Visualisation de la structure des ganglions lymphatiques et de la localisation cellulaire à l'aide de la microscopie confocale ex-Vivo

Summary

Ce protocole décrit une technique pour imager différentes populations de cellules dans les ganglions lymphatiques drainants sans altérations dans la structure d'organe.

Abstract

Les ganglions lymphatiques (LN) sont des organes répartis dans le corps, où les réponses immunitaires innées peuvent se connecter à l'immunité adaptative. En fait, les LN sont stratégiquement interposés dans le chemin des vaisseaux lymphatiques, permettant le contact intime des antigènes de tissu avec toutes les cellules immunitaires résidentes dans le LN. Ainsi, la compréhension de la composition cellulaire, de la distribution, de l'emplacement et de l'interaction à l'aide de l'imagerie LN complète ex vivo permettra d'ajouter à la connaissance sur la façon dont le corps coordonne les réponses immunitaires locales et systémiques. Ce protocole montre une stratégie d'imagerie ex vivo à la suite d'une administration in vivo d'anticorps fluorescents qui permet une méthodologie très reproductible et facile à réaliser en utilisant des microscopes confocals conventionnels et des réactifs. Grâce à l'injection sous-cutanée d'anticorps, il est possible d'étiqueter différentes populations cellulaires dans le drainage des LN sans affecter les structures tissulaires qui peuvent être potentiellement endommagées par une technique conventionnelle de microscopie d'immunofluorescence.

Introduction

Les ganglions lymphatiques (LN) sont des organes en forme d'ovoïde largement présents dans tout le corps avec la fonction cruciale de combler les réponses immunitaires innées et adaptatives. Les LN filtrent la lymphe afin d'identifier les particules étrangères et les cellules cancéreuses pour monter une réponse immunitaire contre eux¹. Les cellules de présentation d'antigènes (APC), les lymphocytes T et les cellules B travaillent aux côtés pour générer des anticorps spécifiques à l'antigène (immunité humoristique) et des lymphocytes cytotoxiques (immunité cellulaire) pour éliminer les particules étrangères et les cellules cancéreuses

Protocol

Le protocole a été approuvé par le Comité permanent des animaux de la Harvard Medical School et du Brigham and Women's Hospital, protocole 2016N000230.

1. Souris utilisées pour l'expérience

1. Utilisez des souris mâles et femelles de 8 semaines sur le fond B6 pour administrer le mélange d'anticorps.
2. Utilisez des souris CX3CR1^GFP/WTCCR2^RFP/WT pour déterminer si l'imagerie LN entière ex vivo peut également être appliquée à des souris reporters sans administrer de mélange d'anticorps ainsi que pour étudier la présence de cellules mononucléaires, y compris la présentation d'antigènes cellules et phagocytes....

Results

Ce manuscrit présente des techniques pour enlever les ganglions lymphatiques inguinaux et popliteal sans endommager leur structure à la suite de l'injection d'anticorps fluorescents pour tacher des populations cellulaires spécifiques dans ces organes (figure1 et figure 2 ).

La combinaison puissante de l'immunolabeling des cellules de LN avec BV421 anti-CD4 et BB515 anti-CD19 et l'analyse de formation image confocale a défini la locali.......

Discussion

La combinaison de l'imagerie avec d'autres techniques, y compris la biologie moléculaire et l'immunophénotypage de haute dimension a amélioré notre capacité d'étudier les cellules immunitaires dans leur contexte natif. En fait, alors que d'autres approches peuvent nécessiter la digestion des tissus et l'isolement cellulaire - ce qui peut conduire à la perte de l'intégrité des tissus - l'utilisation de l'imagerie in vivo ou ex vivo accorde un grand avantage dans l'étude de différents sous-types cellulaires d'une manière g.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BV421 anti-CD4	BD Horizon	562891	GK1.5 ; 0,2 mg mL-1
BB515 anti-CD19	BD Horizon	564509	1D3 ; 0,2 mg mL-1
BB515 Rat IgG2a, &kappa ; Contrôle des isotypes	BD Horizon	564418	R35-95 ; 0,2 mg mL-1
BV421 Souris IgG2b, K Contrôle des isotypes	BD Horizon 562603		R35-38 0,2 mg mL-1
Cellview Plat de culture	Greiner-Bio	627861	35x10 mm avec fond en verre
Seringues à insuline	BD Plastipak-Insulin		U-100
Kimwipes	Kimtech Science Marque	7557	taille 21 x 20 cm / 100 feuilles par boîte
Pince incurvée de microchirurgie	Instruments chirurgicaux WEP sur	mesure	12,5 cm
Ciseaux incurvés de microchirurgie	Instruments chirurgicaux WEP fabriqués	sur mesure	11,5 cm
Aiguille	BD PrecisionGlide-30		jauge & temps ; ½ ; pouce
Nikon Eclipse Te + A1R tête confocale	Nikon	-	chargé avec 4 lignes laser principales (405, 488, 543 et 647 nm)
PE anti-F4/80	BD Pharmigen	565410	T45-2342 ; 0,2 mg mL-1
PE Rat IgG2a, &kappa ; Isotype Control	BD Pharmigen	553930	R35-95 ; 0,2 mg mL-1
Zeiss LSM 710 Microscope confocal Zeiss avec			4 lignes laser principales (405, 488, 543 et 647 nm)