Isolement et coloration des kératinocytes de peau de souris pour l'analyse spécifique de cycle cellulaire de l'expression cellulaire de protéine par cytométrie de masse

Résumé

Ce protocole décrit comment isoler les kératinocytes cutanés des modèles de souris, les tacles avec des anticorps marqués en métal, et analyser les cellules tachées par cytométrie de masse afin de profiler le modèle d'expression des protéines d'intérêt dans les différentes phases du cycle cellulaire.

Résumé

L'objectif de ce protocole est de détecter et de quantifier les changements d'expression des protéines d'une manière dépendante du cycle cellulaire à l'aide de cellules individuelles isolées de l'épiderme de la peau de souris. Il y a sept étapes importantes : séparation de l'épiderme du derme, digestion de l'épiderme, coloration des populations épidermiques avec cisplatine, codage à barres d'échantillon, coloration avec des anticorps métalliques marqués pour les marqueurs de cycle cellulaire et les protéines de l'intérêt, la détection d'anticorps marqués par le métal par cytométrie de masse, et l'analyse de l'expression dans les différentes phases du cycle cellulaire. L'avantage de cette approche par rapport aux méthodes histologiques est le potentiel d'analyse du modèle d'expression de marqueurs différents dans une seule cellule à différentes phases du cycle cellulaire. Cette approche permet également l'analyse multivariée de corrélation de l'expression de protéine qui est plus quantifiable que les méthodes histologiques/imaging. L'inconvénient de ce protocole est qu'une suspension des cellules simples est nécessaire, ce qui entraîne la perte de l'information de localisation fournie par la coloration des sections de tissu. Cette approche peut également nécessiter l'inclusion de marqueurs supplémentaires pour identifier différents types de cellules dans les suspensions de cellules brutes. L'application de ce protocole est évidente dans l'analyse des modèles hyperplastiques de maladie de peau. En outre, ce protocole peut être adapté pour l'analyse de sous-types spécifiques de cellules (par exemple, les cellules souches) par l'ajout d'anticorps spécifiques à la lignée. Ce protocole peut également être adapté pour l'analyse des cellules de la peau chez d'autres espèces expérimentales.

Introduction

La corrélation de l'expression génique avec les stades du cycle cellulaire demeure un défi dans l'analyse des modèles animaux de maladies hyperplastiques comme le cancer. Une partie de ce défi est la co-détection des protéines d'intérêt (POI) avec des marqueurs de prolifération. Les cellules proliférantes peuvent être trouvées dans diverses phases de cycle cellulaire comprenant G1, S, G2, et M. Ki67 est l'un des marqueurs les plus couramment utilisés de la prolifération et est exprimée dans toutes les phases du cycle cellulaire. Il a été largement utilisé dans l'analyse des tissus humains et de souris^1,2,3. Cependant, comme d'autres marqueurs de prolifération générale, Ki67 ne discerne pas les phases individuelles du cycle cellulaire. Une approche plus précise utilise l'incorporation d'analogues de nucléotide de thymidine comme la bromodeoxyuridine (BrdU) dans des cellules qui reproduisent activement leur génome (c.-à-d. la phase S)^4,5. Un inconvénient à l'utilisation des analogues nucléotides est la nécessité de les administrer aux animaux vivants heures avant l'analyse. Ki67 et BrdU sont généralement détectés sur les sections de tissus fixes par l'utilisation d'anticorps. L'un des avantages de cette approche est que l'emplacement des points d'accès peut être déterminé dans l'architecture tissulaire (p. ex., la couche basale de l'épiderme cutané). Cette approche ne nécessite pas non plus de dissociation tissulaire qui peut conduire à des changements dans l'expression des gènes. L'un des inconvénients est que la fixation des tissus ou le traitement du tissu pour la section congelée ou paraffine de l'OCT peut obstruer les cibles des anticorps (c.-à-d. les antigènes). La récupération des antigènes nécessite généralement une digestion thermique ou tissulaire. La quantification des intensités de coloration peut également être difficile. Cela est dû aux variations de la coloration, de l'épaisseur de la section, de la détection du signal et du biais de l'expérimentateur. En outre, un nombre limité de marqueurs peut être détecté simultanément dans la plupart des configurations de laboratoire typiques. Pourtant, de nouvelles approches de coloration multiplex promettent de surmonter ces limites; exemples sont la cytométrie de masse d'imagerie et l'amplification du signal Tyramide^6,7.

La cytométrie des flux est une autre technologie puissante pour détecter les cellules proliférantes. Il permet la détection multiplexe des marqueurs dans les mêmes cellules, mais nécessite une dissociation tissulaire pour la plupart des types de cellules non hématopoïétiques. L'analyse des cellules proliférantes est régulièrement effectuée par l'utilisation de colorants qui lient l'ADN (p. ex., Propidium Iodide (PI))⁸. La cytométrie de flux permet également une détermination plus précise des phases du cycle cellulaire lorsqu'elle est associée à la détection de l'incorporation BrdU⁹. Bien qu'il s'adresse avec force, la cytométrie du flux BrdU/PI a ses inconvénients. Il n'est pas en mesure de résoudre les phases G2/M et G0/G1 sans l'inclusion d'anticorps spécifiques à la phase. Cependant, le nombre d'anticorps qui peuvent être utilisés est limité par l'autofluorescence cellulaire, les retombées spectrales des émissions de fluorophore et l'utilisation de contrôles de compensation. Cette limitation indique qu'il est plus difficile et laborieux de co-détecter l'expression des marqueurs de cycle cellulaire avec des POI. Une approche plus facile est d'utiliser la cytométrie de masse^10,11. Cette technologie utilise des anticorps conjugués métalliques qui ont un spectre de détection plus étroit. Une fois que les cellules sont tachées d'anticorps marqués par le métal, elles sont vaporisées et les métaux détectés par la spectrométrie de masse cytométrie (CyTOF). En raison de ces propriétés, la cytométrie de masse permet la détection multiplexe de marqueurs différents à l'aide de plates-formes existantes^10,11. En outre, il est possible de coder à barres des échantillons avec des métaux qui se traduisent par des économies d'anticorps précieux tout en réduisant la variabilité des taches d'échantillon en échantillon. D'autre part, la cytométrie de masse a plusieurs inconvénients. Il existe un nombre limité d'anticorps étiquetés métalliques disponibles dans le commerce pour les cellules non dérivées du sang. La quantification de la teneur en ADN est moins sensible par rapport à l'utilisation de colorants fluorescents de l'ADN et la cytométrie de masse a une plage dynamique réduite de détection de signal par rapport à la cytométrie de flux de fluorescence.

Le protocole décrit ici a été conçu pour analyser la dynamique du cycle cellulaire des kérainocytes nouvellement isolés (KCs) de la peau de souris et caractériser l'expression protéique spécifique au cycle cellulaire dans ces cellules en utilisant la cytométrie de masse. Ce protocole peut également être utilisé avec des cellules cultivées ou adapté à d'autres types de cellules.

Protocole

Le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux du campus médical anschutz de l'Université du Colorado a approuvé les expériences sur les animaux décrites dans ce protocole.

1. Préparations

1. Concevoir un panneau d'anticorps marqué en métal. Utilisez le logiciel de conception de panneaux en ligne gratuit¹² et inclure ¹²⁷IododeoxyUridine (IdU), ¹⁶⁴Dy (Dysprosium) étiqueté anti-CCNB1 (CYCLIN B1), ¹⁷⁵Lu (Lutetium) phospho (p)-HISTONEH3^Ser28 (pHH3), et ¹⁵⁰ Nd (Neodymium)-pRETINOBLASTOMA protéine^Ser807/811 (pRB)¹³. Ajoutez d'autres anticorps marqués par le métal qui ne se chevauchent pas dans leur signal de canal¹⁴.
2. Préparer une solution d'actions IdU. Dissoudre la poudre d'IdU à 10 mg/mL en 0,1 N NaOH à 60 oC. Aliquot IdU stock de solution dans les tubes de microcentrifuge et de congeler à -20 oC pour le stockage à long terme.
   1. Ajuster le pH de la solution IdU à 7,5 avec 12 N HCl immédiatement avant utilisation. Testez avec une bande de pH sur un aliquot de rejet pour s'assurer que la solution est au pH 7.5.
      REMARQUE : Le temps prolongé (à partir de 5 min) d'IdU au pH 7,5 entraînera des précipitations et un aliquot frais d'IdU est nécessaire lorsque cela se produit.
   2. Utilisez l'équipement de protection individuelle approprié (p. ex. gants, blouse de laboratoire et lunettes de sécurité) et travaillez dans une armoire de sécurité lorsque vous manipulez des solutions NaOH ou HCl.
3. Préparer une solution de fixation au paraformaldéhyde 2x (PFA). Combinez 5 mL de 10x PBS (pH 7,5) et 1 ml de 16% de PFA avec 44 ml de dH₂O de qualité moléculaire pure (3,2% de concentration finale).
   REMARQUE : Un stock de PFA peut être préparé comme précédemment publié¹⁵ ou acheter 16% des stocks exempts de métaux contaminants.
   1. Utilisez l'équipement de protection individuelle approprié et travaillez dans une armoire de sécurité lors de la manipulation de la poudre et des solutions PFA.
4. Préparer le baryum (Ba²⁾gratuit 1x PBS en combinant 5 ml de 10x PBS sans métal (pH 7,5) avec 45 ml de dH₂O de qualité moléculaire pure.
   REMARQUE : La qualité du PBS et d'autres réactifs est très importante pour éviter de contaminer les métaux qui peuvent introduire le bruit de fond pendant l'analyse des données cytométriques de masse.
5. Préparer une solution de bouillon de cisplatine de 100 mM. Dissoudre 300,5 mg de poudre de cisplatine dans 10 ml de DMSO. Conserver dans les aliquots à -80 oC. Préparer une solution de travail de 10 mM de cisplatine pour les expériences à utiliser sur 1 d.
6. Préparer des solutions de séparation épiderme/derme. Préparer une solution de stock 20x dispase en dissolvant 30 mg dans 1 ml de HBSS ou PBS. Filtrer la stérilisation à l'intérieur d'un filtre de 0,22 m et entreposer les aliquots à -20 oC. Préparer une solution de stock de collagène de type IV de 1x à 1 mg/mL dans le HBSS, filtrer la stérilisation à l'aide d'un filtre de 0,22 m et stocker les aliquots à -20 oC.

2. Étiquetage de la phase S par incorporation De l'UI par l'Incorporation

1. Pesez des souris. Utilisez des chiots néonatals P1-P3 ou des souris adultes de 8 à 10 semaines et utilisez des souris mâles ou femelles provenant d'un C57BL/6, d'un FvB ou de 129 milieux. Déterminer une dose de 0,1 mg d'IdU (pH 7,5)/g de poids corporel. Par exemple, une souris de 25 g nécessite 0,25 ml d'IdU.
2. Administrer la dose d'IdU par injection intrapéritonéale et attendre 2 h avant de récolter les cellules. Utilisez une seringue de tuberculeuse pour injecter des chiots néonatals.
   REMARQUE : Une dose de 2 mg/mL d'IdU peut être utilisée avec des cellules de culture tissulaire avec une incubation de 1 h à 37 oC avant la récolte et l'étiquetage pour la cytométrie de masse.

3. Isolement des cellules pour l'étiquetage

1. Décongeler les solutions de dépase et de collagène. Diluer la solution de stock de dériver 20x à 1x (1,5 mg/mL) dans le HBSS ou le PBS stérile. Conserver sur la glace jusqu'au moment de l'utilisation.
2. Combinez 2 volumes de dispase avec 1 volume de collagène dans un volume total qui permet à la peau de flotter librement. Par exemple, la digestion de 5 peaux de souris néonatales peut être flottée sur 8 ml de 1x dispase avec 4 ml de collagène dans un plat Petri de 100 mm.
3. Suivez des méthodes approuvées pour euthanasier les souris expérimentales (p. ex., surdosage d'isoflurane/pincement des orteils ou inhalation de CO 2/dislocation cervicale). Nettoyez la peau de l'oreille adulte avec une solution d'iode (voir Tableau des matériaux)et rincez à l'eau stérile lorsque des cellules isolées doivent être utilisées pour la culture tissulaire.
4. Enlever chirurgicalement l'oreille à la base (Figure 1A). Rincer les oreilles dans le PBS stérile lorsque des cellules isolées doivent être utilisées pour la culture tissulaire. Déposer sur un plat Petri sec de 100 mm.
5. Séparez soigneusement la peau postérieure de la peau postérieure en créant d'abord une poche au milieu ou au bord de la zone coupée à l'aide de forceps fins et en tirant les deux rabats de peau séparés (figure 1B-D). Procédez avec les peaux antérieures et postérieures.
   REMARQUE : Des instructions détaillées pour disséquer la peau néonatale de souris sont fournies par Litchi et coll.¹⁶ En outre, l'utilisation d'une portée de dissection peut aider à la séparation de la peau postérieure de la peau postérieure et à l'identification des côtés épidermiques/dermiques des peau: les cheveux sont visibles sur le côté épiderme tandis que le derme aura un aspect gélatineux.
6. Placez soigneusement les peaux antérieures et postérieures de l'oreille avec le côté derme de la peau touchant la solution dispase/collagenase ( Figure 1E). Utilisez 1 mL pour la peau antérieure et postérieure d'une seule oreille par puits d'une plaque de 12 biens de culture. Incuber à 37 oC pendant 1 h. Alternativement, les peaux flottantes sur la solution de dispase 1x à 4 oC pour 16-18 h.³
   REMARQUE : Travaillez dans une hotte de culture de tissu avec la technique stérile quand les cellules doivent être cultivées.
7. Placez la peau digérée avec le côté épiderme touchant la surface d'un plat Petri propre. Aplatir la peau et faire glisser doucement le derme de l'épiderme en travaillant du centre aux bords dans un motif circulaire.
8. Jetez le derme ou digérez-le plus loin pour libérer les fibroblastes pour la culture ou l'analyse des tissus¹⁶.
   REMARQUE: Le derme sera plus foncé en apparence et ont une composition gélatineuse et collante. Le derme devrait facilement se détacher. L'échec ou la difficulté en enlevant le derme suggère la digestion insuffisante de tissu. Cependant, l'incubation prolongée dans le tampon de digestion réduira la viabilité cellulaire. L'épiderme restera sur le plat Petri et aura un aspect blanchi.
9. Soulevez délicatement l'épiderme en saisissant les bords et épluchez-le de la surface du plat Petri. Placez soigneusement l'épiderme sur la solution de détachement cellulaire préchauffée (voir Tableau des matériaux) pendant 5 min à 37 oC ou 20 min à RT. Utilisez 500 l de solution de détachement cellulaire pour 2 épidermises d'oreilles adultes par puits d'une plaque de culture de 12 puits et utilisez 750 l de détachement cellulaire solution pour un épiderme néonatal unique par puits d'une plaque de culture de 6 puits.
10. Saisir l'épiderme à l'aide de forceps stériles et frotter en faisant glisser l'épiderme contre le fond du plat pour dissocier les cellules. Ajouter 1 ml de DMEM contenant 1 % de FBS (0,01 ml) et passer à travers un tamis cellulaire de 40 m dans un tube de collecte. Bien rincer avec 2 ml de DMEM supplémentaires et ajouter à la suspension cellulaire.
11. Centrifugeuse à 120 x g pendant 5 min. Aspirez soigneusement le supernatant.
12. Resuspendre le granule de cellules dans 1-2 ml de DMEM contenant 1% FBS. Déterminez le nombre de cellules et de % de cellules vivantes à l'aide de Trypan Blue et d'un hémocytomètre ou d'un dispositif de comptage automatisé. Cellules de pellet comme décrit dans l'étape 3.11.
    REMARQUE : Les cellules peuvent être cultivées dans les médias appropriés de culture tissulaire après l'étape 3.12. ^{17 Annonces}

4. Étiquetage de Cisplatin pour déterminer les cellules vivantes/mortes

1. Resuspendre 1-3 x 10⁶ cellules par 1 ml de DMEM contenant 25 M de cisplatine (2,5 l de stock/mL). Incuber 1 min et éteindre par pipetting avec un volume égal de FBS (p. ex., 1 ml).
2. Centrifugeuse à 120 x g pendant 5 min. Décant supernatant dans un bécher contenant de l'eau de Javel diluée et des tubes d'inversion pour égoutter la solution restante sur un essuie-tout. Appuyez doucement pour libérer la solution restante sur le granule et la paroi latérale du tube.
3. Resuspendre le granule de cellules dans 2 ml de Ba²-gratuit PBS. Cellules de pellet comme décrit dans l'étape 4.2.
   REMARQUE : Il est recommandé de fixer les cellules si elles ne peuvent pas être tachées immédiatement.

5. Fixation des cellules étiquetées cisplatine (facultatif)

1. Resuspendre 1-3 x 10⁶ cellules étiquetées cisplatine dans 1 ml de Ba²-free PBS. Cellules de Vortex sous faible puissance continue et ajoutez dropwise 1 mL (1 volume) du tampon de fixation 2x PFA. Incuber à RT pendant 10 min sur une plate-forme à bascule.
2. Cellules de pellet comme décrit dans l'étape 4.2, mais centrifugeuse à 500 x g pendant 5 min.
3. Laver les cellules avec 2 ml de Ba²-free PBS et les cellules granulées comme décrit à l'étape 5.2. Répétez l'étape 5.3 une fois.
4. Resuspendre la pastille en 2 ml de Ba²-gratuit PBS. Conserver à 4 oC pour 3 j. Ajouter le FBS à 3 % (p. ex., 0,3 mL de FBS/mL de cellules) du volume total si vous stockez plus longtemps, puis mélanger et congeler à -80 oC.
   REMARQUE : La fixation peut affecter la détection de certaines épitopes. Les effets de la fixation sur le signal d'anticorps doivent être déterminés empiriquement.

6. Barcodage d'échantillons (facultatif mais recommandé)

1. Cellules de pellet comme décrit dans l'étape 5.2 et puis resuspend 1-3 x 10⁶ cellules dans 1 ml de tampon de fixation 1x (voir tableau des matériaux). Incuber à RT pendant 10 min. Cellules pelletées telles que décrites à l'étape 5.2.
2. Laver les cellules avec 1 ml de tampon de perméabilisation du code à barres (voir Tableau des matériaux). Cellules de pellet comme décrit dans l'étape 5.2. Répétez l'étape 6.2 une fois.
3. Ajouter 100 l de tampon de perméabilisation de code à barres aux codes-barres (voir Tableau des matériaux)¹⁸ et mélanger immédiatement pendant que les cellules de l'étape 6.2 sont granulées.
4. Resuspendre le granule de cellule dans 800 'L de tampon de perméabilisation de code à barres. Ajouter la solution de code à barres aux cellules, mélanger et incuber à RT pendant 30 min. Cellules pelletées telles que décrites à l'étape 5.2. Laver les cellules dans 2 ml de tampon de coloration cellulaire (voir Tableau des matériaux) et pelletàez à nouveau.
   REMARQUE: Jusqu'à 20 échantillons peuvent être étiquetés avec diverses combinaisons de métaux Palladium¹⁸. D'autres stratégies de codage à barres sont décrites ailleurs¹⁵.

7. Étiquetage des cellules pour la cytométrie de masse

1. Resuspendre 1-3 x 10⁶ cellules dans 1 ml de solution de travail tampon de coloration de l'antigène nucléaire (voir Tableau des matériaux). Combinez les échantillons dans un seul tube pour les étapes suivantes lors de l'utilisation d'échantillons codés à barres. Incuber à RT pendant 30 min. Pellet tel que décrit à l'étape 5.2.
2. Resuspendre 1-3 x 10⁶ cellules dans 2 ml de tampon de perméabilisation de la coloration de l'antigène nucléaire (voir Tableau des matériaux). Échelle au besoin. Par exemple, utilisez 6 ml de tampon pour 10 échantillons combinés avec un nombre cellulaire de 9 x 10⁶ cellules. Pellet tel que décrit à l'étape 5.2.
3. Répétez l'étape 7.2. Vortex doucement la pastille cellulaire dans le volume résiduel laissé dans le tube.
4. Ajouter 50 l de cocktail d'anticorps intracellulaires par 1-3 x 10⁶ cellules. Échelle au besoin. Par exemple, utilisez 150 l de cocktail d'anticorps pour 10 échantillons combinés avec un nombre cellulaire de 9 x 10⁶ cellules. Mélanger et incuber à RT pendant 45 min. Ajouter 2 ml de tampon de coloration cellulaire et de granule tel que décrit à l'étape 5.2.
5. Resuspendre 1-3 x 10⁶ cellules granulés dans 2 ml de tampon cellule de coloration. Cellules de pellet comme décrit dans l'étape 5.2. Répétez l'étape 7.5 une fois.
   REMARQUE : D'autres solutions tampons peuvent être utilisées pour tacher la membrane extracellulaire ou les marqueurs cytoplasmiques et l'expérimentateur peut avoir à optimiser la coloration s'il est nécessaire de détecter les épitopes dans différents endroits cellulaires. Les cellules peuvent également être fixées en PFA après l'étape 7.5 lors de l'utilisation de cellules vivantes pour la coloration.
6. Resuspendre 1-3 x 10⁶ cellules dans 1 ml de solution d'intercalation et conserver 1-3 d à 4 oC.
   1. Entreposez les cellules à -80 oC dans le DMSO contenant la solution pour les cellules de granule d. telles que décrites à l'étape 5.2 si les cellules sont dans la solution d'intercalation. Resuspendre les granulés (1-3 x 10⁶ cellules) dans 1 ml de tampon de coloration cellulaire et de cellules granulées telles que décrites à l'étape 5.2. Resuspendre le granule dans 1 ml de 10 % DMSO/90 % FBS¹⁹, le transférer dans un cryovial, le placer dans un contenant de congélation à l'isopropanol et le conserver à -80 oC.
7. Cellules de pellet comme décrit dans l'étape 5.2. Laver 1-3 x 10⁶ cellules avec 2 ml de tampon de coloration cellulaire, granulement tel que décrit à l'étape 5.2. Effectuer deux lavages supplémentaires avec 2 ml d'eau, granulecomme comme décrit à l'étape 5.2.
8. Diluer les perles d'étalonnage EQ 1:9 dans l'eau (solution de stock à 3,3 x 10⁵ perles/mL).
9. Resuspendre la pastille cellulaire à une concentration de 1 x 10⁶ cellules/mL avec une solution diluée de perles d'Égalisation. Filtrer les cellules à travers des tubes d'écoulement de bouchon de passoire de 35 m.
10. Exécuter des échantillons sur le cytomètre de masse et acquérir des données. Les données seront déposées dans un format de fichier Flow Cytometry Standard (FCS).

8. Traitement et analyse des fichiers de données de cytométrie de masse

1. Normaliser les fichiers FCS. Utiliser un programme gratuit disponible au²⁰ https://github.com/nolanlab/bead-normalization/releases/latest
2. Fichiers FCS décongestionné à barres. Séparez la population de codes à barres mis en commun en fichiers codés à barres distincts avec un programme gratuit disponible au¹⁸ https://github.com/nolanlab/single-cell-debarcoder/releases/latest
3. Analyser les fichiers FCS normalisés. Utilisez des programmes commerciaux^21,22 ou freeware (voir web.stanford.edu/group/nolan/resources.html).

Résultats

Le tableau 1 montre les rendements cellulaires et la viabilité attendus de l'oreille de souris adulte (figure 1) et de la peau néonatale dans des conditions non pathologiques. Le tableau montre également des données représentatives d'animaux provenant d'un fond mixte C57/126. On s'attend à ce que la peau d'autres souches entraîne des rendements cellulaires et des viabilities similaires. Le rendement approximatif dépend de la surface de la pea...

Discussion

Le protocole décrit dans ce document peut être complété en environ 8 h. Le résultat final est une suspension des cellules enrichies en KCs qui peuvent être analysés pour l'expression des protéines d'une manière cellulaire dépendante du cycle. Plusieurs études antérieures ont décrit des méthodes pour isoler les KCde la peau humaine et de la souris^16,25. Ces études comprennent également des protocoles pour l'isolement des KC spour la cytométrie du débit

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Plaque à 12 puits	Cell Treat	229512
solution intercalateur	Fluidigm	201192A	125 µ ; M - Ir solution intercalateur
Paraformaldéhyde	Microscopie électronique Sciences	30525-89-4	16 %  ; PFA
Tubes d’écoulement	Fisher/Corning	352235	35 µ ; m taille des pores  ;
Tamis cellulaire	Fisher	22363547	40 &mu ; m taille des pores  ;
Solution de décollement cellulaire	CELLnTEC	CnT-ACCUTASE-100	Accutase
Solution d’iode	ThermoFisher/Purdue	67618-151-17	Bétadine 7,5 % d’iode gommage chirurgical
Tampon de perméabilisation de code-barres  ;	Fluidigm	201060	Cell-ID 20-Plex Barcoding Kit
Barcodes	Fluidigm	201060	Cell-ID 20-Plex Barcoding Kit
Bandelettes de pH	EMD	9590	colorpHast
DMEM	Hyclone	SH30022.01	Dulbecco' s Modified Eagle Media
Pinces fines	Dumont & Fils	0109-5-PO	Dumostar #5
Pince de précision courbe	Dumont & Fils	0109-7-PO	Dumostar #7
Perles d’étalonnage	Fluidigm	201078	EQ Perles d’étalonnage à quatre éléments
HBSS	Gibco	14175-095	Hank’s Balanced Salt Solution
	Water Fisher	SH30538.03	Hyclone Molecular Biology eau de qualité
Iododésoxyuridine	; Sigma	I7125	IdU
Cryo flacons	ThermoFisher	366656PK	filetage interne
Tampon de coloration cellulaire	Fluidigm	201068	Maxpar Tampon de coloration
cellulaire Fix & Tampon de perme	Fluidigm	201067	Maxpar Fix & Tampon permanent
Tampon Fix I	Fluidigm	201065	Maxpar Fix I
Tampon salin tamponné au phosphate	Rockland	MB-008	Sans métal 10x récipient de
congélation à l’isopropanol	ThermoFisher	5100-0001	Mr.Frosty
Hydroxyde de sodium	Fisher	BP359-500 Boîte de	NaOH
	Kord-Valmark	2900	Fourni par Genesee 32-107  ;
15 mL conique	Olympus/Genesee	28-101
50 mL conique	Olympus/Genesee	28-106
Plaque 6 puits	Cell Treat	229506
Cisplatine	Sigma	479306
Dispase II	Sigma/Roche	4942078001
DMSO	Sigma	D2650
FBS	Atlanta Biologicals	S11150
Acide chlorhydrique	Fisher	A144-212
Tampon de coloration de l’antigène nucléaire Tampon de coloration de l’antigène	nucléaire Fluidigm	201063
Tampon de coloration de l’antigène	nucléaire Fluidigm	201063
Trypan blue	Sigma	T8154
Seringue à tuberculine	BD	309626
Collagénase de type IV  ;	Worthington Bioscience	CLSS-4