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Article de méthode

Un modèle orthotopic de cancer de l'endomètre avec lymphadénopathie rétropéritonel fabriqué à partir de cellules VX2 propagées et cultivées

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DOI :

10.3791/59340

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12 septembre 2019

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1Institute of Medical Science, University of Toronto, 2Department of Obstetrics and Gynecology, University of Toronto, 3Guided Therapeutics Laboratory, TECHNA Institute, University Health Network, 4Department of Pathology, Princess Margaret Cancer Center, University Health Network, 5Department of Medical Biophysics, University of Toronto, 6Princess Margaret Cancer Center, University Health Network, 7Techna Institute, University Health Network, 8Department of Surgery, University of Toronto, 9Department of Otolaryngology, Head and Neck Surgery, University of Toronto, 10Division of Gynecologic Oncology, University of Toronto /Princess Margaret Cancer Center, University Health Network, 11Princess Margaret Cancer Center, University Health Network

Dans cet article

Résumé

Ce protocole présente une méthode normalisée pour cultiver des cellules VX2 dans la culture et pour créer un modèle orthotopic VX2 du cancer de l'endomètre avec des métastases rétropéritonéales de ganglion lymphatique chez les lapins. Les modèles orthotopiques de cancer de l'endomètre sont importants pour l'étude préclinique des modalités d'imagerie nouvelles pour le diagnostic des métastases de ganglion lymphatique.

Résumé

Le cancer de l'endomètre est la malignité gynécologique la plus courante en Amérique du Nord et l'incidence augmente dans le monde entier. Le traitement consiste en une chirurgie avec ou sans traitement adjuvant en fonction de la participation des ganglions lymphatiques telle que déterminée par lymphadenectomy. Lymphadenectomy est une procédure morbide, qui n'a pas été montrée pour avoir un avantage thérapeutique dans beaucoup de patients, et ainsi une nouvelle méthode pour diagnostiquer des métastases de ganglion lymphatique est exigée. Pour tester de nouveaux agents d'imagerie, un modèle fiable de cancer de l'endomètre avec métastases rétropéritones des ganglions lymphatiques est nécessaire. Le modèle de cancer endomètre vX2 a été décrit fréquemment dans la littérature ; toutefois, il existe des variations importantes en ce qui concerne la méthode d'établissement du modèle. En outre, aucune étude n'a rapporté sur l'utilisation de cellules VX2 cultivées pour créer ce modèle que seules les cellules propagées in vivo ont été précédemment utilisés. Ici, nous présentons une méthode chirurgicale normalisée et une méthode de surveillance postopératoire pour l'établissement du modèle de cancer de l'endomètre VX2 et rapportons sur la première utilisation des cellules VX2 cultivées pour créer ce modèle.

Introduction

Le cancer de l'endomètre, ou cancer de la muqueuse de l'utérus, est la deuxième malignité gynécologique la plus commune dans le monde et la malignité la plus commune dans les nations développées1. L'incidence du cancer de l'endomètre n'a cessé d'augmenter, augmentant de 2,3 % par an entre 2005 et 2013, avec une augmentation correspondante de 2,2 % de la mortalité1,2,3. Le diagnostic des métastases de ganglion lymphatique est primordial car la présence des ganglions lymphatiques positifs est un prédicteur négatif fort de la survie4,5,6,7et peut guider l'administration de thérapie adjuvante8,9,10,11,12,13. Les métastases des ganglions lymphatiques sont actuellement diagnostiquées en enlevant chirurgicalement le tissu lymphatique qui recense les principaux vaisseaux sanguins du bassin et de l'abdomen. Cette procédure, connue sous le nom de lymphadenectomy, est controversée en raison des données contradictoires de survie de deux grands essais14,15,16,17,18 et le connu risque de15,19,20 et morbidité postopératoire21,22,23. Comme les modalités actuelles d'imagerie non invasive n'ont pas la sensibilité et la spécificité requises pour remplacer la dissection24des ganglions lymphatiques, il y a eu une poussée pour développer de nouvelles techniques d'imagerie diagnostique. Pour tester ces nouvelles techniques dans un cadre préclinique, un modèle fiable de cancer de l'endomètre avec métastases rétropéritones des ganglions lymphatiques est nécessaire.

Le modèle de tumeur de lapin VX2 est un modèle bien établi qui a été employé intensivement pour étudier les tumeurs pleines humaines multiples d'organe25 comprenant le poumon26,la tête et le cou27,28, foie29,rein30, os31,32, cerveau33, pancréas34 et utérus35,36,37. Le modèle VX2 a été initialement développé en 1940 par Kidd et Rous38 en transplantant avec succès un virus du papillome de lapin à queue de coton découvert par Shope en 193339. Depuis lors, le modèle VX2 a été maintenu in vivo, nécessitant un passage en série dans le muscle quadriceps de lapins blancs de Nouvelle-Zélande40. Plus récemment cependant, plusieurs groupes ont réussi à cultiver des cellules VX2 in vitro40,41,42 et a démontré la tumorigénéité retenue de la lignée cellulaire cultivée31, 42,43. Les tumeurs vX2 sont histologiquement définies comme carcinomes squamous anapicieux de cellules44 et contiennent des dispositifs glandulaires qui ressemblent à l'adénocarcinome26. Les tumeurs sont caractérisées par la facilité d'implantation, la croissance rapide et l'hypervascularité44,45 et métastasé de façon fiable, le plus souvent aux ganglions lymphatiques régionaux et éloignés45. Les similitudes dans l'anatomie vasculaire et lymphatique utérine46 aussi bien que le site de croissance orthotopic assurent que le modèle métastatique du carcinome de Lapin VX2 imite celui du cancer humain d'endomètre, faisant le modèle de VX2 un modèle fiable pour étudier l'humain métastatique. En outre, les dispositifs histologiques tels que la prolifération microvasculaire anormale47, aussi bien que les similitudes immunologiques48 et génétiques49,50 entre les humains et les lapins suggèrent que la tumeur microenvironnement peut refléter celui du cancer de l'endomètre humain.

Plusieurs groupes ont fait rapport sur l'utilisation de VX2 pour créer un modèle de cancer de l'endomètre avec métastases rétropéritoéneavecles avec un taux élevé de réussite signalé36,51,52; cependant, il existe des variations significatives dans la littérature actuelle en ce qui concerne la méthode de création de modèles. Des doses de suspension cellulaire aussi bas que 4 x 105 cellules/corne utérine51 et aussi haut que 5 x 109 cellules/corne utérine37,53 ont été rapportées sans consensus standard sur la dose cellulaire VX2 requise. En outre, une série de méthodes d'inoculation ont été rapportées comprenant l'implantation micro-chirurgicale de la tumeur dans le myometrium utérin36,injection de suspension de cellules de VX237,44,52 , 53 et dans certains cas, l'ajout de la suture de corne utérine avant l'innoculation52. Enfin, aucun groupe n'a signalé l'utilisation de cellules VX2 cultivées pour créer ce modèle. Ainsi, le but de cette étude est de démontrer une méthode normalisée réussie de création de modèle de VX2 et de rapporter la première utilisation des cellules cultivées de VX2 pour créer un modèle du cancer d'endomètre avec des métastases rétropéritoéines dans un lapin.

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Protocole

Fermeture profonde de la paroi abdominale : Identifiez le sommet de l'incision péritonéale et saisissez le péritoine, le rectus muscle et le fascia avec des forceps de tissu. Toutes les études sur les animaux ont été menées dans des installations approuvées par le Réseau universitaire de santé du Centre de ressources animales (ARC) et conformément aux protocoles approuvés d'utilisation et de soins des animaux (AUP #3994/#4299). La lignée cellulaire VX2 a été obtenue du laboratoire du Dr Aken au Réseau universitaire de santé.

1. Création d'une lignée cellulaire VX2 in vitro

  1. Récoltez la tumeur de VX2 du muscle de quadricep de lapin et la croissance dans le flanc de souris.
    1. Décongeler les blocs tumoraux VX2 congelés (1 cm x 1 cm), hacher sur une plaque de culture à l'aide d'une lame de scalpel et passer à travers un filtre de 70 m en ajoutant de petites quantités de solution de sel équilibrée Hanks (HBSS) séquentiellement pour s'assurer que toutes les cellules sont tendues pour un volume final de 1 ml.
    2. Compter les cellules et diluer avec 0,9% de phosphate tamponné solution saline à une concentration de 1 x 107/mL et placer sur la glace dans un tube stérile.
      REMARQUE : Des blocs de tumeur ont été obtenus d'un collaborateur de laboratoire de la propagation précédente des tumeurs de VX2 dans les muscles de quadriceps de lapin.
    3. Anesthésiez un lapin blanc femelle de Nouvelle-Zélande (poids 2,5-3,5 kg) avec 2-5% d'isoflurane inhalé, retirez la fourrure qui recense le site d'injection et nettoyez le site d'injection avec une solution povidone-iode. Injecter 500 l de la suspension vX2 préparée (5 x 106 cellules/mL) dans le muscle quadriceps du lapin. Surveiller le lapin cliniquement pour la croissance tumorale à partir du jour 10.
    4. Euthanasier les lapins après que les tumeurs atteignent 1-1,5 cm de diamètre (mesuré à l'extérieur avec des étriers) en utilisant une méthode approuvée par le vétérinaire. Confirmer l'euthanasie en vérifiant les signes vitaux, y compris la fréquence cardiaque et la fréquence respiratoire. Accise la tumeur à l'aide d'instruments stériles après le nettoyage de la zone avec la solution de bêtadine.
    5. Dans une armoire de sécurité biologique à l'aide d'instruments stériles, hacher la tumeur en petits morceaux (0,2 cm) sur un plat de culture tissulaire de 10 cm à l'aide d'une lame de scalpel. Passer les fragments de tumeur à travers une passoire de cellules de 70 m à l'aide de 1 ml de HBSS tel que décrit à l'étape 1.1.1. Comptez les cellules et diluez à l'aide d'une solution saline de 0,9 % pour obtenir 7,5 x 105 cellules dans 200 L.
    6. Anesthésier les souris gamma nod scid mâles NOD (poids 25 g) en utilisant 4% d'isoflurane à 1 L/min et maintenir l'anesthésie en utilisant 2% d'isoflurane. Une fois que les souris sont anesthésiées, injectez 200 L de la solution à partir de l'étape 1.1.5 dans le tissu sous-cutané du flanc de la souris à l'aide d'une aiguille de 27 jauges.
  2. Récolte et passage des cellules VX2 in vitro
    1. Surveiller la croissance du xénogreffe cliniquement deux fois par semaine jusqu'à ce que les tumeurs atteignent 1 cm de diamètre à l'aide de calipers.
    2. Euthanasier les souris en plaçant dans une chambre de CO2 ou en effectuant une luxation cervicale après l'anesthésie avec 4% de gaz isoflurane. Exciser les tumeurs dans des conditions stériles dans un coffret de sécurité biologique.
    3. Mince tumeurs avec un scalpel en morceaux de 1-2 mm dans un plat de culture tissulaire de 6 cm contenant 3 ml de Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM)/Ham F12MD 10% fetal bovine serum (FBS) media.
    4. Laissez les fragments tumoraux intacts dans un incubateur de 37 oC avec 5 % de CO2 pendant deux jours jusqu'à ce que les cellules commencent à se développer à partir des morceaux tumoraux. Par la suite, vérifiez quotidiennement les plaques cultivées par microscopie légère pour vérifier la confluence cellulaire. En atteignant 70% de confluence, trypsiniser les cellules en ajoutant 1 ml de trypsine de 0,05% au flacon et en remettant dans l'incubateur de 37 oC pendant 5 min.
    5. Neutraliser la trypsine avec 6 ml de F12 DMEM/Ham , 10% fbS moyen, recueillir les cellules et la centrifugeuse à 4 oC pendant 5 min à 300 x g. Retirez le supernatant et suspendez à nouveau les granulés dans 3,5 mL de nouveaux médias F12 DMEM/Ham,10 % FBS. Graine de collagène frais de 6 cm J'ai enduit les assiettes de 1,6 x 106 cellules par assiette pour atteindre environ 50% de densité d'ensemencement cellulaire.
      REMARQUE : La densité cellulaire de50 % désigne les cellules qui prennent 50 % de la surface de la plaque lorsqu'elles sont fixées.
    6. Passaging précoce : Répétez le processus ci-dessus (trypsinisation, ensemencement) jusqu'à ce que les cellules aient été passages 5 fois, puis évaluez la pureté de la lignée cellulaire avec PCR à l'aide d'un test quantitatif DE PCR pour distinguer l'ADN génomique du lapin de l'ADN génomique de souris (voir l'étape 1.3.1-1.3.4).
      REMARQUE : Après 8 passages, les cellules peuvent être propagées sur les plaques de culture régulière de tissu adhérent de non-collagen enduit.
    7. Passage, trypsiniser et congeler les aliquots des cellules dans DMEM/HAM F12-30% FBS-10%DMSO à une concentration de 2 x 106 par flacon. Conserver les cellules dans de l'azote liquide jusqu'à ce qu'elles soient nécessaires aux expériences.
  3. Confirmation de l'origine VX2 des cellules survivantes :
    1. Créez un traitement standard à partir de l'ADN génomique purifié de souris et de lapin (étape 1.3.2 et étape 1.3.3). Utilisez des amorces qui ciblent des séquences spécifiques aux espèces dans le deuxième cadre de lecture ouverte de l'élément rétrotransposon LINE-1.
      REMARQUE: Les séquences d'apprêt pour CRPV E6 sont: 5'- GATCCTGGACCCAACCAGTGand 5'-CCTGCCGGTCCCTGATTTAT. Les éléments de rétrotransposon LINE-1 ont été utilisés. Les séquences d'apprêt pour lapin LINE-1 sont les suivante : 5'-TCAGGAAACCCCAGAAAGTATGC et 5'-TTTGATTTCTTGAATGACCCAGTGT Les séquences d'apprêt pour la souris LINE-1 sont : 5'-AATGGAAAGCCACATTCACGTG et 5'-CCTTCCTTTGAgAgAGAGAGAGAG
    2. Pour créer une courbe standard pour CRPV E6, purifier le lysate de cellule tumorale VX2 (étape 1.1.1) à l'aide d'un kit commercial suivant le protocole du fabricant. Quantifier cet ADN à l'aide d'un test commercial. Effectuez 6 dilutions en série de 225 pg/L à 0,925 pg/L dans un tampon EDTA-TE faible. Pour créer une courbe standard pour l'ADN génomique de la souris, diluer 100 g d'ADN génomique commercial de souris dans un tampon EDTA-TE faible en 5 dilutions de 125 pg/L jusqu'à 0,0125 pg/L.
    3. Placer 4 L de chaque solution diluée à partir des échantillons de l'étape 1.3.2 dans les puits et exécuter des échantillons dans un thermocycler PCR. Utilisez les valeurs Cq de chaque course avec les montants d'ADN par puits pour calculer une courbe standard à l'aide des paramètres de seuil automatique du logiciel thermocycler.
    4. Utilisez des procédures qPCR standard pour effectuer le PCR avec 40 cycles de vélo en 2 étapes (98 oC et 60 oC) sur un thermocycleur. Établissez des valeurs de seuil, et fixez les valeurs delta Ct à 'gt;35 pour s'assurer qu'il y a une contamination minimale de souris dans la lignée cellulaire VX2 du lapin. Le volume total de chaque réaction était de 10 L, soit 5 L de Mastermix 2x, 1 L d'amorces avant et inverses avec une concentration finale d'apprêt en réaction à 250 nM, et 4 l d'échantillon d'ADN.
      REMARQUE: S'il vous plaît voir les références54,55 pour plus de détails sur l'exécution PCR. Les valeurs de seuil sont établies, et les valeurs delta Ct sont fixées à 'gt;35 pour s'assurer qu'il y a une contamination minimale de la souris dans la lignée cellulaire VX2 du lapin. Le niveau recommandé d'ADN VX2 pour une détection fiable par qPCR est de 1-10 pg.

2. Culture cellulaire VX2 et création de suspension cellulaire

  1. Décongeler les flacons contenant des cellules VX2 (congelées à l'étape 1,2,7) dans un bain d'eau à 37 oC pendant 1 minute et transférer les cellules dans un tube conique de centrifugeuse avec 10 ml de milieu de culture (1:1 DMEM/F-12 - 10 % FBS et 1 % pénicilline-streptomycine). Centrifugeuse pendant 8 min à 107 x g,jeter le supernatant et re-suspendre la pastille cellulaire dans 9 ml de support.
  2. Transférer les cellules resuspendues dans un grand flacon de culture. Incuber les cellules sans trembler à 37 oC. Vérifiez les cellules quotidiennement pour la confluence à l'aide de la microscopie légère et changer les médias de culture tous les trois jours.
  3. Création de suspension de cellules VX2 cultivée pour l'injection
    1. Trypsiniser les cellules en ajoutant 3 ml de 0,25% de trypsine à flacon une fois que les cellules ont atteint 80% confluence. Placer le flacon dans un incubateur (37 oC) pendant 5 min. Transférer la solution dans un tube conique de centrifugeuse et une centrifugeuse pendant 8 min à 107 x g, puis retirer le supernatant.
    2. Laver les granulés de cellules 3 fois avec 9 ml de phosphate tamponné saline, centrifugeuse et enlever supernatant comme ci-dessus. Comptez les cellules et diluez avec une solution saline tamponnée de phosphate de 0,9 % à une concentration de 4 x 107 cellules/mL et placez-les dans un tube de centrifugeuse conique stérile sur la glace.
  4. Création d'une suspension cellulaire VX2 progated in vivo pour injection
    1. Décongeler les blocs tumoraux VX2 congelés (1 cm x 1 cm), hacher sur une plaque de culture à l'aide d'une lame de scalpel et passer à travers un filtre de 70 m comme à l'étape 1.1.1. Ajouter de petites quantités de HBSS séquentiellement pour s'assurer que toutes les cellules sont tendues pour un volume final de 1 ml. Compter les cellules et diluer avec 0,9% de phosphate tamponné saline à une concentration de 1 x 107/mL et placer sur la glace dans un tube stérile.
      REMARQUE : Des blocs de tumeur ont été obtenus d'un collaborateur de laboratoire de la propagation précédente des tumeurs de VX2 dans les muscles de quadriceps de lapin.

3. Établissement modèle chirurgical

  1. Établissement de l'anesthésie chirurgicale et de la préparation préopératoire
    1. Prémédicer les lapins blancs de Nouvelle-Zélande (2,5-3,5 kg) 1 h avant l'intervention chirurgicale prévue à l'aide d'injections d'acépromazine (1 mg/kg de MMI) et de méloxicam (0,2 mg/kg SQ). Anesthésiez un lapin blanc femelle de Nouvelle-Zélande (poids 2,5-3,5 kg) avec 2-5% d'isoflurane inhalé, retirez la fourrure qui recense le site d'injection et nettoyez le site d'injection avec une solution povidone-iode.
    2. Lapins anesthésiés intubants utilisant une voie aérienne de masque laryngé (LMA) et fixent en place avec le ruban adhésif, maintenant l'anesthésie profonde en titrant la dose inhalée d'isoflurane entre 2-5%. Surveiller régulièrement l'anesthésie chirurgicale tout au long de l'intervention en vérifiant les signes vitaux (taux respiratoire, recharge capillaire, saturation en oxygène si disponible) et en surveillant les signes suggérant une douleur (mouvement, sevrage des stimuli, bruits) ou de la lumière anesthésie (mouvement, mastication sur tube LMA).
      REMARQUE: Cela devrait être fait par quelqu'un avec l'expérience de surveillance de l'anesthésie chirurgicale.
    3. Placez un cathéter de 22 calibres dans la veine dorsale marginale. Administrer la cefazolin (20 mg/kg) par voie intraveineuse 10 min avant l'incision chirurgicale de la peau.
    4. Clip cheveux sur le bassin et l'abdomen avant de placer le lapin sur la table d'opération, puis placer les lapins dans une position dorsal sur la table d'opération. Nettoyez le champ chirurgical à l'aide d'une préparation chirurgicale en 3 étapes de la peau (savon de bêtadine, solution de chlorhexidine, solution de bêtadine). Draper le champ chirurgical avec des rideaux de laparotomie après avoir marqué la terre du dessus de l'os pubien, laissant une zone de 5 cm x 5 cm du bas-ventre exposée.
  2. Création de l'incision laparotomie et identification des cornes utérines
    1. Mettez un bonnet chirurgical et un masque facial. Frotter les mains à l'aide de chlorhexidine ou de solution de gommage chirurgical à la bêtadine. À l'aide d'une technique stérile, enfilez une robe stérile et des gants chirurgicaux stériles.
    2. À l'aide d'un scalpel à 11 lames, faire une incision de 2,5 cm de long de 1 cm crânienne au pubis de symphyse à travers la peau et les tissus sous-cutanés de l'abdomen du lapin. Inciser le rectus fascia et disséquer les muscles rectus latéralement pour exposer le péritoine sous-jacent. Entrez dans le péritoine brusquement après s'être assuré que le sous-sol est dégagé de l'intestin ou d'autres organes abdominaux.
    3. Localiser les cornes utérines identifiant la vessie et balayant un doigt ganté de façon supérieure, postérieure et latérale au-dessus de l'apex de la vessie.
      REMARQUE : Si nécessaire, la vessie complète peut être vidée à l'aide d'une pression numérique. Une fois localisé, apportez les cornes utérines par l'incision abdominale pour se reposer sur la paroi abdominale.
    4. À l'aide d'une suture absorbable tressée de 3 à 0, effectuer une seule ligature de suture de chaque corne utérine d'environ 1,5 à 2,0 cm distale pour les cervices. Placez la suture juste médiale aux artères utérines, qui courent le long de l'aspect latéral de chaque corne. Attachez les sutures confortablement pour obstruer les cornes utérines distales (Figure 1).
  3. Inoculation myometrial VX2
    1. À l'aide d'une aiguille de calibre 27, injectez 0,5 ml de la suspension cellulaire VX2 préalablement préparée à partir de l'étape 2.3.2 (pour le modèle VX2 cultivé) ou de 2,4 (pour le modèle VX2 propiedisé in vivo) dans le myometrium de chaque corne utérine proximale au site de suture (entre le site de suture et le col de l'utérus). Injectez plus d'une minute et assurez-vous que les cellules ne sont pas injectées dans la cavité utérine sous-jacente. Anesthésier les animaux à l'isoflurane inhalé (2-5%) et une machine anesthésique avec un circuit Bain.
    2. Appliquer une pression sur le site d'injection myometrial e pendant 30 s après injection pour minimiser les fuites de cellules. Inspectez les sites d'injection et de suture pour l'hémostase et placez les cornes utérines dans l'abdomen.
  4. Fermeture de l'incision chirurgicale
    1. Fermeture profonde de la paroi abdominale : Identifiez le sommet de l'incision péritonéale et saisissez le péritoine, le rectus muscle et le fascia avec des forceps de tissu.
      1. Pour ce faire, ancrer la suture à un sommet de l'incision en suçant superficielle à profonde d'un côté de l'incision et profonde à superficielle de l'autre. Attachez un noeud. À l'aide de la suture attachée, faire des points de course perpendiculaires à l'incision à travers les couches de la paroi abdominale en travaillant pas à pas le long de l'incision d'un côté à l'autre. Attachez la suture et coupez.
    2. Fermeture superficielle de la paroi abdominale : Identifiez le sommet de l'incision cutanée et suturez la peau abdominale à l'aide de sutures sous-cuticulaires sous-cuticulaires 3-0 absorbables enfouies. Appliquer de la colle chirurgicale sur l'incision fermée pour s'opposer aux bords de la peau.
      1. Pour ce faire, ancrer la suture à un sommet de l'incision, en suçant profondément à superficiel d'un côté de l'incision et superficielle à profonde de l'autre. Attachez un noeud. À l'aide des sutures jointes, faire des points de course dans la couche cutanée parallèle à l'incision de travail étape-sage le long de l'incision d'un côté à l'autre. Attachez la suture et coupez.
  5. Soins postopératoires
    1. Réveil de l'anesthésie : Éteignez l'isoflurane une fois l'incision fermée et laissez le lapin respirer de l'oxygène par masque tout en surveillant les signes d'éveil (p. ex., mouvements spontanés, ouverture des yeux et mouvements de mastication sur les voies respiratoires du masque laryngé). Extubez le lapin une fois que ces signes sont notés et fournissez l'oxygène par le masque et une couverture chaude jusqu'à ce que les lapins soient alertes et capables de s'asseoir indépendamment.
    2. Surveillance postopératoire : Surveillez les lapins deux fois par jour pendant 4 jours et tous les jours pendant 10 jours supplémentaires après l'opération. Pour surveiller, évaluer leur état général, leur consommation de nourriture et d'eau, la sortie d'urine et de matières fécales, l'évaluation de la douleur, le poids, les signes vitaux (fréquence cardiaque, fréquence respiratoire) et leur site chirurgical à la recherche d'enflure, d'érythème, de décharge ou de déhiscence.
    3. Contrôle de la douleur postopératoire : Administrer Meloxicam tous les jours (0,2 mg/kg SQ) pendant 48 h après l'opération, puis au besoin en fonction de l'évaluation de la douleur. Administrer la buprénorphine immédiatement postopératoirement et toutes les 12 h (0,01-0,05 mg/kg SQ) pendant 24 h, puis au besoin en fonction de l'évaluation de la douleur
    4. Les antibiotiques (enrofloxacine 5mg/kg IM) peuvent être administrés quotidiennement pendant sept jours après l'opération pour prévenir l'infection des plaies comme recommandé par votre vétérinaire. Administrer des liquides sous-cutanés (15 ml de SQ) deux fois par jour, au besoin, pour la déshydratation et les aliments mous ou d'autres suppléments alimentaires sont fournis quotidiennement au besoin pour la perte de poids.

4. Surveillance de la croissance tumorale

  1. Surveillance clinique : Surveillez les lapins tous les 2 jours pour détecter les signes cliniques de croissance tumorale à partir du jour postopératoire 14. Les signes cliniques de la croissance de tumeur peuvent inclure la prise orale diminuée, la léthargie, la tendresse abdominale, la masse abdominale palpable et la perte de cecotrophy.
  2. Imagerie et surveillance invasive
    1. Imagerie par tot : Le jour postopératoire 21-28, prémédication, anesthésie, et intubé des lapins comme précédemment décrit dans 3.1.1-3.1.2. Placez les lapins dans une position dorsale dans un scanner préclinique et obtenez des images du bassin et de l'abdomen après avoir administré 10 ml d'agent de contraste d'iophéxol intraveineux.
    2. Surveillance chirurgicale : Transférer les lapins à la salle d'opération après l'imagerie alors qu'ils sont encore sous anesthésie générale. Positionner, préparer et draper les lapins comme décrit précédemment à l'étape 3.1.4 et effectuer une incision répétée laparotomie d'environ 1,5 cm de longueur à travers l'incision précédente. Identifiez les cornes et les cornes utérines et examinez soigneusement pour la tumeur. Fermez l'incision et fournissez des soins postopératoires comme décrit précédemment à l'étape 3.5.2-3.5.4.
    3. Utilisation du modèle de lapin : Si les lapins se trouvent pour avoir des tumeurs au moment de la surveillance chirurgicale, emploient des modèles de cancer de l'endomètre de lapin pour des expériences prévues. Utilisez des lapins créés à partir de cellules proéragtées in vivo pour des expériences supplémentaires à 4 semaines après l'inoculation et utilisez des modèles de lapins créés à partir de cellules VX2 cultivées à environ 5-6 semaines après l'inoculation pour tenir compte de la croissance plus lente de la tumeur. Euthanasier les lapins après que les tumeurs atteignent 1-1,5 cm de diamètre (mesuré à l'extérieur avec des étriers) en utilisant une méthode approuvée par le vétérinaire. Confirmer l'euthanasie en vérifiant les signes vitaux, y compris la fréquence cardiaque et la fréquence respiratoire. Accise la tumeur à l'aide d'instruments stériles après le nettoyage de la zone avec la solution de bêtadine.

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Résultats

Vingt-huit lapins ont été utilisés pour la création du modèle du cancer de l'endomètre. Les lapins avaient un poids moyen de 2,83 kg (2,71-3,58 kg) au moment de l'expérience. Les tumeurs utérines ont avec succès grandi dans 21 lapins pour un taux global de succès de modèle de 75%. Avant l'inclusion de la suture utérine dans le protocole, le taux de réussite était de 57% comparé à 81% après que la suture utérine ait été ajoutée. La suture utérine a été ajoutée au protocole après le 7e...

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Discussion

Ici, nous avons rapporté une méthode chirurgicale normalisée pour l'établissement d'un modèle de cancer de l'endomètre VX2 et rapporté sur la première utilisation des cellules VX2 cultivées pour créer ce modèle. Le taux de prise de tumeur de 75% est inférieur au taux de 100% pour cent précédemment rapporté dans la littérature35,37,53,56; cependant, thw 90% taux de métastases pathologiquement co...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

Cette étude a été financée par l'Institut de recherche Terry Fox (PPG-1075), l'Institut canadien de recherche en santé (Fondation Grant #154326), l'Institut de recherche de la Société canadienne du cancer (704718), le Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada, Fondation pour l'innovation et Fondation Du Cancer Princess Margaret.

Je tiens à remercier le Dr Marguerite Akens d'avoir fourni les cellules VX2 initiales pour l'établissement du modèle VX2 initial et des blocs tumoraux VX2 congelés. Je tiens à remercier Marco DiGrappa pour avoir aidé à effectuer des expériences initiales de culture cellulaire VX2 et Lili Ding pour aider à la culture cellulaire VX2.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Scalpel à 11 lames, Stérile, DisposibleAspen Surgical (VWR)80094-086
Cathéter veineux auriculaire à 22 gaguesCDMV14332
Suture poly-filament résorbable résorbable 3-0 (Polysorb)Suture
3-0 (Polysorb)Crépine à cellules Covidien356718
70uM, Emballé individuellement, NylonFalcon352350
Acépromazine (Atravet)CDMV1047
Savon à la bétadine (Poviodone iode 7,5 %)CDMV4363
Solution de bétadine (Poviodone iode 10 %)UHN Magasins457955
BuprénorphineUniversité
CefazolinUHN Pharmacie pour patients hospitalisésNo Cat # Needed
Solution de chlorhexidineCDMV119872
Corning BioCoatCellware, Collagène de type I, Plats de 100 mmCorning354450marque non importante
Corning BioCoatCellware, Collagène de type I, plaques 24 puitsCorning354408marque non importante
Corning BioCoatCellware, Collagène de type I, plaques 6 puitsCorning354400marque non important
Corning Matrigel Membrane Membrane Matrix, *sans LDEV, 10 mLCorning354234
DMEM/HAM F12 1:1Life Technologies11320marque non important
DMSOCaledon Lab Chem1/10/4100
Enrofloxacine (injectable Baytril)CDMV11242
Falcon TubeCorning Centri-Star430828
Sérum fœtal de bovin, qualifié, d’origine canadienne, 500mlLife Technologies12483020marque/source non importante
IsofluraneUHN pharmacie hospitalièreNo Cat # Nécessaire
Isohexol contrasteGE Healthcare407141210
Meloxicam (Metacam 0,5 %)CDMV104674
Normal SalineHouse Brand (UofT Medstore)1011
PBSMulticell ou Sigma331-010-CL ou D8537-500mL
Pénicilline/Streptomycine (100mL ; 10000U Pénicilline, 10000ug Streptomycine)Corning-CellgroCA45000-652
Solution saline équilibrée stérile Hanks (-Ca++, -Mg++, -Phenol Red)T.C.M.F (Dr Bristow)28-Jan-11
Colle chirurgicale (adhésif tissulaire)3M Vetbond14695B
Trypsine (0,25 %), Protéomique QualitéSigmaT-6567-5X20UG
Trypsine-EDTA, 0,05 %, 100mlWisent Inc325-542-ELmarque pas important
résorbable tressable 356718 McGill

Références

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