Article de méthode

Identification des facteurs nucléoleux pendant la réplication du VIH-1 par l'immunoprécipitation rev et la spectrométrie de masse

DOI :

10.3791/59329

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26 juin 2019

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1Molecular and Cellular Biology Department, Beckman Research Institute at the City of Hope, 2Irell & Manella Graduate School of Biological Sciences, 3Department of Molecular Immunology, Beckman Research Institute and the City of Hope

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ici nous décrivons Rev immunoprécipitation en présence de la réplication de HIV-1 pour la spectrométrie de masse. Les méthodes décrites peuvent être utilisées pour l'identification des facteurs nucléolaire impliqués dans le cycle infectieux du VIH-1 et s'appliquent à d'autres modèles de maladies pour la caractérisation des voies sous-étudiées.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le cycle infectieux du VIH-1 nécessite des interactions entre protéines virales et les facteurs hôtes pour faciliter la réplication, l'emballage et la libération virales. Le cycle infectieux nécessite en outre la formation de complexes protéiques viraux/hôtes avec l'ARN VIH-1 pour réguler l'épissage et permettre le transport nucléocytoplasmique. La protéine HIV-1 Rev accomplit l'exportation nucléaire des ARNm VIH-1 par la multimerisation avec des cibles introniques cis-action - l'élément de réponse Rev (RRE). Un signal de localisation nucléoliste (NoLS) existe dans le coOH-terminus du motif Rev arginine-riche (ARM), permettant l'accumulation de complexes Rev/RRE dans le nucléole. Les facteurs nucléolaux sont spéculés pour soutenir le cycle infectieux du VIH-1 par le biais de diverses autres fonctions en plus de la médiation de l'exportation nucléaire indépendante de l'ARNm et de l'épissage. Nous décrivons une méthode d'immunoprécipitation de type sauvage (WT) Rev par rapport aux mutations nucléoliennes de Rev (suppression et mutations de Rev-NoLS à point unique) en présence de la réplication de HIV-1 pour la spectrométrie de masse. Les facteurs nucléolaux impliqués dans le transport nucléocytoplasmique (nucléophosmin B23 et nucléoline C23), ainsi que les facteurs d'épissage cellulaire, perdent l'interaction avec Rev en présence de mutations Rev-NoLS. Divers autres facteurs nucléolaire, tels que la boîte C/D 58 du snoARN, sont identifiés pour perdre l'interaction avec les mutations Rev, mais leur fonction dans le cycle de réplication DU VIH-1 reste inconnue. Les résultats présentés ici démontrent l'utilisation de cette approche pour l'identification des facteurs nucléolaire viraux/hôtes qui maintiennent le cycle infectieux du VIH-1. Les concepts utilisés dans cette approche s'appliquent à d'autres modèles viraux et de maladies nécessitant la caractérisation de voies sous-étudiées.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le nucléole est postulé comme le terrain d'interaction de divers facteurs cellulaires et viraux nécessaires à la réplication virale. Le nucléolus est une structure complexe subdivisée en trois compartiments différents : le compartiment fibrillaire, le compartiment fibrillaire dense et le compartiment granulaire. La protéine HIV-1 Rev se localise spécifiquement dans les compartiments granulaires; cependant, la raison de ce modèle de localisation est inconnue. En présence de mutations à un seul point dans la séquence NoLS (Rev mutations 4, 5 et 6), Rev maintient un modèle nucléolif et a déjà été montré pour sauver la réplication VIH-1HXB2, cependant, avec une efficacité réduite par rapport à WT Rev1 . Toutes les mutations à un seul point sont incapables de soutenir le cycle infectieux VIH-1NL4-3. En présence de multiples mutations à un seul point dans la séquence NoLS (mutations Rev-NoLS 2 et 9), Rev a été observé pour se disperser dans le noyau et le cytoplasme et n'a pas été en mesure de sauver la réplication VIH-1HXB2 1. Le but de cette étude protéomique est de déchiffrer les facteurs cellulaires nucléolaux ainsi que non nucléolaux impliqués dans la voie infectieuse du VIH-1 médiée par le révérend. Les conditions d'immunoprécipitation de Rev sont optimisées par l'interaction avec la phosphoprotéine nucléolar B23, qui a été précédemment montrée pour perdre l'interaction avec Rev en présence des mutations nucléolaures.

Les facteurs cellulaires rev ont été largement étudiés dans le passé; cependant, ceci a été fait en l'absence de pathogénie virale. Une protéine, en particulier, qui est caractérisée dans cette étude par l'interaction Rev pendant la réplication du VIH-1 est la phosphoprotéine nucléolée B23 - également appelé nucléophosme (NPM), numatrine, ou NO38 chez les amphibiens2,3, 4. B23 est exprimé en trois isoformes (NPM1, NPM2, et NPM3) - tous les membres de la nucléophosmine/nucléoplasmin famille de chaperon nucléaire5,6. Le chaperon moléculaire NPM1 fonctionne dans l'assemblage approprié des nucléosomes, dans la formation de complexes protéiques/acides nucléiques impliqués dans les structures de chromatine d'ordre supérieur7,8, et dans la prévention de l'agrégation et dépliement des protéines cibles à travers un domaine central N-terminal (résidus 1-120)9. La fonctionnalité NPM1 s'étend à la genèse ribosome par le transport des particules préribosomal entre le noyau et le cytoplasme10,11, le traitement de l'ARN préribosomal dans la séquence d'espacer transcrit interne 12,13, et l'arrestation de l'agrégation nucléolaires de protéines au cours de l'assemblage ribosomal14,15. NPM1 est impliqué dans l'inhibition de l'apoptose16 et dans la stabilisation des suppresseurs de tumeur ARF17,18 et p5319, révélant son double rôle en tant que facteur oncogène et suppresseur de tumeur. NPM1 participe aux activités cellulaires de stabilité du génome, de réplication centrosome et de transcription. NPM1 se trouve dans les nucléoli pendant l'interphase de cycle cellulaire, le long de la périphérie chromosomique pendant la mitose, et dans les corps prenucléolaire (PNB) à la conclusion de la mitose. NPM2 et NPM3 ne sont pas aussi bien étudiés que NPM1, qui subit des niveaux d'expression altérés pendant la malignité20.

NPM1 est documenté dans l'étanchage nucléocytoplasmique de diverses protéines nucléaires/nucléolées par le biais d'un NES interne et NLS9,21 et a été précédemment signalé pour conduire l'importation nucléaire de HIV-1 Tat et Rev protéines. En présence de protéines de fusion B23-domaine-galactosidase, Tat se localise mal dans le cytoplasme et perd son activité de transactivation; cela démontre une forte affinité de Tat pour B232. Une autre étude a établi un complexe stable Rev/B23 en l'absence de RNAR contenant du RRE. En présence de l'ARNm RRE, Rev se dissocie de B23 et se lie de préférence à la RRE VIH, conduisant au déplacement de B2322. On ne sait pas où, au niveau subnucléaire, la transactivation de Tat et le processus d'échange de Rev de B23 pour l'ARNm VIH ont lieu. Les deux protéines sont postulées pour entrer dans le nucléole simultanément par l'interaction B23. On s'attend à ce que d'autres protéines cellulaires d'hôte se chez les personnes vivant dans la voie nucléolif du VIH. Les méthodes décrites dans cette enquête protéomique aideront à élucider l'interaction du nucléole avec les facteurs cellulaires d'hôte impliqués pendant la pathogénie de HIV-1.

L'enquête sur la protéomique a été lancée par l'expression de mutations à un seul point du Rev NoLS (M4, M5 et M6) et de multiples substitutions d'arginine (M2 et M9) pour la production de VIH-1HXB2. Dans ce modèle, une lignée cellulaire HeLa exprimant de façon stable le VIH-1HXB2 (HLfB) est transfectée avec des mutations nucléolaires WT Rev et Rev contenant une étiquette de drapeau à l'extrémité 3' La présence de WT Rev permettra à la réplication virale de se produire dans la culture HLfB, par rapport aux mutations Rev-NoLS qui ne sauvent pas l'insuffisance Rev (M2 et M9), ou permettent la réplication virale de se produire, mais pas aussi efficacement que WT Rev (M4, M5, et M6)1. Le lysate cellulaire est recueilli 48 h plus tard après la prolifération virale en présence de l'expression Rev et soumis à l'immunoprécipitation avec un tampon de lyse optimisé pour l'interaction Rev/B23. L'optimisation de la mémoire tampon de Lyse à l'aide de concentrations variables de sel est décrite, et les méthodes d'élution des protéines pour le VIH-1 Rev sont comparées et analysées dans des gels SDS-PAGE tachés d'argent ou de Coomassie. La première approche protéomique implique l'analyse directe d'un échantillon élucidé de WT Rev, M2, M6 et M9 exprimés par spectrométrie de masse en tandem. Une deuxième approche par laquelle les eluates de WT Rev, M4, M5, et M6 ont subi un processus d'extraction de gel est comparée à la première approche. L'affinité peptide aux mutations de Rev-NoLS par rapport à WT Rev est analysée et la probabilité d'identification de protéine affichée. Ces approches révèlent des facteurs potentiels (nucléolaure et nonnucléolaure) qui participent au transport et à l'épissage de l'ARNm 1 du VIH-1 avec Rev pendant la réplication du VIH-1. Dans l'ensemble, les conditions de lyse cellulaire, de propriété intellectuelle et d'élution décrites s'appliquent aux protéines virales d'intérêt pour la compréhension des facteurs cellulaires de l'hôte qui activent et régulent les voies infectieuses. Ceci est également applicable à l'étude des facteurs d'hôte cellulaire requis pour la persistance de divers modèles de maladie. Dans ce modèle de protéomique, HIV-1 Rev IP est optimisé pour l'interaction B23 pour élucider les facteurs nucléolaux impliqués dans l'activité de fermeture nucléocytoplasmique et la liaison de l'ARNm VIH-1. En outre, des lignées cellulaires exprimant de façon stable des modèles de maladies infectieuses déficientes pour les protéines clés d'intérêt peuvent être développées, semblables à la lignée cellulaire HLfB, pour étudier les voies infectieuses d'intérêt.

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Protocole

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1. Culture cellulaire

  1. Maintenir le HLfB dans le milieu d'aigle modifié de Dulbecco (DMEM) complété par 10% de sérum bovin foetal (FBS), 2 mM L-glutamine, et 1 mM de pyruvate de sodium dans les plaques de 100 mm traitées par la culture tissulaire. Maintenir les cultures cellulaires à 37 oC dansun incubateur humidifié fourni avec 5 % de CO 2. Passer les cellules confluentes à une densité cellulaire de 1 x 106 cellules/mL.
  2. Jetez le média de culture cellulaire. Rincer délicatement les cellules avec 10 ml de saline tamponnée par phosphate (PBS). Retirez et jetez le 1x PBS sans perturber la couche cellulaire.
  3. Ajouter 2 ml de 1x trypsine-EDTA solution aux cellules. Versons le plat pour enrober la monocouche et couver à 37 oC dans une chambre humidifiée pendant 5 min.
  4. Appuyez fermement sur le côté du plat avec la paume de la main pour détacher les cellules. Resuspendre les cellules détachées dans 8 ml de médias de culture fraîche. Faire tourner les cellules à 400 x g pendant 5 min.
  5. Jetez le support de culture sans perturber la pastille cellulaire. Resuspendre la pastille cellulaire dans 10 ml de médias de culture fraîche. Sous-culture 1 ml de cellules concentrées avec 9 ml de culture fraîche dans les plaques de 100 mm traitées par la culture des tissus.
    REMARQUE : Pour chaque mutation Rev-NoLS, les plaques de culture HLfB ou HeLa de 3x 100 mm donneront assez de lysate de protéine pour l'analyse de tache occidentale et la spectrométrie de masse. Ajoutez des plaques supplémentaires pour un contrôle positif WT Rev et un contrôle négatif. Le volume des cellules de sous-culture nécessitera une optimisation avec l'utilisation de différents types de cellules.

2. Expression des mutations Rev-NoLS-3'flag pendant la réplication du VIH-1

  1. Cultivez la culture cellulaire HLfB à une densité cellulaire de 2 x 106 cellules/mL. Préparer 4 ml de suspension phosphate-ADN de calcium pour chaque plaque de 100 mm comme suit.
    1. Étiqueter deux tubes de 15 ml de 1 et 2. Ajouter 2 mL de 2x HBS (0,05 M HEPES, 0,28 M NaCl, et 1,5 mM Na2HPO4 [pH 7.12]) au tube 1. Ajouter TE 79/10 (1 mM Tris-HCl et 0,1 mM EDTA [pH 7.9]) au tube 2. Le volume de TE 79/10 est de 1.760 ml - le volume de l'ADN.
    2. Ajouter 20 g de plasmide contenant la mutation Rev-NoLs-3'flag d'intérêt au tube 2 et mélanger son contenu par la résuspension. Ajouter 240 l de 2 M CaCl2 au tube 2 et mélanger à nouveau par la résuspension.
    3. Transférer le mélange de tube 2 dans le tube 1 dropwise, en mélangeant doucement. Laisser reposer la suspension à température ambiante pendant 30 min. Vortex les précipitations.
  2. Ajouter 1 ml de la suspension dans le sens de la chute à chacune des plaques de culture à 3 cellules de 100 mm tout en faisant tourbillonner doucement le support. Remettre les plaques dans l'incubateur et laisser le mélange de transfection pendant 6 h. Remplacer le mélange de transfection par 10 ml de culture fraîche et incuber les cellules pendant 42 h.

3. Collecte de lysate de protéine virale

  1. Jeter le support cellulaire 48 h posttransfection. Déposer chaque plaque de 100 mm sur un lit de glace. Étiquetez les tubes de 15 ml pour chaque échantillon de mutation Rev-NoLS et placez les tubes sur la glace.
  2. Rincer délicatement les cellules avec 10 ml de 1x PBS préréfrigéré sans perturber la couche cellulaire. Jeter le 1x PBS. Ajouter 3 mL de tampon de lyse (50 mM Tris-HCl [pH 8,0], 137 mM NaCl, et 1 % de détergent X-100 [voir la Table des matériaux]),traité avec un cocktail inhibiteur de la protéase, à chacune des plaques de 100 mm.
  3. Utilisez un grattoir cellulaire pour perturber la couche cellulaire. Inclinez la plaque et grattez doucement et rassemblez les cellules dans une piscine. Recueillir le lysate cellulaire à l'aide d'une micropipette de 1 000 l et mélanger les lysates cellulaires de chacune des trois plaques de 100 mm dans le tube préétiqueté de 15 ml.
  4. Incuber le lysate cellulaire sur la glace pendant 15 min, en vortexant toutes les 5 min. Centrifugeuse la cellule lysaté à 15 000 x g pendant 5 min.
  5. Recueillir le supernatant de protéines sans perturber la pastille de débris cellulaires et le transférer dans un autre tube stérile de 15 ml. Obtenir la concentration de lysate de protéine virale en utilisant la méthode Bradford (voir la section 4).
  6. Enregistrer un aliquot de l'échantillon d'entrée (20 g) pour l'analyse des immunoblots occidentaux. Ajouter 2x tampon d'échantillon (20% de glycérol, 0,02% bleu bromophenol, 125 mM Tris-Cl [pH 6.8], 5% SDS, et 10% 2-mercaptoethanol) au volume final. Faites-le bouillir à 95 oC pendant 10 min, et conservez l'échantillon d'entrée à -20 oC.

4. Bradford d'assay

REMARQUE : Préparer 10x albumine de sérum bovin (BSA) à partir du stock 100x BSA avant de générer des courbes standard de protéines.

  1. Aliquot eau dans les tubes de microcentrifuge pour le blanc suivant et les normes: Blank 800 L; Norme 1 à 2 mg/ml, 798 oL; Norme 2 à 4 mg/ml, 796 oL; Norme 3 à 6 mg/ml, 794 oL; Norme 4 à 8 mg/ml, 792 l; Norme 5 à 10 mg/mL, 790 oL Aliquot 10x BSA selon les normes désignées suivantes : Norme 1 à 2 l; Norme 2 à 4 l; Norme 3 à 6 l; Norme 4 à 8 l; Norme 5 à 10 l.
  2. Préparer un mélange d'échantillons de protéines en mélangeant 795 l'eau avec 5 ll d'échantillons de protéines. Ajouter 200 l de réagent de colorant d'analyse de protéine (voir le tableau des matériaux)à chaque échantillon blanc, standard, et protéine. Vortex les échantillons brièvement pour un mélange uniforme et couver à température ambiante (18-20 oC) pendant 5 min.
  3. Transférer les échantillons de blanc, de normes et de protéines dans les cuvettes. Mesurer les concentrations protéiques à une OD de 595 nm.

5. Coimmunoprécipitation du Rev-NoLS-3'flag

  1. Rincer 25 l de perles de gel d'affinité M2 (voir le Tableau des matériaux) avec 500 lde de tampon de lyse, traité avec un cocktail inhibiteur de la protéase. Rincer plus de perles de gel d'affinité pour chaque échantillon de mutation et contrôles.
    REMARQUE : Préparez suffisamment de perles de gel d'affinité M2 pour deux gels (50 l) - l'un pour l'analyse d'immunoblot occidental et l'autre pour la coloration des protéines et la spectrométrie de masse.
  2. Faire tourner à 820 x g pendant 2 min à 4 oC. Retirez le supernatant. Rincer 2fois de plus.
  3. Ajouter le lysate de protéine virale (1 mg/mL dans 5 ml de volume total) aux perles d'affinité M2 prérinées. Ajuster le volume total à l'aide de la mémoire tampon de lyse.
  4. Incuber la réaction pendant 3 h, en tournant à 4 oC. Centrifugeuse des perles d'affinité M2/lysate de protéine virale à 820 x g pendant 1 min.
  5. Recueillir le supernatant et enregistrer un aliquot de l'échantillon post-IP (20 g) pour l'analyse immunoblot occidentale. Mesurer la concentration protéique du lysate post-IP. Recueillir 20 g pour l'immunoblotting occidental.
  6. Ajouter un tampon d'échantillon 2x au volume final. Faites-le bouillir à 95 oC pendant 10 min, et stockez l'échantillon post-IP à -20 oC.
  7. Rincer les perles M2 avec 750 l de tampon de lyse et laver les perles sur un rotateur à 4 oC pendant 5 min. Centrifuger les perles M2 à 820 x g et jeter le supernatant.
  8. Répétez les étapes 5.7 pour deux autres lavages sur un rotateur à 4 oC pendant 5 min. Après le troisième lavage, retirez toute trace de tampon de lyse du complexe de perles M2/co-IP à l'aide d'une longue pointe de chargement de gel.
    REMARQUE : Pincez l'extrémité de la pointe de gel-chargement avec des pinces plates avant d'enlever toutes les quantités de trace du tampon de lyse. Cela permettra d'éviter la perturbation et l'apaisement des perles M2.
  9. Resuspendre les perles M2 dans 55 ll de tampon de chargement 2x. Faire bouillir l'échantillon à 95 oC pendant 10 min.
  10. Chargez 25 ll d'éluhesur deux gels SDS-PAGE distincts (un gel pour l'immunoblotting occidental et l'autre pour la coloration Coomassie).

6. Préparation des gels SDS-PAGE

  1. Lancer deux gels de résolution SDS-acrylamide de 15 % en mélangeant les réactifs suivants dans un tube de 50 ml (à un volume final de 40 ml, assez pour quatre gels) : 4,16 ml d'eau ultrapure, 15 ml d'acrylamide de 40 % :bisacrylamide (29:1), 10 ml de 1,5 M Tris-HL (pH 8.8) , 400 L de 10 % de SDS, 400 L de 10 % de persulfate d'ammonium et 40 L de TEMED.
  2. Mélanger le gel de résolution en inversant le tube de 50 ml plusieurs fois. Pipette le mélange de gel de résolution dans un appareil de gel occidental prénettoyé (quatre gels - trois pour l'immunoblotting occidental et un pour Coomassie/coloration d'argent).
  3. Doucement pipette assez d'eau pour couvrir la couche supérieure du mélange de gel. Laissez le gel de résolution polymériser.
  4. Verser la couche d'eau du gel de résolution, à l'aide d'un essuie-glace délicat (voir la Table des Matériaux)pour absorber tout excès d'eau.
  5. Lancer deux gels d'empilement SDS-acrylamide de 5 % en mélangeant les réactifs suivants dans un tube de 50 ml (à un volume final de 20 ml, assez pour quatre gels): 11,88 ml d'eau ultrapure, 2,5 ml d'acrylamide de 40% :bisacrylamide (29:1), 5,2 ml de 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8) , 200 L de 10 % de SDS, 200 L de 10 % de persulfate d'ammonium et 20 L de TEMED.
  6. Mélanger le gel d'empilage en inversant le tube de 50 ml plusieurs fois. Pipette le mélange de gel d'empilage au-dessus du gel de résolution au dessus de l'appareil.
  7. Placez un peigne à cassette en gel contenant le nombre approprié de voies dans le gel d'empilage. Absorber tout débordement du mélange de gel à l'aide d'un essuie-glace délicat (voir le Tableau des matériaux). Laissez le gel d'empilage polymériser complètement.
  8. Inondez l'appareil de gel occidental avec 1x tampon de fonctionnement occidental (5x concentration : 250 mM Tris-Cl [pH 8.3], 1,92 M de glycine, 0,5 % de SDS et 10 mM EDTA).
  9. Tirez doucement le peigne à cassette de gel du gel d'empilage. Laissez le tampon de fonctionnement 1x ouest pour remplir les puits de chargement. Rincer chaque puits avec un tampon de fonctionnement 1x western à l'aide d'une seringue avant de charger les échantillons.
  10. Chargez les échantillons d'immunoblot occidentaux dans chaque gel correspondant (échantillons d'entrée, échantillons coimmunoprécipités et échantillons post-IP). Chargez les marqueurs de protéines de gel de l'Ouest.
  11. Chargez les échantillons coimmunoprécipités pour la coloration Coomassie/argent dans un autre gel. Chargez les marqueurs de protéines de gel de l'Ouest.
  12. Connectez l'appareil de gel en marche à une source d'alimentation et exécutez les gels à 100 V jusqu'à ce que le colorant de chargement atteigne le gel de résolution. Augmenter la tension à 140 V jusqu'à ce que le colorant de chargement atteigne le fond du gel de résolution.

7. Transfert de blot occidental

  1. Démonter l'appareil de gel occidental. Trancher et jeter le gel d'empilage, en laissant le gel de résolution intact.
  2. Transférer délicatement les gels résolvants sur un plateau propre rempli de tampon de transfert occidental (25 mM Tris, 194 mM de glycine, 0,005% SDS, 20% de méthanol) et les faire tremper pendant 15 min.
  3. Assembler l'appareil de transfert de gel comme suit.
    1. Couper trois membranes de transfert PVDF et six morceaux de papier filtre (voir le tableau des matériaux)à la taille du gel de résolution.
    2. Faire tremper la membrane PVDF dans du méthanol pendant 5 min. Hydratez-la dans l'eau pendant 5 min. Placez la membrane PVDF dans le tampon de transfert occidental jusqu'à ce qu'elle soit prête à l'utiliser.
    3. Placez la cassette de porte-gel dans une plaque à pâtisserie en verre remplie partiellement de tampon de transfert occidental, avec le côté noir au fond.
    4. Placez un tampon de mousse imbibé de tampon de transfert occidental contre le côté noir de la cassette de porte-gel.
    5. Mouillez un morceau de papier filtre dans le tampon de transfert occidental et placez-le sur le dessus du tampon de mousse. Placer le gel résolvant sur le papier filtre.
      REMARQUE : Placez le gel de résolution dans l'orientation de chargement correcte à transférer à la membrane PVDF.
    6. Placez une membrane de transfert PVDF sur le gel de résolution. Mouillez un morceau de papier filtre avec un tampon de transfert occidental et placez-le sur la membrane de transfert PVDF.
    7. Placez un autre tampon de mousse imbibé de tampon de transfert occidental sur le papier filtre. Pliez délicatement le côté blanc de la cassette de porte-gel sur le dessus du tampon de mousse trempé. Verrouillez la cassette.
    8. Placez la cassette de support de gel dans l'assemblage d'électrode d'appareil de transfert. Répétez les étapes 7.3.4-7.3.8 pour chaque gel de résolution restant.
    9. Remplissez le réservoir de l'appareil de transfert avec un tampon de transfert occidental. Placer une tige remuante dans le réservoir de l'appareil.
    10. Placer le réservoir de l'appareil sur une plaque à remuer. Ajustez le réglage de remuer à 5-6, en vous assurant que la barre d'agitation n'est pas coincée ou en frappant les cassettes de porte de gel.
    11. Connectez l'appareil de transfert de gel à une source d'alimentation et transférez le gel à 100 V pendant 1 h à 4 oC.

8. Immunoblotting

  1. Retirez la cassette du porte-gel et placez le côté noir contre une plaque à pâtisserie en verre propre. Ouvrez la cassette et jetez soigneusement le tampon de mousse et le papier filtre. Marquez un coin de la membrane PVDF pour identifier la bonne orientation de chargement. Gardez la membrane humide.
    REMARQUE : La membrane PVDF peut être séchée à l'air et stockée dans un contenant propre et scellé. Réhydratez la membrane en répétant les étapes 7.3.2.
  2. Placez la membrane dans 100 ml de solution de blocage (5 % de lait, 1x SCT et 0,1 % d'entre eux 20). Bloquer la membrane par bascule douce à température ambiante (18-20 oC) pendant 1 h.
  3. Couper la membrane au-dessus du marqueur protéique de 25 kDa. Placez la partie supérieure de la membrane, contenant des bandes protéiques de plus de 25 kDa, dans la solution de blocage contenant b23 souris monoclonal IgG1 (1:500 dilution). Bloquer toute la nuit, en se balançant à 4 oC.
  4. Placez la partie inférieure de la membrane, contenant des bandes protéiques inférieures à 25 kDa, dans la solution de blocage contenant M2 souris monoclonal IgG1 (1:1,000 dilution, voir le tableau des matériaux). Bloquer toute la nuit, en se balançant à 4 oC.
  5. Laver la membrane 3x pendant 10 min en 25 ml de solution de lavage occidentale (1x TBS, 0,1% Tween 20) sur une plate-forme à bascule.
  6. Incuber les membranes dans la chèvre-anti-souris IgG1-HRP (1:5,000 dilution) diluée dans la solution de blocage pendant 1 h à température ambiante. Laver la membrane 3x pendant 10 min en 25 ml de solution de lavage occidentale sur une plate-forme à bascule.
  7. Préparer le substrat de blotting occidental de chemiluminescence. Utilisez une micropipette p1000 pour ajouter le substrat à la membrane.
  8. Développer chaque membrane dans le substrat de blotting occidental de chemiluminescence pendant 5 min. Enlevez la membrane du substrat. Absorber l'excès de substrat à l'aide d'un essuie-glace délicat (voir le Tableau des matériaux).
  9. Placez la membrane dans un protecteur de feuille propre scotché à l'intérieur d'une cassette. Emmenez la cassette dans une pièce sombre et placez une feuille de film dans la cassette. Verrouillez la cassette en place et incubez pendant 5 à 15 min. Retirez le film de la cassette et développez-le.

9. La coloration de Coomassie

  1. Démonter l'appareil de gel occidental. Trancher et jeter le gel d'empilage, en laissant le gel de résolution intact. Transférer délicatement le gel résolvant sur un plateau propre rempli de 25 ml d'eau ultrapure.
  2. Incuber le gel sur une plate-forme de bascule pendant 15 min. Utilisez un basculement doux pour empêcher le gel résolvant de se briser. Jeter l'eau ultrapure et répéter l'étape de lavage 2x plus.
    REMARQUE : Si des bulles DeSD demeurent après les étapes de lavage, le gel peut être lavé dans de l'eau ultrapure pendant la nuit. Les SDS résiduels peuvent causer une coloration de fond élevée du gel.
  3. Mélanger le réactif à la tache Coomassie en inversant la bouteille (voir la Table des Matériaux). Placer 100 ml de réactif à la tache Coomassie pour couvrir le gel résolvant et incuber le gel sur une plate-forme de bascule pendant 1 h. Jetez le réactif de tache de Coomassie et lavez le gel dans l'eau déionisée sur une plate-forme de bascule pendant 15 min.
  4. Jeter l'eau déionisée. Répétez l'étape de lavage 2x plus. Continuer à laver le gel jusqu'à ce que la résolution désirée des bandes protéiques soit observée.

10. Coloration argentée

  1. Démonter l'appareil de gel occidental. Trancher et jeter le gel d'empilage, en laissant le gel de résolution intact. Transférer délicatement le gel résolvant sur un plateau propre rempli de 25 ml d'eau ultrapure.
  2. Incuber le gel sur une plate-forme de bascule pendant 15 min. Utilisez un basculement doux pour empêcher le gel résolvant de se briser. Jeter l'eau ultrapure et répéter l'étape de lavage 2x plus.
    REMARQUE : Si des bulles DeSD demeurent après les étapes de lavage, le gel peut être lavé dans de l'eau ultrapure pendant la nuit. Les SDS résiduels peuvent causer une coloration de fond élevée du gel.
  3. Fixez le gel dans 30% d'éthanol: 10% solution d'acide acétique (6:3:1 eau:ethanol:acide acétique) pendant la nuit à température ambiante. Laver le gel dans une solution d'éthanol de 10 % pendant 5 min à température ambiante. Remplacer la solution d'éthanol et laver pendant encore 5 min.
  4. Préparer la solution de travail de sensibilisation du kit de tache argentée pierce en mélangeant un sensiplusateur de tache argenté d'une partie avec 500 parties d'eau ultrapure (50 l de sensitizer avec 25 ml d'eau ultrapure). Incuber le gel résolvant dans la solution de travail de sensibilisation pendant 1 min. Laver le gel dans de l'eau ultrapure pendant 1 min, remplacer l'eau, et laver le gel à nouveau pendant 1 min.
  5. Préparer la solution de travail de tache en mélangeant l'améliorateur de tache argenté d'une partie avec la tache argentée de 50 parties (500 l d'exhausteur avec 25 ml de tache argentée). Incuber le gel dans la solution de travail de tache pendant 30 min.
  6. Préparer la solution de travail développeur en mélangeant 1 partie d'amélioration de tache d'argent avec 50 parties de développeur de taches d'argent (500 l d'améliorateur avec 25 ml de développeur). Préparer 5% solution d'acide acétique comme solution d'arrêt. Laver le gel avec de l'eau ultrapure pendant 1 min, remplacer l'eau, et laver le gel pendant 1 min supplémentaire.
  7. Remplacer l'eau par une solution de travail du développeur et incuber jusqu'à ce que l'intensité souhaitée de la bande protéique soit résolue (5 min). Remplacez la solution de travail du développeur par une solution stop et incubez pendant 10 min.

11. Réduction in-gel, alkylation et digestion des bandes de gel tachées de Coomassie

  1. Couper les bandes de gel du gel à l'aide d'une lame de rasoir propre. Couper chaque bande de gel en cubes d'environ 5 mm et les placer dans un tube microcentrifuge propre de 0,5 ml.
  2. Détainles les morceaux de gel en les recouvrant de 100 mM de bicarbonate d'ammonium en 1:1 acétonitrile :eau à température ambiante pendant 15 min. Jetez le supernatant. Répétez cette étape.
  3. Sécher les morceaux de gel pendant 5 min dans une centrifugeuse sous vide. Réduire les protéines en recouvrant les morceaux de gel séché s'il y a 10 mM de dithiothreitol en 100 mM de bicarbonate d'ammonium et en les incubant pendant 1 h à 56 oC.
  4. Pipette hors de tout supernatant. Alkyler les protéines en recouvrant les morceaux de gel avec 100 mM d'iodoacétamide dans l'eau et en les incubant pendant 1 h à température ambiante dans l'obscurité.
  5. Pipette hors du supernatant et rétrécir les morceaux de gel en les recouvrant avec de l'acétonitrile et en les secouant doucement à température ambiante pendant 15 min. Pipette outre du supernatant et reswell les morceaux de gel en les recouvrant avec le bicarbonate d'ammonium de 100 mM et en les secouant doucement à température ambiante pendant 15 min.
  6. Répétez l'étape 11.5. Sécher les morceaux de gel pendant 5 min dans une centrifugeuse sous vide.
  7. Couvrir les morceaux de gel avec de la trypsine modifiée de séquençage de 50 ng/L (voir le Tableau des matériaux)en bicarbonate d'ammonium de 100 mM. Laisser gonfler le gel pendant 5 min; puis, pipette hors de toute solution restante. Couvrir les morceaux de gel avec 100 mM de bicarbonate d'ammonium et leur permettre de regonfler complètement, en ajoutant 100 mM supplémentaires de bicarbonate d'ammonium afin que les morceaux de gel soient complètement recouverts.
  8. Incuber les morceaux de gel pendant la nuit à 37 oC. Arrêtez la réaction en ajoutant 1/10 du volume de 10% d'acide formique dans l'eau. Recueillir le supernatant de chaque tube.
  9. Extraire les morceaux de gel en les recouvrant de 1% d'acide formique dans 60% d'acétonitrile et les incuber pendant 15 min avec des secousses douces.
  10. Réduire le volume des supernatants combinés à moins de 20 l dans une centrifugeuse sous vide, tout en prenant soin d'éviter de sécher complètement les supernatants. Ajouter 1 % d'acide formique pour ramener le volume total à 20 l.

12. Chromatographie liquide/spectrométrie de masse

REMARQUE : Les échantillons ont été analysés à l'aide d'un spectromètre de masse équipé d'ultra HPLC, d'une source de nanospray et d'une colonne (voir le Tableau des matériaux). Les solvants A et B sont respectivement de 0,1 % d'acide formique dans l'eau et l'acétonitrile.

  1. Chargez les protéines digérées en flacons d'ausampler en polypropylène à haute récupération. Chargez les flacons dans le gestionnaire d'échantillons d'un système UPLC.
  2. Injecter 6 ll de chaque échantillon. Chargez chaque échantillon sur la colonne de piégeage du nanotile pendant 1,5 min à 8 l/min, à l'aide d'un solvant A/1 % solvant B à 99 %.
  3. Élilez les peptides dans le spectromètre de masse avec un gradient linéaire de 3 % à 35 % du solvant B sur 30 min, suivi d'un gradient de 35 % à 50 % du solvant B sur 4 min et de 50 % à 90 % du solvant B sur 1 min. Maintenir 90 % d'acétonitrile pendant 3 min; puis réduire le %B à 3% sur 5 min.
  4. Acquérir des données spécifiques de masse de profil ionique positif en mode résolution (20 000 résolutions). Acquérir des données de 100 à 2 000 Da à un taux d'une analyse par 0,6 s. Acquérir des données en mode MSE en alternant les balayages sans énergie de collision et les balayages avec l'énergie de collision élevée.
  5. Pour l'énergie de collision élevée, rampez l'énergie de collision dans la cellule Trap de 15 V à 40 V. Acquerlez un balayage de masse de serrure tous les 30 s, en utilisant l'ion no 2 de [Glu1]-Fibrinopeptide B comme masse de verrouillage. Acquérir un fichier de données à l'aide d'une injection blanche de solvant A, en utilisant la même méthode d'acquisition entre chaque paire d'échantillons pour contrôler le report.

13. Analyse des données pour la spectrométrie de masse

  1. Copiez les fichiers de résultats de spectrométrie de masse à l'ordinateur exécutant une plate-forme de recherche quantitative et qualitative en protéomique (p. ex., ProteinLynx Global Server). L'analyse des données est très intensive en CPU et doit être effectuée sur un ordinateur d'analyse de données distinct et performant.
  2. Créez un nouveau projet pour les données. Créez une nouvelle plaque de microtimètre représentant la plaque d'autosampler. Attribuez les échantillons à la même position dans la plaque de microtiter que leur position dans l'autosampler.
  3. Attribuez à chaque exemple de paramètres de traitement. Les paramètres à utiliser sont la largeur de pointe chromatographique automatique et la résolution MSTOF; seuil de faible énergie, 100 comptes; seuil d'énergie élevée, 5 dénombrements; seuil d'intensité, 500 comptes.
  4. Attribuez à chaque exemple de paramètres de flux de travail. Les paramètres à utiliser sont la base de données, l'humain concatenated SwissProt et le VIH, avec des séquences inversées; tolérance automatique au peptide et aux fragments; min fragment ion correspond par peptide, 3; min fragment ion correspond par protéine, 7; min peptide correspond par protéine, 1; réactif de digestion primaire, trypsine; clivages manqués, 1; réactifs modificateurfixefixe, carbamidomethyl C; réactifs modificateurs variables, oxydation M; fausse découverte, 100.
  5. Sélectionnez les échantillons et choisissez Process Latest Raw Data. Lorsque la recherche est terminée, sélectionnez les échantillons et choisissez Les données d'exportation à l'échafaud (version 3). Ouvrez L'échafaudage, créez un nouveau fichier et importez chaque fichier exporté à partir de la plate-forme protéomique comme un nouveau bioéchantillon utilisant la quantitation des ions précurseurs.
  6. Lorsque tous les fichiers ont été importés, passez à l'écran de données de charge et d'analyse. Sélectionnez la même base de données utilisée pour les données de recherche et d'importation à l'aide de la notation LFDR et du groupement standard de protéines à l'échelle de l'expérience. Définir les options d'affichage à la probabilitéd'identification des protéines , le seuil de protéines à 20%, le nombre minimum de peptides à 1, et le seuil de peptide à 0% au cours de l'analyse.

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Résultats

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Rev-NoLS single- et multiple-point mutations arginine, correspondant à une variété de modèles de localisation subcellulaire, ont été examinés dans leur capacité à interagir avec les facteurs de l'hôte cellulaire par rapport à WT Rev. WT Rev-3'flag et pcDNA-flag vecteur ont été exprimés dans la culture HLfB. Des complexes de protéine ont été traités du lysate total de cellules et souillés avec le réactif argenté de tache. Rev-NoLS-3'flag est détectable (environ 18 kDa) dans trois conditions tampons de lyse différ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Des analyses spectrométriques de masse comparant les mutations Rev-NoLS et WT Rev en présence du VIH-1 ont été évaluées pour comprendre les facteurs nucléolaux impliqués dans le cycle de réplication virale. Ceci identifierait les composants nucléolaux requis pour l'infectiosité virale. Le nucléolar B23 a une forte affinité avec Rev-NoLS et fonctionne dans la localisation nucléolif du Rev3 et le transport nucléocytoplasmique des ARNM du VIH 22 . L'affinité du B23 avec les mu...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs reconnaissent la Dre Barbara K. Felber et le Dr George N. Pavlakis pour la culture adhérente du HLfB fournie par le National Institutes of Health (NIH) AIDS Research and Reference Reagent Program, Division of AIDS, National Institute of Allergy and Infectious maladies (NIAID), NIH. Les auteurs reconnaissent également les sources financières fournies par les NIH, Grants AI042552 et AI029329.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Acide acétiqueFisher ChemicalA38S-212
AcétonitrileFisher ChemicalA955-500
Acrylamide :BisacrylamideBioRadd’ammonium
Fisher ChemicalA643-500
Persulfate d’ammoniumSigma-Aldrich7727-54-0
ANTI-Flag M2 affinité gelSigma-AldrichA2220
anti-Flag M2 souris monoclonales IgGSigma-AldrichF3165
BioMax MS filmCarestream8294985
Bio-Rad Protein Assay Concentré de réactifs de colorant, 450 mLBio-Rad5000006
B23 souris monoclonales IgGSanta Cruz Biotechnologiessc-47725
Bleu de bromophénolSigma-AldrichB0126
Lait écrémé en poudre CarnationNestléN/A
Racleurcellulaire ThermoFisher Scientific179693PK
C18IonKey nanoTilecolumn Waters186003763
Corning 100 mm Boîtes de culture traitées TCFisher Scientific08-772-22
DithiothreitolThermo ScientificJ1539714
1 x DPBSCorning21-030-CVRS
ECL Substrat de transfert EsternPierce32106
Éthanol, 200 proofFisher ChemicalA409-4
FBSGibco16000044
Acide formiqueFisher ChemicalA117-50
Gel Code réactif de coloration bleueThermoFisher24590
GlycérolFisher Chemical56-81-5
chèvre-anti-souris IgG-HRPSanta Cruz Biotechnologiessc-2005
IodoacétamideACROS Organics122270050
KimWipe essuie-glace KimberlyClark Professional34120
L-glutamineGibco
MéthanolFisher Chemical67-56-1
NanoAcuity UPLCWatersN/A
Pierce Silver Stain KitThermo Scientific24600df
15 mL Tube conique en polypropylèneFalcon352097
Échelle de protéines précolorées, 10 à 180 kDaThermo Scientific26616
Cocktail d’inhibiteurs de protéaseRoche4693132001
Purified BSANew England BiolabsB9001
PVDF  ; Membrane western blotRoche3010040001
Pyruvate de sodiumGibco11360070
10 x TBSFisher BioreagentsBP2471500
TEMEDBioRad1610880edu
Triton X-100 solution détergenteBioRad1610407
Trizaic sourceEauxN/A
trypsine-EDTACorning25-051-CIS
Tween 20Spectromètre de masse BioRad1706531
Synapt G2WatersN/A
Whatman papier filtreTisch Scientific10427813
1610158 Bicarbonate 25030081

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Rev du VIH 1mutations Rev NoLStransport nucl ocytoplasmiquenucl ophosmine B23nucl oline C23snoRNA bo te C D 58coloration au Coomassie

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