Traitement d’image protocole pour l’analyse de la Diffusion et la taille de Cluster de récepteurs membranaires par microscopie de Fluorescence

Summary

Nous présentons ici un protocole pour une seule particule suivi d’analyse d’images qui permet une évaluation quantitative des coefficients de diffusion, types de tailles de motion et cluster de simples particules détectées par microscopie à fluorescence.

Abstract

Suivi sur une séquence vidéo et de l’analyse postérieure de leurs trajectoires de particules est aujourd'hui une opération courante dans de nombreuses études biologiques. À l’aide de l’analyse des récepteurs de la membrane cellulaire des grappes comme modèle, nous présentons un protocole détaillé pour cette tâche d’analyse image à l’aide de Fidji (ImageJ) et routines Matlab pour : 1) définir des zones d’intérêt et de concevoir des masques adaptés à ces régions ; 2) suivre les particules dans les vidéos de microscopie de fluorescence ; 3) analyser les caractéristiques de diffusion et de l’intensité des titres sélectionnés. L’analyse quantitative des coefficients de diffusion, les types de mouvement et la taille de cluster obtenues en microscopie par fluorescence et de traitement d’image fournit un outil précieux pour déterminer objectivement la dynamique des particules et les conséquences de la modification conditions environnementales. Dans cet article, nous présentons des protocoles détaillés pour l’analyse de ces fonctionnalités. La méthode décrite ici non seulement permet la détection de molécules simples suivi, mais automatise également l’estimation des paramètres de diffusion latérale à la membrane cellulaire, classifie le type de trajectoire et permet une analyse complète ainsi surmonter la difficultés pour quantifier la taille du spot sur sa trajectoire entière à la membrane cellulaire.

Introduction

Protéines de la membrane intégrées dans la bicouche lipidique sont en mouvement continu en raison de la diffusion thermique. Leur dynamique est essentielle pour réguler les réactions de cellules, comme les interactions intermoléculaires permettent la formation de complexes qui varient en taille de monomères d’oligomères et influencent la stabilité des complexes de signalisation. Élucider les mécanismes qui contrôlent la dynamique des protéines est donc un nouveau défi en biologie cellulaire, nécessaire pour comprendre les voies de transduction de signal et d’identifier les fonctions des cellules imprévus.

Certaines méthodes optiques ont été....

Protocol

1. préparation des échantillons biologiques

1. La croissance de cellules Jurkat dans RPMI 1640 additionné de 10 % FCS, NaPyr et L-glutamine (RPMI complet). Cellules Electroporate Jurkat (20 x 10⁶ cellules/400 µL de milieu RPMI 1640 avec 10 % FCS) avec un vecteur de récepteurs monomères chemokine GFP-étiqueté (CXCR4-AcGFP, 20 μg) afin de permettre sa détection à l’aide de la microscopie de fluorescence.
   Remarque : Il est possible d’utiliser d’autres protéines fluorescentes monomères tels que mCherry, mScarlet, etc..
2. 24h après la transfection d’analyser les cellules dans un cytomètre en flux de déterminer la viabilité cell....

Results

L’utilisation de ce protocole permet le suivi automatique des particules détectées dans les films de microscopie par fluorescence et de l’analyse de leurs caractéristiques dynamiques. Au début, les cellules sont transfectées avec la protéine fluorescent couplé à suivre. Le niveau approprié des récepteurs présente sur la surface de la cellule qui permet la que SPT est obtenue par cellule tri (Figure 1). Les cellules sélectionnées sont analysés au microscope TI.......

Discussion

La méthode décrite est facile à réaliser, même sans avoir aucune expérience antérieure de travail avec Matlab. Toutefois, les routines Matlab exigent extrêmement précision avec la nomenclature des différentes commandes et la localisation des différents dossiers utilisés par le programme. Dans le suivi routine d’analyse (étape 3), plusieurs paramètres peuvent être modifiés. La fenêtre « Réglage mélange gaussien modèle convenable » (étape 3,8) contrôle comment U-track permet de détecter des particules unique sur la vidéo. .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cellules Jurkat humaines	ATCC	CRL-10915	Lignée de cellules T humaines. Tout autre type de cellule peut être analysé avec ce logiciel
pAcGFPm-N1 (PT3719-5)DNA3GFP	Clontech	632469	Différentes protéines fluorescentes peuvent être suivies et analysées avec cet
électroporateur de cellules Gene Pulse X.	BioRad  ;		Nous utilisons 280 V, 975 mF, pour les cellules Jurkat. Utilisez la méthode de transfection qui fonctionne le mieux dans vos mains.
Cytomètre en flux Cytomics FC 500	Beckman Coulter
Trieur de cellules MoFlo Astrios  ;	Beckman Coulter		Selon le niveau de transfection, le tri cellulaire peut ne pas être nécessaire. Vous pouvez également utiliser des cellules avec une expression stable de niveaux adéquats du récepteur d’intérêt.
Dako Qifikit	DakoCytomation	K0078	Utilisé pour quantifier le nombre de récepteurs à la surface de la cellule.
Boîtes à micropuits à fond en verre	MatTek corporation	P35G-1.5-10-C
Fibronectine humaine à partir de plasma	Sigma-Aldrich	F0895
Recombinant humain CXCL12	PeproTech	300928A
Inversé Leica AM TIRF	Leica
EM-CCD	caméra Andor  ;	DU 885-CSO-#10-VP
MATLAB	The MathWorks, Natick, MA
Logiciel U-Track2	Danuser Laboratory
ImageJ	NIH		https://imagej.nih.gov/ij/
FiJi	FiJI		https://imagej.net/Fiji)
u-Track2 software			Outil Matlab.  ; Pour l’installation, téléchargez .zip fichier à partir de la page Web (http://lccb.hms.harvard.edu/software.html) et décompressez le fichier dans un répertoire de votre choix
GraphPad Prism	Logiciel