Ici, nous présentons un protocole pour mesurer l'engagement cible de KDM1A dans une cellule humaine ou animale, des échantillons de tissu ou de sang traités avec des inhibiteurs de KDM1A. Le protocole emploie le marquage de chemoprobe de l'enzyme libre de KDM1A et la quantification directe de l'occupation cible utilisant des immuno-tests à base de chemoprobe et peuvent être employés dans des études précliniques et cliniques.
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Article de méthode
Mesure directe de l'engagement cible de KDM1A à l'aide d'immunossays à base de chemoprobe
Dans cet article
Résumé
Résumé
L'évaluation de l'engagement cible, défini comme l'interaction d'un médicament avec la protéine pour laquelle il a été conçu, est une exigence fondamentale pour l'interprétation de l'activité biologique de tout composé dans le développement de médicaments ou dans les projets de recherche fondamentale. En épigénétique, l'engagement des cibles est le plus souvent évalué par l'analyse des marqueurs proxy au lieu de mesurer l'union du composé à la cible. Les résultats biologiques en aval qui ont été analysés comprennent la modulation de la marque histone ou les changements d'expression génique. KDM1A est une lysine demethylase qui élimine les groupes méthyliques du H3K4 mono et diméthylé, une modification associée au silence de l'expression génique. La modulation des marqueurs proxy dépend du type de cellule et de la fonction de la composition génétique des cellules étudiées, ce qui peut rendre l'interprétation et la comparaison entre les cas assez difficiles. Pour contourner ces problèmes, un protocole polyvalent est présenté pour évaluer les effets de dose et la dynamique de l'engagement cible direct de KDM1A. Le test décrit fait usage d'une chimioprobe KDM1A pour capturer et quantifier l'enzyme décomplexée, peut être largement appliqué aux cellules ou des échantillons de tissus sans avoir besoin de modification génétique, a une excellente fenêtre de détection, et peut être utilisé à la fois pour la recherche fondamentale et l'analyse d'échantillons cliniques.
Introduction
Lysine spécifique deméthylase 1 (KDM1A)1 est une deméthylase impliquée dans le contrôle de la transcription génique. Cette protéine est apparue comme une cible pharmacologique candidate2 en oncologie; y compris la leucémie myéloïde aigue3 (LAM), le syndrome de myélodie (SMD)4, myélofibrose (MF)5,6, Cancer du poumon à petites cellules (SCLC)7; dans la maladie des cellules de Sickle (SCD)8,9, et dans les maladies du système nerveux cent....
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Protocole
Des échantillons de sang ont été prélevés auprès de l'Instituto de Investigacion Biomédica Sant Pau Biobank selon la législation espagnole (Real Decreto de Biobancos 1716/2011) et l'approbation des comités d'éthique locaux. Les études sur les tissus animaux ont été réalisées conformément aux directives institutionnelles pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire (directive 86/609/CEE du Conseil des Communautés européennes) établie par le Comité d'éthique pour l'expérimentation animale PRAAL-PCB.
1. Préparation d'échantillons biologiques pour l'analyse.
CAUTION: Ce protocole implique la manipu....
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Résultats
La linéarité de la détermination De Total et Free KDM1A.
Une série standard a été préparée comme décrit dans l'étape 5.3.2., utilisant 0 à 2500 pg de l'enzyme recombinante humaine de KDM1A. Les valeurs RLU de Total et Free rKDM1A ont été évaluées pour vérifier la linéarité (figure 2A et 2B). Les données sont représentées comme moyen de 3 expériences avec 3 répliques.......
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Discussion
Le protocole présenté ici a été développé pour mesurer directement l'engagement cible De KDM1A à l'aide d'un nouveau ELISA basé sur la capture de chimioprobe KDM1A. La méthode a été validée sur des lignées cellulaires humaines cultivées et des échantillons ex vivo de l'homme, du rat et de la souris et du babouin (y compris les PBMC, les poumons, le cerveau, la peau, les tumeurs), mais peut être facilement appliquée à d'autres espèces dans lesquelles l'anticorps KDM1A cible épitopes et catalytique centre sont conservés. C.......
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Déclarations de divulgation
L'auteure Tamara Maes est directrice exécutive et actionnaire, et les auteurs Cristina Mascaro et Raquel Ruiz Rodriguez sont des employés d'Oryzon Genomics S.A. Oryzon Genomics S.A. qui développe des inhibiteurs KDM1A et détient des brevets couvrant les composés et les méthodes utilisés dans cet article.
Remerciements
Cette étude a été financée par Oryzon Genomics. S.A., Hoffman-La Roche, et partiellement appuyé par le programme de collaboration CIIP-20152001 et RETOS RTC-2015-3332-1.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 0,05 % Trypsine-EDTA (1X) | Thermo Scientific | #25300-062 | |
| 10 X Comprimés Inhibiteurs de Protéase | Roche | #11836153001 | |
| 96 bloc de stockage de puits profonds | VWR | #734-1679 | |
| Plaques ELISA 96 puits | Nunc | #436110 | |
| Adhésif film noir | Perkin Elmer | #6050173 | |
| Adhésif Film transparent | VWR | #60941-062 | |
| Sonde KDM1A biotinylée OG-881 | Oryzon Genomics S.A. | ||
| Albumine sérique bovine | Sigma | # 3117057001 | |
| Albumine sérique bovine Standard | Thermo Scientific | #23208) | |
| Bradford Protein Assay | BioRad | #500-0001 | |
| Tampon de lyse cellulaire 10X | Signalisation cellulaire | #9803 | |
| Centrifugeuse pour plaques à 96 puits | Hettich | Rotina 420R | |
| Flacon | Thermo Scientific | #156499 | |
| Humain recombinant LSD1 / KDM1A pleine longueur, enzymatiquement actif | Motif | #31426 | |
| Graphpad Prism 5 Project | GraphPad Software | NA | |
| Luminol-Enhacer et solution de peroxyde (substrat chimiluminescent) | Thermo Scientific | #37074 | |
| Micro centrifugeuse | Eppendorf | 5415 R Lecteur | |
| de microplaques Infinite 200-Tecan | Tecan | Infinite 200 | |
| Anticorps de capture monoclonale de souris Anti-KDM1A (épitope N-terminal) | Abcam | #ab53269 | |
| Aiguille G18 gauge blunt | BD | #303129 | |
| ORY-1001 (iadademstat) | Oryzon Genomics S.A. | ||
| Tubes de séparation PBMC 10 ml | Greiner bio-one | #163288 | |
| Tubes de séparation PBMC 50 ml | Greiner bio-one | #227288 | |
| PBS 1x | Sigma | #D8537 | |
| Agitateur de plaques | Heidolph Instruments | Rotamax 120 | |
| Polysorbate 20 | Sigma | #P7949 | |
| Anticorps de détection monoclonale de lapin Anti-KDM1A (épitope C-terminal) | Signalisation cellulaire | #672184BF-100 | |
| Anticorps secondaire Donne conjugué à la peroxydase Anti-lapin IgG | Thermo Scientific | #31458 | |
| Spectrophotomètre cuvette 1.5 | Deltalab | #302100 | |
| Spectrophotomètre pour cuvette | GE Healthcare | GeneQuant 1300 | |
| Streptavidin | Promega | #Z704A | |
| Seringue | BD | #303172 | |
| Type 1 eau ultrapure | Millipore | Milli-Q Advantage A10 | |
| Nettoyeur à ultrasons | VWR | USC200T |
Références
- Shi, Y. Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1. Cell. 119 (7), 941-953 (2004).
- Maiques-Diaz, A., Somervaille, T. C. LSD1: biologic roles and therapeutic targeting. Epigenomics. 8 (8), 1103-1116 (2016).
- Maes, T.
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Réimpressions et autorisations
