Simulant une Mission spatiale vers Mars à l’aide du membre postérieur déchargement et poids partielle portant chez le rat

Extraterrestres cibles, y compris la lune et Mars, représentent l’avenir de l’exploration spatiale humaine, mais les deux ont une gravité beaucoup plus faible que la terre. Alors que les conséquences de l’apesanteur sur le système musculo-squelettique ont été largement étudiées en astronautes^1,2,3,4,5 et rongeurs^{6, 7 , 8 , 9}, cette dernière grâce au membre postérieur bien établie déchargement (HLU) model¹⁰, très peu est connu sur les effets de gravité partielle. La gravité martienne est 38 % de la terre et cette planète est devenue le centre de l’exploration à long terme¹¹; Il est donc important de comprendre les altérations musculaires qui peuvent survenir dans ce paramètre. Pour ce faire, nous a développé un poids partielle portant (PWB) rats¹², issu des travaux précédent de souris^6,13, qui a été validé à l’aide de résultats aussi bien musculaires et osseuses. Cependant, l’exploration de Mars sera précédée par une période prolongée de microgravité, qui n’a pas abordée dans notre modèle précédemment décrit¹². Par conséquent, dans cette étude, nous altéré notre modèle pour simuler un voyage vers Mars, consistant en une première phase de déchargement total postérieur et immédiatement suivie d’une deuxième phase de roulement de poids partielle à 40 % de charges normales.

Contrairement à la plupart des modèles HLU, nous avons choisi d’utiliser un harnais pelvien (basé sur celui qui est décrit par Chowdhury et al.⁹) plutôt que d’une suspension de queue pour améliorer le confort des animaux et doit pouvoir se déplacer en toute transparence et sans effort de HLU au PTB en quelques minutes. Parallèlement, nous avons utilisé les cages et les dispositifs de suspension que nous avons précédemment développé et décrit abondamment¹². En plus de fournir des données fiables/cohérentes, nous aussi déjà démontré que le point d’attache fixe du système suspension au centre de la tige n’empêchait pas les animaux de déplacement, toilettage, alimentation ou de boire. Dans cet article, nous décrirons comment décharger des membres postérieurs des animaux (totalement ou partiellement), de vérifier leur niveau de gravité atteint, ainsi que la manière d’évaluer sur le plan fonctionnel les altérations musculaires qui en résultent, Agrippez-vous force et humides de la masse musculaire. Ce modèle serait extrêmement utile pour les chercheurs qui cherchent à étudier les conséquences de gravité partielle (artificielle ou extra-terrestre) sur un système musculo-squelettique déjà compromis, leur permettant d’étudier comment les organismes s’adaptent à partielle, rechargement et pour l’élaboration de contre-mesures qui pourraient être développés pour rester en santé pendant et après les vols habités.

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de Beth Israel Deaconess Medical Center sous le numéro de protocole 067-2016.

Remarque : Mâle Wistar rats âgés de 14 semaines au départ (jour 0) sont utilisés. Des rats sont logés individuellement en cages personnalisé 24h préalables de base permettant d’acclimatation.

1. déchargement du membre postérieur

Remarque : Le harnais pelvien peut être mis sur animaux anesthésiés ou éveillés. Ici, la description du protocole est donnée sur animaux anesthésiés. Porter le bon équipement de protection individuelle (EPI) pour traiter les animaux.

1. Placez le rat dans une boîte d’anesthésie avec 3,5 % isoflurane et un débit d’oxygène de 2 L/min.
   Remarque : Anesthetization correcte est confirmée quand une pincée de ferme de la patte arrière ne pas déclencher une réaction.
2. Une fois que l’animal est complètement anesthésié, placez le rat sur le banc avec gaz anesthésique venant d’une ogive avec 2 % isoflurane et une alimentation en oxygène de 1,5 L/min.
3. Placez le rat dans une position couchée et enfilez le harnais pelvien dans un mouvement rostro-caudal.
4. Plier le harnais pelvien pour fournir un confortable s’adapter tout en veillant à ne pas presser doucement les membres postérieurs pour éviter les écorchures et l’inconfort.
5. Fixer la chaîne d’acier inoxydable avec le fermoir pivotant sur le dessus du harnais pelvien, où un crochet est fixé à la base de la queue.
6. Retirez le rat de l’anesthésie et placer l’animal dans une cage personnalisée avec la chaîne étendue à son maximum.
7. Une fois que le rat est pleinement éveillée et mobile, raccourcir la chaîne à l’aide de la boucle supérieure pivotante jusqu'à ce que les membres postérieurs peuvent ne plus atteindre le sol.
8. Observer l’animal pendant quelques minutes afin d’évaluer son confort et s’assurer qu’à tout temps, les deux membres postérieurs restent complètement déchargé.

2. roulement de poids partielle

Remarque : Cette étape peut être réalisée chez l’animal éveillé et anesthésiés.

1. Convertir le dispositif de suspension HLU une suspension PWB en ajoutant la partie triangulaire composée de chaînes en acier inoxydable et d’une tige arrière.
2. Anesthésier l’animal suivant les mêmes procédures que détaillées pour la HLU (étapes 1.1 et 1.2).
3. Placez une veste d’attache de la taille appropriée sur les membres antérieurs du rat (M pour les rats de 400 g ou moins, L pour les rats pesant au-dessus de 400 g) et fermer à l’aide de la rallonge soutien-gorge dos.
4. Fixer un fermoir de la partie en forme de triangle au crochet situé sur le prolongateur de dos soutien-gorge et le fermoir opposé sur le crochet situé sur le harnais pelvien à la base de la queue.
5. Permettre à l’animal récupérer de l’anesthésie dans la cage. Une fois réveillé, vérifiez que la suspension est égale sur les membres antérieurs et les postérieurs en raccourcissant la chaîne et en modifiant l’emplacement de la boucle de pivot inférieur si nécessaire.
   Remarque : Cette étape peut également être réalisée à l’aide d’une plaque de force pour confirmer le chargement égal sur tous les membres.
6. Placez le rat sur le dessus de l’échelle pour enregistrer le poids de corps « chargé », c'est-à-dire, le poids de l’animal et l’ensemble de l’appareil, sans raccourcir la chaîne.
7. Raccourcir la chaîne jusqu'à ce que la balance affiche 40 % du poids corporel « chargé » et rendu l’atteint niveau de gravité (exprimée comme le rapport entre le poids à vide et le poids sous charge).
8. Observer l’animal pour s’assurer que le poids à vide est stable et que le rat est également chargé sur tous les membres.
9. Retirez l’ensemble de l’appareil à l’aide de la tige et replacez le rat dans sa cage.

3. Evaluation des pattes arrière poignée de force

1. Tenir le rat avec une retenue traditionnelle en mettant une main sous les pattes avant. Doucement, maintenez la queue avec la deuxième main.
2. Approcher le guidon avec les pattes arrière et assurez-vous que les deux pattes reposent entièrement sur la barre.
   Remarque : Si le rat ne pas pleinement prenez la barre ou n’affiche pas de toute évidence de préhension volontaire, relâcher légèrement le dispositif de retenue. Si cela échoue, le rat de retour à sa cage et réessayer après quelques minutes.
3. Tirez doucement le rat droite jusqu'à ce qu’il libère son emprise. Noter la force maximale affichée sur le transducteur.
4. Attendre environ 30 s entre les mesures et répéter le test 3 fois.
5. Calculer la moyenne des trois mesures de scoring, pour tenir compte de la fatigue.

4. enregistrement du muscle masse fraîche

1. Place le rat dans une chambre l’euthanasie de CO₂ . Après avoir attendu le moment opportun selon les lignes directrices IACUC et AVMA, confirmer l’euthanasie par une observation visuelle d’un manque de respiration.
2. Placez le rat sur la table de dissection dans une position couchée et enlever la fourrure et la peau par incision près de la cheville à l’aide de ciseaux de dissection petit. Utiliser les mains pour retirer la couche de la peau.
3. À l’aide de ciseaux de dissection petit, doucement briser l’aponévrose du muscle et isoler le tendon du calcanéum.
   Remarque : Le tendon du calcanéum est le point d’attache des muscles Gastrocnémiens et le muscle soléaire.
4. Tout en tenant le tendon du calcanéum avec une petite paire de pincettes, utiliser des ciseaux de dissection pour isoler les muscles Gastrocnémiens et soléaire du biceps femoris, situé au-dessus.
5. Une fois isolé, coupé du point d’attache des muscles Gastrocnémiens et soléaire dans la région poplitée.
6. Tirer le soléaire loin le gastrocnémien délicatement et détacher en coupant le tendon du calcanéum.
7. Place le rat dans une position en décubitus dorsal. Avec précaution, retirer le carénage et peler le jambier antérieur de la cheville dans un mouvement ascendant.
8. Couper le jambier antérieur à son point de fixation supérieur.
9. Enregistrer la masse humide exacte de chaque muscle excisé en utilisant une balance de précision taré et un bateau de pesage.

Profitant des nouvelles cages que nous avons déjà conçu et décrit en détail12, nous avons utilisé un dispositif de suspension axée sur la chaîne en acier inoxydable qui convient à la fois du membre postérieur déchargement (HLU, Figure 1) et partiel portantes (PWB, Figure 2). L’avantage essentiel de notre conception est la capacité d’aller d’un type de déchargement à l’autre en quelques minutes tout en maintenant un environnement identique pour les animaux. Nous avons utilisé un harnais pelvien sur mesure (Figure 2 a) qui est attaché à une chaîne unique sur mesure en acier inoxydable avec un fermoir pivotant sur chaque côté pour HLU. Afin de modifier ce dispositif de suspension et atteindre PWB, l’ajout d’une seule pièce en forme de triangle de chaîne inox incorporé une tige arrière rigide, conçue pour s’asseoir juste au-dessus de la colonne vertébrale (Figure 3) est la seule exigence. Ces étapes peuvent être réalisées chez l’animal éveillé ou anesthésié.

Avec l’environnement polyvalent fourni dans cette expérience, nous pourrions décharger avec succès le postérieur de tous nos animaux pendant 7 jours sans aucune complication et exposer rapidement à une gravité partielle à 40 % de leur charge normale (PWB40, moyenne atteinte niveau de gravité de 0,4076 g ± 0,0036 g). Au cours de la première semaine de HLU total, animaux a affiché une perte de poids significative (Figure 4 a:-7.19 ± 0,87 %, n = 9, p < 0,001), qui a été vu dans d’autres modèles de14et ne diffère pas sensiblement de ce que nous avons observé dans des rats exposés à PWB40 pour la même durée (-5.53 ± 1,44 %, n = 10, p = 0,37). Toutefois, animaux ont continué à perdre du poids au fil du temps tout en étant exposées ensuite à PWB40 (-9.06 % ± 1,35 % par référence, p < 0,0001).

Force de préhension des membres postérieurs est une mesure standard de la fonction musculaire qui peut être utilisée longitudinalement (Figure 4 b). Nous avons remarqué qu’une semaine de déchargement total conduit à une diminution moyenne de la force de préhension de 50,16 % ± 4,10 % par rapport au niveau de référence (p < 0,0001). Après une semaine ultérieure du poids partielle portant à 40 % de charges normales, nous a fait remarqué aucun changement concernant la force de préhension en outre (-44.29 ± 4,67 % par rapport au niveau de référence, p < 0,0001). À tous moments, la variation en pourcentage dans la force de préhension de la patte arrière était significativement différente des contrôles appariés selon l’âge (p < 0,0001 pour jour 7 et jour 14, n = 11). En outre, nous avons observé qu’après l’achèvement de l’étude, les animaux qui ont subi un déchargement total suivi poids partielle portant (HLU-PWB40) affichent une perte de force grip significativement plus élevée par rapport au groupe PWB40 (p = 0,03).

Muscle masse humide a été enregistré à la fin de l’expérience et par rapport aux données obtenues après deux semaines de chargement normal ou deux semaines de PWB40 (Figure 4) et les données précédemment publiées par notre groupe de12. Nous avons constaté que les groupes PWB40 et HLU-PWB40 ont significativement plus faible de masse du muscle soléaire (S), muscle gastrocnémien (G), mouillé et les muscles tibialis anterior (TA) que chez les témoins appariés selon l’âge (PWB100). En effet, nous avons enregistré une masse moyenne soléaire de 0,1681 g ± 0,007 g pour nos animaux qui était significativement plus faible que les rats exposés à PWB100 pendant 2 semaines dans nos expériences antérieures (-24.60 ± 3,18 %, p < 0,0001). Pour les jumelles, nous avons enregistré une moyenne masse humide de 2,192 g ± 0,096 g (-10.55 ± 3,93 %, p = 0,038 vs PWB100) et une masse humide de 0,759 g ± 0,029 g pour le jambier antérieur (-14.40 ± 3,27 %, p = 0,009 vs PWB100). Alors que notre jeu de données mis en évidence que les animaux exposés à une mission sur Mars analogue (HLU-PWB100) avaient une masse humide une diminution des muscles Gastrocnémiens et soléaire comparativement aux animaux exposés au PWB40 pendant 2 semaines continues (-8.75 ± 3,84 % et-5.85 % ± 4,14 %, respectivement), nous n’avons pas observé une différence significative entre ces deux groupes.

Figure 1 : Description des dispositifs de suspension et comment convertir de HLU PWB. (A) compte tenu de notre conception de la précédente, nous avons utilisé une barre en aluminium au dessus de la cage de tenir une suspension stable dispositif composé d’un anneau de clé sécurisé au centre de la tige (flèche 1), une chaîne d’acier inoxydable (flèche 2), et deux pivotantes fermoirs (flèche 3). (B) pour convertir le dispositif de suspension pour atteindre PWB, une structure de forme en triangle est attaché à l’aide de la boucle de pivot inférieur. Cette pièce est composée de chaînes en acier inoxydable et d’une tige arrière de polychlorure de vinyle (PVC) qui se situe au-dessus de rachis de rat (flèche 1). De chaque côté de la tige arrière est situé une agrafe pour fixer sur le harnais et la veste, respectivement (flèche 2). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : membre postérieur déchargement à l’aide d’un harnais pelvien. (A) frontaux et latéraux découvre des dessins de la structure du harnais utilisés pour soutenir les membres postérieurs des animaux. (B) le harnais pelvien a été positionné comme décrit pour exacten autour des membres postérieurs du rat. Le lien de l’acier inoxydable est placé au-dessus de la base de la queue et attaché à la boucle de l’émerillon. L’emplacement exact et la forme du faisceau peuvent varier entre animaux mais des rats doivent être à l’aise et il est nécessaire que leurs membres postérieurs ne jamais toucher le sol. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : poids partielle roulement. Le déchargement partiel nécessite l’ajout d’une veste à l’animal afin de soutenir les membres antérieurs. La veste est ensuite fermée avec une rallonge dos soutien-gorge et un crochet est fixé à l’extendeur, située entre les omoplates. Fois la veste et le harnais pelvien sont attachés à fermoirs situés à chaque extrémité de la tige arrière. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : exemples de suivi longitudinal chez les animaux exposés à des niveaux différents de déchargement. Poids de corps (A) changement (BW). Animaux ont été pesés par semaine sans le harnais ou vestes et le poids corporel a été enregistré. PWB100 = poids partielle portant à charges normales ; PWB40 = poids partielle portant à 40 % de charges normales ; HLU-PWB40 = une semaine du membre postérieur déchargement suivi d’une semaine de PWB40. Les résultats du test post-hoc de Tukey, suite à une analyse de variance empilé 2 voies sont présentés comme * : p < 0,05, ** : p < 0,01, *** : p < 0,001, et *** : p < 0,0001 vs PWB100. (B) changement de force de préhension de la patte arrière. Force de préhension hebdomadaire, arrière patte a été mesurée, et les résultats ont été exprimés en pourcentage de changement de ligne de base pour chaque animal. Les résultats du test post-hoc de Tukey, suite à une analyse de variance empilé 2 voies sont présentés comme *** : p < 0,001 et *** : p < 0,0001 vs PWB100, α : p < 0,05 vs PWB40. (C) Muscle masse fraîche après 14 jours. Muscle masse humide a été enregistré sur une échelle de précision immédiatement après le sacrifice à 14 jours. Les résultats sont présentés sous forme de pourcentage de la masse humide obtenue dans le groupe de témoins du même âge (PWB100). S = soléaire ; G = gastrocnémien ; TA = jambier antérieur. Les résultats du test post-hoc de Tukey, suite à une ANOVA à sont présentés comme * : p < 0,05, ** : p < 0,01, et *** : p < 0,0001 vs PWB100. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.