Un modèle 3D in vitro et un pipeline computationnel pour quantifier le potentiel vasculogénique des progéniteurs endothéliaux dérivés de l'iPSC

Summary

Les progéniteurs endothéliaux dérivés de cellules souches pluripotentes induites (iPS-EP) ont le potentiel de révolutionner les traitements des maladies cardiovasculaires et de permettre la création de modèles de maladies cardiovasculaires plus fidèles. Ici, l'encapsulation des iPSC-EPs dans les microenvironnements tridimensionnels (3D) de collagène et une analyse quantitative du potentiel vasculogenic de ces cellules sont décrites.

Abstract

Les cellules souches pluripotentes induites (iPSC) sont une source cellulaire proliférante spécifique au patient qui peut se différencier en n'importe quel type de cellule somatique. Les progéniteurs endothéliaux bipotents (PE), qui peuvent se différencier en types de cellules nécessaires pour assembler la vascularisation mature et fonctionnelle, ont été dérivés de cellules souches pluripotentes embryonnaires et induites. Cependant, ces cellules n'ont pas été rigoureusement évaluées dans des environnements tridimensionnels, et une mesure quantitative de leur potentiel vasculogénique reste insaisissable. Ici, la génération et l'isolement des iPSC-EPs par le tri fluorescent-activé de cellules sont d'abord décrits, suivis d'une description de l'encapsulation et de la culture des iPSC-EPs dans les hydrogels de collagène. Ce microenvironnement extracellulaire de matrice (ECM)-imitation encourage une réponse vasculogenic robuste ; les réseaux vasculaires se forment après une semaine de culture. La création d'un pipeline de calcul qui utilise un logiciel open-source pour quantifier cette réponse vasculogénique est délimitée. Ce pipeline est spécialement conçu pour préserver l'architecture 3D du plexus capillaire afin d'identifier solidement le nombre de branches, les points de ramification et la longueur totale du réseau avec un minimum d'entrée de l'utilisateur.

Introduction

Les cellules endothéliales de veine ombilicale humaine (HUVECs) et d'autres types primaires de cellules endothéliales ont été employées pendant deux décennies pour modéliser la germination et le développement de vaisseaux sanguins in vitro^1. Ces plates-formes vasculaires promettent d'éclairer les mécanismes moléculaires et tissulaires des maladies cardiovasculaires et peuvent présenter un aperçu physiologique du développement des réseaux vasculaires primitifs^2,3. Bien que le domaine de la modélisation vasculaire ait connu des progrès significatifs, un essai « d'étalon-or » qui peut modé....

Protocol

1. Préparation des solutions de médias et de revêtements de culture

1. Pour préparer la solution de revêtement de vitronectin, diluer la vitronectin 1:100 dans la saline phosphate-tamponnée de Dulbecco (DPBS).
   CAUTION: Une fois dilué, il n'est pas recommandé de stocker cette solution pour une utilisation future.
2. Après avoir reçu du phenol sans rouge, le mélange de protéines gélatineuses à teneur réduite par facteur de croissance (voir Tableau des matériaux)du fabricant, décongeler sur la glace à 4 oC jusqu'à ce que le mélange soit transparent et fluide. Garder le mélange sur la glace dans une hotte à débit laminaire, pipette 75 'L ....

Results

Après la différenciation (Figure 1), FACS et encapsulation des iPSC-EPs dans les hydrogels de collagène, les cellules resteront typiquement arrondies pendant 24 h avant de commencer à migrer et à former des lumens initiaux. Après environ 6 jours de culture, un plexus capillaire primitif sera visible dans l'hydrogel lorsqu'il est vu avec une microscopie brightfield (Figure 2). Après l'imagerie des hydrogels fixes et tachés de cell.......

Discussion

Ce protocole implique la culture à long terme des cellules dans trois types de médias de culture cellulaire : E8, LaSR Basal, et EGM-2. Par conséquent, un grand soin doit être pris pour stériliser de manière appropriée tous les matériaux. De plus, les blouses de laboratoire et les gants nettoyés à l'éthanol doivent toujours être portés lorsque vous travaillez dans le capuchon à débit laminaire du laboratoire. Il est recommandé de tester fréquemment la contamination par le mycoplasme; si une grande quantité de débris est .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
µ ;-Slide Angiogenesis	Ibidi	N/A	Une plaque de culture tissulaire plate à fond de verre avec parois latérales permet une imagerie confocale facile
Microplaque à 96 puits, à fond rond, à très faible attache, stérile	Corning	7007	Empêche la liaison des hydrogels de collagène chargés de cellules à la boîte de culture cellulaire
Accutase	STEMCELL Technologies	7920	Solution douce de décollement cellulaire ; ne dégrade pas les épitopes extracellulaires essentiels pour FACS
Advanced DMEM/F12	Thermo Scientific	12634010	Le milieu de base pour la différenciation iPSC-EP.
Barnstead GenPure xCAD Plus  ;	Thermo Fisher Scientific	50136165	Système de purification de l’eau ; d’autres peuvent être facilement substitués
d’albumine sérique bovine, 7,5 % dans le DPBS, filtrée stérile, BioXtra, adaptée à la culture cellulaire	Fisher Scientific	A8412	Pour préserver la viabilité cellulaire lors du tri
FACs CD34-PE, humain (clone : AC136)	Miltenyi Biotec	130-098-140	Anticorps utilisé pour l’isolement
des FACs des iPSC-EPCHIR99021	LC Laboratories	C-6556	Induit la formation d’un mésoderme à partir de cellules souches pluripotentes
Collagène I Queue de rat High Protein 100 mg	VWR	354249	Composant principal du microenvironnement 3D
Tubes à centrifuger coniques (15/50 mL)	Fisher Scientific	14-959-49D/A	Utilisé pour stocker et mélanger des volumes relativement importants de réactifs et de milieux
de culture cellulaireDAPI (4',6-Diamidino-2-Phénylindole, dichlorhydrate)	Thermo Fisher Scientific	D1306	Pour contre-coloration et visualisation des noyaux cellulaires
DMEM/F12	Thermo Fisher Scientific	11320-082	Pour la dilution du Matrigel et la décongélation des cellules souches pluripotentes
saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS)	ThermoFisher	14190-250	Pour laver les cultures monocouches
EDTA	Sigma-Aldrich	E8008	Pour le passage des colonies de cellules souches pluripotentes et pour prévenir l’agrégation cellulaire lors du tri des FAC
Croissance des cellules endothéliales Milieu 2	PromoCell	C-22011	Favorise la viabilité et la prolifération des cellules endothéliales
Essentiel 8 Milieu	Thermo Fisher	Scientific A1517001  ;   ;	Pour l’entretien des cellules souches pluripotentes
Glycine,BioUltra, pour la biologie moléculaire, >=99,0 % (NT)	Sigma-Aldrich	50046	Neutralise le détergent restant
Acide L-ascorbique 2-phosphate sesquimagnésium hydrate,>=95 %	Sigma-Aldrich	A8960	Composant du support de différenciation iPSC-EP
MATLAB	MathWorks	1.8.0_152	Environnement de calcul numérique multiparadigme (disponible gratuitement dans la plupart des établissements universitaires)
Matrigel Matrix GFR PhenolRF Souris 10 mL (mélange de protéines gélatineuses)	Fisher Scientific	356231	Dilué dans du DMEM/F12 pour enrober des plaques pour la différenciation iPSC-EP
Medium-199 10X	Thermo Fisher Scientific	1825015	Utilisé pour équilibrer l’osmolarité finale de l’hydrogel et le pH
Tubes à microcentrifuger (1,7 mL)	VWR	87003-294	Stocke de petits volumes de réactifs
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)	Sigma-Aldrich	P3813	L’ingrédient principal des solutions d’immunocoloration
Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122	Antibiotique utilisé après tri pour éliminer une éventuelle contamination de l’instrument FACS
Recombinant Human VEGF 165 Protein	R& D Systems	293-VE	Mitogène qui stimule la prolifération et la tubulogenèse des cellules endothéliales
Rhodamine phaloïdine	Themo Fisher Scientific	R415	Pour identifier le dépôt d’actine F et ainsi tracer les limites des réseaux vasculaires
Triton X-100 (tensioactif non ionique)	Sigma-Aldrich	X-100	Détergent utilisé pour perméabiliser doucement les cellules
Tween-20 (réactif émulsifiant)	Fisher Scientific	BP337	Augmente la spécificité de liaison des anticorps ajoutés
VE-Cadhérine (F-8)	Santa Cruz Biotechnology	sc-9989  ;	Identifier la lumière endothéliale 3D dans les hydrogels de collagène
Vitronectine	ThermoFisher	A14700	Pour l’entretien des cellules souches pluripotentes
Y-27632	Selleck Chemicals	S1049	Préserve la viabilité des cellules souches pluripotentes et de l’iPSC-EP lorsqu’elles sont dissociées et réensemencées