Microscopie de suivi à molécule unique - Outil pour déterminer les états diffusifs des molécules cytosoliques

Summary

La microscopie de localisation simple molécule 3D est utilisée pour sonder les positions spatiales et les trajectoires de mouvement des protéines étiquetées fluorescentes dans les cellules bactériennes vivantes. Le protocole expérimental et d'analyse de données décrit ci-dessus détermine les comportements diffusifs répandus des protéines cytosoliques basées sur des trajectoires monomolécules mises en commun.

Abstract

La microscopie de localisation à molécule unique sonde la position et les mouvements des molécules individuelles dans les cellules vivantes avec des dizaines de nanomètres de résolution spatiale et milliseconde temporelle. Ces capacités font de la microscopie de localisation à une molécule idéalement adaptée pour étudier les fonctions biologiques de niveau moléculaire dans des environnements physiologiquement pertinents. Ici, nous démontrons un protocole intégré pour l'acquisition et le traitement/analyse des données de suivi d'une seule molécule pour extraire les différents états diffusifs qu'une protéine d'intérêt peut montrer. Ces informations peuvent être utilisées pour quantifier la formation complexe moléculaire dans les cellules vivantes. Nous fournissons une description détaillée d'une expérience de localisation simple molécule 3D basée sur la caméra, ainsi que les étapes ultérieures de traitement des données qui donnent les trajectoires de molécules individuelles. Ces trajectoires sont ensuite analysées à l'aide d'un cadre d'analyse numérique pour extraire les états diffusifs répandus des molécules étiquetées fluorescentes et l'abondance relative de ces états. Le cadre d'analyse est basé sur des simulations stochastiques de trajectoires intracellulaires de diffusion brownienne qui sont spatialement confinées par une géométrie cellulaire arbitraire. Sur la base des trajectoires simulées, les images brutes à molécule unique sont générées et analysées de la même manière que les images expérimentales. De cette façon, les limites expérimentales de précision et de précision, qui sont difficiles à étalonner expérimentalement, sont explicitement incorporées dans le flux de travail d'analyse. Le coefficient de diffusion et les fractions de population relatives des états diffusifs prédominants sont déterminés en adaptant les distributions des valeurs expérimentales à l'aide de combinaisons linéaires de distributions simulées. Nous démontrons l'utilité de notre protocole en résolvant les états diffusifs d'une protéine qui présente différents états diffusifs en formant des complexes homo- et hétéro-oligomeric dans le cytosol d'un agent pathogène bactérien.

Introduction

L'examen du comportement diffusif des biomolécules donne un aperçu de leurs fonctions biologiques. Les techniques basées sur la microscopie à fluorescence sont devenues des outils précieux pour observer les biomolécules dans leur environnement cellulaire indigène. Le rétablissement de fluorescence après le photoblanchiment (FRAP) et la spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS)¹ fournissent des comportements diffusifs ensemble-moyens. Inversement, la microscopie de localisation à molécule unique permet l'observation de molécules fluorescentes individuelles à haute résolution spatiale et temporelle^2,

Protocol

1. Calibrage point-spread-fonction double-hélice

REMARQUE : Les images décrites dans cette section et les sections suivantes sont acquises à l'aide d'un microscope à fluorescence inversée construit sur mesure, tel que décrit dans Rocha et al.²³. La même procédure s'applique aux différentes implémentations de microscope conçues pour la localisation à molécule unique et le suivi de la microscopie^2,3,4. Tous les logiciels d'acquisition d'images et de traitement des données décrits dans cet article sont disponibles (https://github....

Results

Dans les conditions expérimentales décrites ici (20 000 images, longueur de trajectoire minimum de 4 localisations) et selon les niveaux d'expression des protéines de fusion étiquetées fluorescentes, environ 200 à 3 000 localisations donnant entre 10 et 150 trajectoires peuvent être générées par cellule (Figure 2a,b). Un grand nombre de trajectoires est nécessaire pour produire une distribution bien échantillonnée des coefficients de diffusio.......

Discussion

Un facteur critique pour l'application réussie du protocole présenté est de s'assurer que les signaux d'une seule molécule sont bien séparés les uns des autres (c.-à-d., ils doivent être clairsemés dans l'espace et dans le temps (Mov supplémentaire. 1)). S'il y a plus d'une molécule fluorante dans une cellule en même temps, alors la localisation pourrait être incorrectement assignée à la trajectoire d'une autre molécule. C'est ce qu'on appelle le problème de liaison³⁰. Les conditi.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acide 2,6-diaminopimélique	Chem Impex International	5411	Nécessaire à la croissance des cellules Y. enterocolitica utilisées.
4f lentilles	Thorlabs	AC508-080-A	f = 80mm, 2"
514 nm	laser Coherent	Genesis MX514 MTM	Utilisation pour l’excitation de fluorescence
agarose	Inivtrogen	16520100	Utilisé pour fabriquer des coussinets de gel pour monter un échantillon bactérien liquide sur microscope.
chlorure d’ammonium	Sigma Aldrich	A9434	M2G ingrédient.
Filtre passe-bande	Chroma	ET510/bp	Chemin d’excitation.
Cerveau Cœur Infusion	Sigma Aldrich	53286	Milieu de croissance pour Y. enterocolitica.
chlorure	de calcium Sigma Aldrich	223506	ingrédient M2G.
	Caméra Source d’imagerie	DMK 23UP031	Caméra pour l’imagerie par contraste de phase.
masque de phase diélectrique	Double Helix, LLC	N/A	Produit un signal DHPSF.
phosphate disodique	Sigma Aldrich	795410	M2G ingrédient.
éthylènediamineacide tétraacétique	Fisher	Scientific S311-100	Chélate Ca2+. Induit la sécrétion dans le T3SS.
rabattable	Newport	8892-K	Permet de basculer entre les voies de fluorescence et de contraste de phase.
fluosphères	Invitrogen	F8792	Billes fluorescentes. Longueurs d’onde d’exication et d’émission 540/560. Diamètre 40 nm.
lamelle de protection en verre	VWR	16004-302	# 1.5, 22mmx22mm
glucose	Chem Impex International	811	M2G ingrédient.
huile d’immersion	Olympus	Z-81025	Placé sur l’objectif de l’objectif.
sulfate de fer(II)	Sigma Aldrich	F0518	M2G ingrédient.
passe-long	Semrock	LP02-514RU-25	Chemin d’émission.
sulfate de magnésium	Fisher Scientific	S25414A	ingrédient M2G.
plate-forme de microscope	Mad City Labs plate-forme	personnalisée	pour microscope inversé.
Les	Sigma Aldrich	N4382	Y. enterocolitica utilisées sont résistantes à l’acide nalidixique.
objectif	Olympus	1-U2B991	60X, 1.4 NA
Nettoyeur d’ozone	Novascan	PSD-UV4	Utilisé pour éliminer la fluorescence de fond sur les lamelles de protection du verre.
phosphate	de potassium Sigma Aldrich	795488	ingrédient M2G.
LED rouge	Thorlabs	M625L3	Illumine l’échantillon pour l’imagerie par contraste de phase. 625 nm.
Caméra sCMOS	Hamamatsu	ORCA-Flash 4.0 V2	Caméra pour l’imagerie par fluorescence.
Filtre passe-court	Chroma	ET700SP-2P8	Voie d’émission.
Lentille tubulaire	Thorlabs	AC508-180-A	f=180 mm, 2
"Yersinia enterocolitica dHOPEMTasd	N/A	/A	Souche AD4442, eYFP-YscQ
Plaque quart d’onde d’ordre zéro	Thorlabs	WPQ05M-514	Voie d’excitation.