et 5 ml d'acétone/acétate d'éthyle (3:7, v/v) dans le tube centrifuge de 35 ml des 500 échantillons de ll.
    2. Vortex les mélanges pendant 1 min, puis laissez-les reposer pendant 10 min.
    3. Prendre 2,5 ml du supernatant dans un tube de verre de 10 ml et s'évaporer à la séchage à l'aide d'un évaporateur d'azote à 40 oC.
    4. Dissoudre le résidu avec 1 ml d'acétone, vortex pendant 1 min, le passer à travers une membrane de filtre de 0,22 m avant l'analyse par le détecteur photométrique de chromatographie-flamme de gaz (GC-FPD).

5. Préparation d'échantillon de plante de thé intacte avec des insecticides

REMARQUE : L'essai intact de plante de thé a été mené dans un système hydroponique utilisant des semis de thé cultivés dans 50 mL d'une solution nutritive (30 NH4, 10 NO3-, 3.1 PO4-, 40 K', 20 Ca2 ', 25 Mg2 ', 0.35 Fe 2', 0.1 B 3 ,1,0 Mn2 ,0,1 Zn 2,0,025 Cu2 ,0,05 Mo,et 10 Al3 ,en mg L-1)18. Une serre expérimentale était sous un cycle clair-obscurité (12 h de lumière et 12 h d'obscurité) à 20 oC à l'Université agricole d'Anhui.

  1. Mettre cinq plantes dans un pot en plastique de 4 L pendant 15 jours.
  2. Ajouter 0 ppm (contrôle) ou 100 ppm de thiaméthoxam ou diméthoate dans des pots en plastique, respectivement.
  3. Préparer l'échantillon de plante intact selon la méthode précédente, à l'exception de présoaking19, puis analyser avec spectrométrie de masse pour un spectre de masse précis.

6. Analyse des instruments

  1. Analyse HPLC du comportement métabolique des néonicotinoïdes
    1. Utilisez un HPLC-UV (Tableau des Matériaux) pour détecter le contenu et les produits métaboliques du thiaméthoxam et de l'acétamipride à une longueur d'onde de 254 nm, et de l'imidaclopride et de l'imidaclothiz à 270 nm dans des échantillons de la section 4.3.
      REMARQUE : L'état HPLC-UV était le même que l'étude précédente19.
  2. Analyse GC du comportement métabolique des organophosphates
    1. Détecter le contenu du diméthoate et de l'omethoate dans les échantillons de la section 4.4 par un GC-FPD à l'aide d'une colonne chirale (Tableau des matériaux).
    2. Utilisez l'azote comme gaz porteur et fixez le débit à 1,0 ml min-1.
    3. Fixez la température initiale à 120 oC et maintenez-la pendant 5 min. Augmenter la température à 150 oC à 30 oC min-1 et maintenir pendant 3 min. Augmenter à 170 oC à 10 min-1 et maintenir pendant 7 min. Enfin, augmentez jusqu'à 210 oC à 30 oC min-1, puis maintenez pendant 5 min.
    4. Définir la température d'injection à 200 oC en mode splitless; Définir la température du détecteur à 250 oC.
    5. Définir le volume d'injection à 1 L.
  3. Analyse UPLC-QTOF des métabolites insecticides dans la culture cellulaire
    1. Détecter les métabolites des insecticides en culture cellulaire (échantillons de la section 4.3) à l'aide d'UPLC-QTOF avec une colonne C18 (Tableau des matériaux).
    2. Définir le débit à 0,2 ml min-1. Définir le volume d'injection à 10 L.
    3. Pour les échantillons traités aux néonicotinoïdes, fixez la phase mobile initiale à 85 % A (5 mM d'eau formatée d'ammonium) et à 15 % B (acétonitrile). Plus de 10 min, augmenter la phase b mobile à 38% et revenir à 15% sur 1 min, tenir pendant 9 min.
    4. Pour les échantillons traités par organophosphate, définir la phase mobile initiale à 55 % A (0,1 % d'eau acide formique) et à 45 % B (acétonitrile). Plus de 5 min, augmenter la phase mobile B à 70%, puis revenir à 45% de B sur 0,5 min, tenir pendant 2,5 min.
    5. Définir les paramètres d'exploitation QTOF comme suit : température du gaz, 325 oC; gaz de séchage (azote), 10 L min-1; température du gaz de gaine, 350 oC; flux de gaz de gaine, 11 L min-1; tension capillaire, 4000 V; tension de buse, 1000 V; tension fragmentaire, 100 V pour les insecticides néonicotinoïdes ou 110 V pour les insecticides organophosphorés; tension d'écumeur, 65 V; fonctionnant en mode ion positif.
    6. Fixez l'instrument sur le spectre complet de l'analyse et ciblez le mode MS/MS.
    7. Traiter les données à l'aide d'outils de masse précis; Inférer les métabolites sans produits standard de l'annotation MS / MS ainsi que la littérature12,15,20,21,22.
  4. Analyse UPLC-Orbitrap des métabolites insecticides dans l'extrait végétal intact
    1. Détecter les métabolites d'insecticides dans l'extrait végétal intact à l'aide de la spectrométrie de masse UPLC-Orbitrap (Tableau des matériaux).
    2. Définir les paramètres d'exploitation de la spectrométrie de masse (tableau des matériaux)comme suit : pression de gaz de gaine, 35 arb; température du gaz, à 300 oC; tension de buse, 3.5 KV; température capillaire, 350 oC.
    3. Définir les programmes d'élution comme ci-dessus (étapes 6.3.3 et 6.3.4) pour l'analyse UPLC-QTOF de la culture cellulaire.

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Résultats

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L'induction du calus à partir de feuilles récoltées dans des arbres à thé cultivés en campagne et à partir de feuilles extraites de plantlettes de thé cultivées in vitro dans un environnement stérile a été comparée en mesurant la contamination, le brunissement et l'induction après 28 jours de culture sur les milieux de La SP ( Figure 1A). La croissance de Callus a été enregistrée à 20, 37, 62 et 90 jours de culture (figure 1B). L...

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Discussion

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Cet article présente le processus détaillé d'établir un modèle du métabolisme de pesticide dans le tissu de plante de thé, y compris la sélection des explants, la détermination de la viabilité de cellules, et l'établissement d'une culture de suspension de cellules de thé avec le métabolisme élevé activité. Toutes les parties d'un tissu végétal pourraient être utilisées pour initier le callus dans un environnement stérilisé25. Les feuilles de thé ont été choisies pour l'initiation du calus dans cet...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ces travaux ont été soutenus par le National Key Research and Development Program (2016YFD0200900) de Chine, la National Natural Scientific Foundation of China (No. 31772076 et No. 31270728), China Postdoctoral Science Foundation (2018M630700), et Open Fund of State Key Laboratory of Tea Plant Biology and Utilization (SKLTOF20180111).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Acétamipride (99,8 %)Dr. Ehrenstorfer46717N° CAS : 135410-20-7
Acétonitrile (CAN, 99,9 %)TediaAS1122-801N° CAS : 75-05-8
AgarSolarbio Science & TechnologieA8190N° CAS : 9002-18-0
Clothianidine (99,8 %)Dr. Ehrenstorfer525N° CAS : 210880-92-5
Diméthoate (98,5 %)Dr. Ehrenstorfer109217N° CAS : 60-51-5
Imidaclopride (99,8 %)Dr. Ehrenstorfer91029N° CAS : 138261-41-3
Imidaclothiz (99,5 %)Toronto Research ChemicalI275000N° CAS : 105843-36-5
Kinétine (KT, >98,0 %)Solarbio Science & TechnologieK8010N° CAS : 525-79-1
Ométhoate (98,5 %)Dr. Ehrenstorfer105491N° CAS : 1113-02-6
Polyvinylpolypyrrolidone (PVPP)Solarbio Science & TechnologieP8070N° CAS : 25249-54-1
SaccharoseTocris Bioscience5511N° CAS : 57-50-1
Thiaméthoxame (99,8 %)Dr. Ehrenstorfer20625N° CAS : 153719-23-4
Chlorure de triphényltétrazolium (TTC, 98,0 %)Solarbio Science & TechnologieT8170N° CAS : 298-96-4
Acide 2,4-dichlorophénoxyacétique (2,4-D, >98,0 %)Guangzhou Saiguo BiotechD8100N° CAS : 94-75-7
colonne chiraleAgilent CYCLOSIL-B112-6632Colonne de chromatographie (30 m × ; 0,25 mm & times ; 0,25 &mu ; m)
Chromatographie en phase gazeuse (GC)Shimadu2010-Pluscouplé à un détecteur photométrique de flamme (FPD)  ;   ;
Chromatographie liquide haute performance (HPLC)Agilent1260Couplé à un détecteur d’ultraviolets (UV)
Colonne HSS T3 C18Waters186003539Colonne de chromatographie (100 mm × ; 2.1 mm & times ; 1.8 &mu ; m)
Chromatographie liquide à ultra-hautes performances (UPLC)Spectromètremasse à temps de vol quadripolaire en tandem (QTOF)
Chromatographie liquide à ultra-hautes performances (UPLC)Thermo ScientificUltimate 3000-Q Exactive Focusconnecté à un spectromètre de masse Orbitrap
de

Références

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