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Article de méthode

Photothérapie quotidienne avec lumière rouge pour réglementer Candida albicans biofilms croissance

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DOI :

10.3791/59326

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23 avril 2019

 ,  , 
1Department of Cariology, Operative Dentistry and Dental Public Health, Indiana University School of Dentistry, 2Department of Restorative Dentistry, Ceará Federal University, School of Dentistry

Dans cet article

Résumé

Nous présentons ici un protocole afin de mesurer le résultat de l’application de la lumière rouge sur la croissance de Candida albicans biofilms. Un dispositif rouge non cohérentes avec la longueur d’onde de 635 nm et densité d’énergie de 87,6 J·cm-2 a été appliqué tout au long de la croissance de Candida albicans biofilms pendant 48 h.

Résumé

Nous présentons ici un protocole pour évaluer les résultats du taux quotidien lumière rouge traitement sur la croissance de Candida albicans biofilms. Pour augmenter la croissance planctonique de SN425 de c. albicans , l’inocule a grandi sur des supports de Base d’azote de levure. Pour la formation de biofilm, RPMI 1640 media, qui ont des concentrations élevées d’acides aminés, ont été appliqués afin de contribuer à la croissance de biofilm. Biofilms de 48 h ont été traités deux fois par jour pendant une période de 1 min avec un dispositif de lumière non-cohérente (lumière rouge, longueur d’onde = 635 nm, la densité d’énergie = 87,6 J·cm-2). Tel qu’un contrôle positif (CP), chlorhexidine 0,12 % (CHX) a été appliqué et comme témoin négatif (NC), 0,89 % NaCl a été appliquée sur les biofilms. Unités (UFC), formant des colonies des exopolysaccharides poids sec, solubles et insolubles ont été quantifiés après traitements. En bref, le protocole présenté ici est simple, reproductible et apporte des réponses au sujet de la viabilité, des quantités de polysaccharides extracellulaires et de poids sec après le traitement de la lumière rouge.

Introduction

L’augmentation de l’incidence du diabète, des applications de traitement immunosuppresseur, infection par le VIH, épidémie de sida, cliniques invasives et la consommation d’antibiotiques à large spectre au cours des années ont augmenté l’incidence de Candida albicans des maladies1,2. Les infections de c. albicans sont communément associées au développement du biofilm et peuvent provoquer des manifestations cliniques, telles que la candidose, ou des manifestations systémiques, par exemple une candidémie1,2. Un des facteurs de virulence plus remarquables de la croissance de biofilm est la création de matrice de polysaccharides extracellulaires. La formation de biofilm coopère pour augmenter la résistance aux médicaments antifongiques existants, stress environnemental et hôte mécanismes immunitaires3.

La croissance de biofilm de c. albicans commence avec l’adhésion précoce des cellules planctoniques à un substrat, suivie par la multiplication des cellules de levure par la surface du substrat et la croissance des hyphes. La dernière phase de la croissance de biofilm est la phase de maturation, dans lequel développement levuriformes est supprimée, le développement des hyphes se dilate et la matrice extracellulaire contient le biofilm4. C. albicans exopolysaccharides (EPS) dans la matrice interagissent pour former les mannan-glucane complexe5,6. L’interaction des exopolysaccharides est critique pour la défense des biofilms contre drogues7. Par conséquent, la réduction de l’EPS de la matrice extracellulaire de c. albicans pourrait soutenir le développement de nouveaux protocoles d’antibiofilm pour le contrôle de la candidose buccale.

Lumière régularise la croissance, le développement et le comportement de plusieurs organismes8 et il a été appliqué comme un antimicrobien en chimiothérapie antimicrobienne photodynamique (PACT). PACTE s’applique une lumière visible d’une longueur d’onde spécifique et un absorbant la lumière photosensibilisateur9. Toutefois, les substances photosensibilisantes ont des difficultés à pénétrer le biofilm, causant plus faible efficacité10. L’incapacité des agents thérapeutiques à pleinement s’infiltrer dans les biofilms est une raison que les biofilms résistent parfois thérapie antimicrobienne traditionnelle3,5. Pour désactiver les clos des cellules microbiennes, antimicrobiens ont besoin de pénétrer à travers la matrice extracellulaire ; Néanmoins, l’EPS caractérise un obstacle diffusion pour ces molécules en demandant leur niveau de transport dans le biofilm ou en influençant la réponse de l’antimicrobien avec la matrice elle-même11.

Considérant les inconvénients du Pacte, l’utilisation de la lumière en soi émerge comme une amélioration utile. Les données préliminaires ont révélé que le traitement avec la lumière bleue, deux fois par jour a sensiblement inhibe la production de EPS insoluble dans le biofilm de Streptococcus mutans . Par la diminution des EPS-insolubles, lumière bleue a diminué la croissance de biofilm. Néanmoins, les résultats de la photothérapie à l’aide de la lumière rouge de c. albicans biofilms sont rares. Par conséquent, l’objectif de cette étude était d’évaluer dans quelle photothérapie de manière à l’aide de la lumière rouge influence la croissance et l’arrangement de c. albicans biofilms. Pour le traitement deux fois par jour, nous avons adapté anciens protocoles9,12 pour fournir un modèle simple et reproductible de biofilm qui fournit des réponses au sujet de la viabilité, notre laboratoire les polysaccharides extracellulaires et de poids sec montants après traitement de la lumière rouge. Le même protocole peut être utilisé pour tester les autres thérapies.

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Protocole

1. préparation des milieux de culture

  1. Préparer la sabouraud dextrose agar (SDA). Suspendre 65 g de SDA additionné de chloramphénicol (50 mg/L) dans 1 000 mL d’eau distillée. Ébullition pour dissoudre le milieu complètement. Stériliser à l’autoclave à 15 PSI (121° C) pendant 30 min. laisser refroidir à 45-50 ° C. Bien mélanger et verser 20 mL de SDA dans les plats de pétri stériles (taille : 100 x 15 mm).
  2. Préparer la levure azote (YNB) milieu de base additionné de 100 mM de glucose en mélangeant 6,7 g de YNB et 18 g de dextrose à 1 000 mL d’eau ultrapure. Mélanger à l’aide d’un agitateur et stériliser le milieu à l’aide d’un système de filtration sous vide de 0,22 µm.
  3. Préparer le RPMI en mélangeant 10,4 g de RPMI 1640 et 34,32 g de 3-(N-morpholino) sulfonique (MOPS) à 1 000 mL d’eau ultrapure. Mélanger dans un agitateur sans chaleur et ajuster le pH à 7 en ajoutant 1 N NaOH (ajouter 2 g de NaOH à 50 mL d’eau ultrapure). Stériliser le milieu à l’aide d’un système de filtration sous vide de 0,22 µm.

2. pré inoculum et inoculum

  1. Enlever le micro-organisme SN425 de c. albicans du congélateur −80 ° C et laisser décongeler à température ambiante. Graines de 10 µL de la culture de réserve sur les boîtes de pétri contenant SDA additionné de chloramphénicol (50 mg/L). Incuber les boîtes de pétri en aérobie à 37 ° C pendant 48 h.
  2. Après 48 h d’incubation, ajouter 10 colonies de c. albicans à 10 mL de levure d’azote milieu de base (YNB) additionné de 100 mM de glucose et incuber en aérobie à 37 ° C pendant 16 h pour l’inoculum avant.
  3. Après incubation pour 16 h, préparer les inocule en diluant les ferments dans un milieu frais YNB additionné de 100 mM de glucose dans un 01:10 proportion (1 mL de la culture starter dilué dans 9 mL de YNB). Mesurer la densité optique initiale (Do) à 540 nm.
  4. Incuber les inocule par voie aérobie à 37 ° C pendant 8 h, jusqu'à ce que les souches atteignent la phase de croissance logarithmique et mesurent la division d’opposition définitive à 540 nm. Soustraire l’OD final de la division d’opposition initiale afin de vérifier si la division d’opposition de l’innoculum sur la phase de croissance logarithmique (8 h, basé sur les courbes de croissance dans la Figure 1).
  5. Pour rejoindre un inoculum avec 107 cellules mL-1, centrifuger l’inoculum pendant 5 min à 5 500 x g, éliminer le surnageant et concentrer l’inoculum de la moitié du volume des tubes.

3. photothérapie et la formation de Biofilm

  1. Ajouter 1 mL de l’inoculum dans les puits d’une plaque de polystyrène 24 puits. Incuber en aérobie à 37 ° C pendant 90 min permettre l’adhésion cellulaire jusqu’au fond des puits.
  2. Utiliser un non-cohérente rouge clair (voir Table des matières) comme source de lumière avec une longueur d’onde de 635 ± 10 nm et une puissance de sortie fixe de 1 460 mW cm−2.
  3. Utilisez un wattmètre pour mesurer la densité de puissance de la lumière. L’exposition énergétique appliquée est de 87,6 J cm-2, équivalent à environ 1 min d’exposition. Utiliser la formule de densité d’énergie (J/cm2) = densité de puissance (W/cm2) x durée d’irradiation (s). S’applique à une distance de 5 mm entre la source lumineuse et le biofilm pour éviter le réchauffement de l’échantillon.
  4. Traiter les biofilms de contrôle positif à la chlorhexidine 0,12 % pendant 1 min et biofilms contrôle négatif avec 0,89 % NaCl pendant 1 min.
  5. Après les traitements, laver toutes les biofilms deux fois avec une solution de NaCl de 0,89 %.
  6. Ajouter 1 mL de milieu RPMI 1640 tamponnée avec 3-(N-morpholino) sulfonique (MOPS) à pH 7 sur les biofilms et incuber les plaques à 37 ° C pendant la nuit.
  7. Le matin, appliquer les mêmes traitements qu’étapes 3.2 à 3.6, lavez les biofilms deux fois avec 0,89 % NaCl, ajouter nouveau RPMI tamponnée avec MOPS (1 mL, pH 7) dans les puits et incuber en aérobie à 37 ° C.
  8. Le même jour, après 6 h, exposer les biofilms à la lumière rouge. Traiter les biofilms de contrôle positif à la chlorhexidine 0,12 % pendant 1 min et biofilms contrôle négatif avec 0,89 % NaCl pendant 1 min. Après traitement, laver les biofilms deux fois avec une solution de NaCl de 0,89 %.
  9. Répétez les étapes de 3,2 à 3,8 jusqu'à réaliser le développement du biofilm de 48 h.
    NOTE : Fondamentalement, un traitement arrivera dans la matinée et l’autre se passera dans l’après-midi le même jour (6 h d’intervalle).

4. le traitement

  1. Ajouter 1 mL de stérile 0,89 % NaCl dans la cupule pour éliminer le biofilm par rayer le bien en faisant un embout de la pipette. Ajouter le biofilm enlevé dans un tube stérile.
  2. Ajouter un autre 1 mL stérile 0,89 % NaCl dans le puits. Encore une fois le rayer et ajouter la suspension dans le même tube pour un volume total de 2 mL.
  3. Unités formant colonie (UFC)
    1. Vortex vigoureusement la suspension de biofilm pendant 1 min. De la suspension de biofilm, utilisez une partie aliquote de 0,1 mL de la dilution en série.
    2. Diluer la suspension de biofilm de 10-1 à 10-4 dans une solution de NaCl de 0,89 %.
    3. Graine de 50 μl de chaque dilution aux plaques de SDA et incuber les plaques à 37 ° C pendant 48 h.
    4. Compter les colonies et d’appliquer la formule CFU/mL = nombre de colonies x 10n / q (n = dilution ; q = volume ensemencé).
  4. Poids sec
    1. Peser et étiqueter des microtubes à centrifuger.
    2. À partir de la suspension de biofilm, utilisez 0,1 mL pour la détermination de la masse sèche (biomasse).
    3. Ajouter 1 mL d’éthanol absolu dans une partie aliquote de 0,1 mL de biofilms et conserver à-20 ° C pendant 18 heures. Après 18 h, centrifuger à 10 000 g pendant 10 min.
    4. Jeter le surnageant, placer les tubes sur un dessiccateur à sécher les échantillons pendant une semaine et peser les microtubes à centrifuger à nouveau.
  5. Polysaccharides hydrosolubles (FSSF) et alcali-soluble polysaccharides (ASP)
    1. De la suspension du biofilm, vigoureusement vortex le reste du volume (1,8 mL) durant 1 min et centrifuger à 5 500 × g pendant 10 min à 4 ° C. Stocker le surnageant dans un nouveau tube et laver le précipité deux fois avec les cellules, qui contiennent les constituants insolubles de la matrice extracellulaire avec de l’eau ultrapure stérile (5 500 × g, 10 min à 4 ° C).
    2. Remettre en suspension le contenu insoluble à 1,8 mL d’eau ultrapure stérile.
    3. Polysaccharides hydrosolubles (FSSF)
      Remarque : Effectuez cette expérience à une hotte aspirante.
      1. Partir du surnageant stocké, réserver 1 mL pour la quantification des polysaccharides hydrosolubles (FSSF).
      2. Homogénéiser le surnageant stocké pendant 1 min. Ensuite, transférer dans des tubes stériles et ajouter 2,5 volumes d’éthanol à 95 %. Stocker les tubes pendant 18 heures à-20 ° C pour la précipitation des FSSF.
      3. Après 18 h, centrifuger les tubes à 9 500 x g pendant 20 min à 4 ° C. Après centrifugation, jeter le surnageant.
      4. Laver les échantillons trois fois avec 75 % d’éthanol et sécher à l’air des granulés. Resuspendre le culot avec 1 mL d’eau ultrapure stérile et de quantifier le FSSF, à l’aide de la méthode à l’acide sulfurique-phénol.
      5. Utiliser le glucose de 0,1 % (0,01 g de glucose à 10 mL d’eau ultrapure) pour la courbe d’étalonnage (0, 2.5, 5, 10, 15, 20 et 25 µL de glucose par tube).
      6. Ajouter 200 µL de 5 % de phénol (2,7 mL de phénol de 90 % à 47,3 mL d’eau ultrapure) dans un tube de verre comprenant 200 µL de l’échantillon ou la courbe d’étalonnage point (en triple exemplaire par échantillon) et mélanger avec précaution.
      7. Ajouter 1 mL d’acide sulfurique dans le tube et mélanger. Attendre 20 min pour la réaction et de mesurer les échantillons à l’aide d’un spectrophotomètre (490 nm).
    4. Alcali-soluble polysaccharides (ASP)
      Remarque : Effectuez cette expérience sous une hotte.
      1. De la quantité de remises en suspension insoluble, séparer 1 mL pour le dosage de l’aspic. Centrifuger les aliquotes de chaque suspension de biofilm (13 000 x gpendant 10 min à 4 ° C).
      2. Avec précaution, retirez le surnageant de chaque tube. Puis placer les échantillons sur une pompe à vide pour sécher les pellets.
      3. Peser les boulettes, puis ajouter 300 µL de NaOH N 1 (2 g de NaOH à 50 mL d’eau ultrapure) par 1 mg de poids sec. Les incuber pendant 2 h à 37 ° C et puis centrifuger à 13 000 × g pendant 10 min.
      4. Prudemment, recueillir les surnageants avec une pipette et le transfert aux tubes de microcentrifuge, maintenir le culot.
      5. Une fois de plus, ajouter un volume égal de NaOH N 1 pour les tubes contenant des granulés et répétez les mêmes étapes que ci-dessus pour l’extraction d’ASP.
      6. Après incubation pendant 2 h, centrifuger les échantillons (13 000 x g pendant 10 min), collecter les surnageants soigneusement et ajouter aux surnageants recueillies précédemment.
      7. Pour la troisième extraction, répétez les mêmes étapes que ci-dessus, mais cette fois, ne pas incuber les échantillons pendant 2 h avant la centrifugation.
      8. Ensuite, ajouter trois volumes d’éthanol à 95 % dans chaque échantillon. Ensuite, les échantillons à −20 ° C pendant 18 h pour la précipitation de l’ASP en stock.
      9. Centrifuger les tubes (9 500 × g pendant 20 min à 4 ° C) et jeter le surnageant.
      10. Lavez chaque granule trois fois avec 75 % d’éthanol et sécher à l’air (mêmes procédures fait pour WSP). Remettre en suspension les pellets égal volume total de la première extraction avec NaOH N 1.
      11. Lire les échantillons pour la quantification de l’ASP à l’aide de la phénol-acide sulfurique (même en ce qui concerne l’analyse des FSSF).

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Résultats

Figure 2 affiche les résultats de Log10 UFC/mL de c. albicans après des traitements journaliers avec lumière rouge pour 1 min. rouge réduit significativement le Log10 UFC/mL par rapport à la NC (p = 0,004). La figure 3 présente les résultats de la biomasse (mg) de c. albicans biofilms après traitements quotidiens. Tous traités groupes ont montré de réduction de la biomasse par rapport à la ...

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Discussion

Les étapes plus critiques pour la culture réussie de c. albicans biofilms sont : 1) pour faire l’inoculum pré et l’inoculum dans un milieu YNB complété avec 100 mM de glucose ; 2) d’attendre 90 min pour la phase d’adhérence et de laver soigneusement deux fois les puits avec 0,89 % NaCl pour éliminer les cellules non-respecté ; et 3) pour ajouter le milieu RPMI pour les cellules adhérentes pour commencer la formation de biofilm, depuis RPMI stimulera la croissance d’hyphes. Aneuploïdies peuvent se produire lorsqu...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous remercions le Dr Paula da Silveira, Dr Cecília Atem Gonçalves de Araújo Costa, Shawn M. Maule, Shane M. Maule, Dr N. Martin José et Dr Iriana Zanin pour l’élaboration de cette étude. Nous remercions également m. Alexander D. Johnson (UCSF) pour le don de la souche analysée dans cette étude.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Clorhexidine 20 %  ;Sigma-AldrichC9394
Dextrose (D-Glucose) AnhydreFisher ChemicalD16-500
Éthanol 200 proofDecon LaboratoriesDSP-MD.43
LumaCare LC-122 A  ;LumaCare Medical Group, Newport Beach, CA, États-Unis.
NaCl  ;Fisher ChemicalS641-500
NaOH  ;Fisher Bioreagents  ;BP 359-500
Phénol 5 %Milipore Sigma843984
RPMI 1640 tamponné avec 3-(N-morpholino)SigmaR7755
Gélose au dextrose Sabouraud complétée par du chloramphénicolAcumedia7306A
Acide sulfurique  ;Fisher ChemicalSA200-1
Base d’azote de levureDifcoDF0392-15-9
Acide 3-(N-morpholino)propanesulfonique MOPSSigma-AldrichM1254
  ; Plaque de polystyrène à 24 puits  ;Faucon353935

Références

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