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Article de méthode

Greffe orthotopique de rein de rat: une approche chirurgicale nouvelle et simplifiée

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DOI :

10.3791/59403

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7 mai 2019

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1Department of Surgery, Johns Hopkins University School of Medicine

Dans cet article

Résumé

Le but de ce manuscrit et protocole est d’expliquer et de démontrer en détail la procédure chirurgicale de transplantation rénale orthotopique chez le rat. Cette méthode est simplifiée pour obtenir la perfusion correcte du rein donneur et raccourcir le temps de reperfusion en utilisant la technique de l’anastomose du brassard veineux et urétral.

Résumé

La transplantation rénale offre des taux de survie accrus et une meilleure qualité de vie pour les patients atteints d’insuffisance rénale terminale, comparativement à tout type de traitement de substitution rénale. Au cours des dernières décennies, le modèle de transplantation rénale de rat a été utilisé pour étudier les phénomènes immunologiques de rejet et de tolérance. Ce modèle est devenu un outil indispensable pour tester de nouveaux produits pharmaceutiques et schémas immunomodulateurs avant de procéder à des études de gros animaux précliniques coûteuses.

Ce protocole fournit une vue d’ensemble détaillée de comment effectuer de manière fiable la transplantation rénale orthotopique chez le rat. Ce protocole comprend trois étapes distinctes qui augmentent la probabilité de succès: perfusion du rein donneur par rinçage à travers la veine portante et l’utilisation d’un système de Brassard pour s’anastomosent les veines rénales et les ustères, réduisant ainsi le froid et chaud temps d’ischémie. En utilisant cette technique, nous avons atteint des taux de survie au-delà de 6 mois avec la créatinine sérique normale chez les animaux avec des greffes rénales syngéniques ou tolérantes. Selon le but de l’étude, ce modèle peut être modifié par des traitements antérieurs ou postgreffés pour étudier le rejet aigu, chronique, cellulaire ou médié par les anticorps. Il s’agit d’un modèle animal reproductible, fiable et rentable pour étudier différents aspects de la transplantation rénale.

Introduction

Historiquement, les premières études de rejet de greffe ont été effectuées par Brent et Medawar en utilisant des greffes de peau chez les rongeurs1. Il est vite devenu clair que la peau a des caractéristiques immunologiques distinctes, ce qui en fait un organe hautement immunogénique qui est différent dans le rejet d’autres organes solides vascularisés2. Les études de rat sur le rejet de greffe d’organe solide sont habituellement limitées aux greffes cardiaques, hépatiques et rénales. Bien que chacun de ces organes soit apte à étudier le rejet, il existe des avantages et des inconvénients pour chacun d’eux. Les greffes cardiaques sont souvent transplantées dans l’abdomen et anastomosées à l’aorte et à la veine cave, avec le cœur natif du receveur en place3. Cela ne recréent pas les conditions cliniques, anatomiques et physiologiques humaines. En outre, les coeurs sont très sensibles à l’ischémie froide et doivent être reperfusés préférentiellement dans 1 h afin de pouvoir récupérer leur fonction4. Les greffes hépatiques sont généralement considérées comme étant chirurgicalement plus difficiles et plus sensibles au temps à effectuer. Après avoir enlevé le foie indigène, le foie de donneur doit être implanté et reperfusés dans les 30 min car les receveurs ne peuvent pas durer plus longtemps sans un foie fonctionnel5. L’artère hépatique, la veine portale, et surtout la reconstruction du canal biliaire nécessitent des compétences chirurgicales raffinées. Outre les défis chirurgicaux, le foie est connu pour posséder des propriétés tolérogènes et les rongeurs et les humains peuvent devenir opérationnellement tolérants6,7,8. Le rein, contrairement aux organes susmentionnés, peut être transplanté dans une mode orthotopique, est connu pour être un organe immunogénique avec des épisodes de rejet cohérents et reproductibles (si non immunodéprimés), et permet des temps d’ischémie froide prolongée de plusieurs Heures. Cela rend la greffe de rein de rat un modèle idéal pour étudier le rejet d’allogreffe et la tolérance.

La transplantation rénale (KT) est le choix préféré du traitement pour les patients atteints d’une maladie rénale terminale. Au cours des dernières décennies, les résultats de survie à court terme après l’AC se sont améliorés de façon spectaculaire, mais les résultats de survie à long terme stagnent9. Les schémas immunosuppresseurs conventionnels demeurent le traitement antirejet standard. Cependant, l’utilisation chronique de thérapies immunosuppressives provoque une morbidité et une mortalité significatives, telles que la néphrotoxicité, le diabète et les tumeurs malignes secondaires10,11,12. À long terme, les anticorps chroniques et le rejet cellulaire menacent la survie du greffon, avec des options thérapeutiques limitées disponibles.

Un objectif majeur dans la transplantation est l’induction de la tolérance de transplantation afin d’éviter le besoin d’immunosuppression chronique. Le modèle KT de rat est un outil robuste pour étudier le processus de rejet immunologique et pour évaluer de nouvelles approches de l’immunomodulation et de la tolérance de transplantation. Le rat sert également de modèle approprié pour étudier le rejet aigu et chronique par les cellules et les anticorps,13,14,15,16,17. Ce modèle chirurgical s’est avéré être un outil fiable, reproductible et rentable pour étudier divers aspects du rejet et de la tolérance de l’allogreffe. Il est souvent utilisé pour tester de nouveaux protocoles induisant la tolérance avant d’entreprendre des études coûteuses et encombrantes sur les grands animaux. L’exécution de KT chez le rat nécessite une formation chirurgicale et une expertise approfondies pour atteindre des taux de survie de > 90%. Dans ce manuscrit et dans la vidéo d’instruction qui l’accompagne, nous fournissons un contour étape par étape pour l’AC orthotopique chez le rat, comme cela a été réalisé avec succès pendant de nombreuses années dans notre établissement.

Avant de commencer toute procédure, la sélection des donateurs et des destinataires est essentielle et dépend de la nature de l’expérience. Idéalement, les donateurs et les bénéficiaires devraient peser entre 220 et 260 g et être âgés de 8 à 12 semaines. Les animaux de moins de 220 g ont des artères, des veines et des uureters de petit diamètre, ce qui rend l’anastomose du receveur particulièrement difficile. Une légère perte de sang peut provoquer une hypovolémie et entraîner la mort chez les animaux plus petits. Les animaux de plus de 260 g affichent plus de graisses autour de leurs vaisseaux, et l’isolement des vaisseaux nécessitera plus de temps et augmentera le temps d’ischémie froide.

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Protocole

Les rats Lewis (RT11) et Dark Agouti (DA) (RT1Aa) ont été achetés auprès de vendeurs commerciaux (voir le tableau des matériaux). Ces souches complètement incompatibles avec le MHC sont souvent utilisées pour étudier le rejet de l’allogreffe rénale aiguë. Tous les animaux ont été logés et maintenus selon les directives des instituts nationaux de santé (NIH) dans une installation spécifique exempte d’agents pathogènes à l’Université Johns Hopkins. Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux.

1. procédure des donateurs

  1. Préparer et autoclaver tous les instruments chirurgicaux à utiliser dans cette procédure comme moyen de stérilisation et utiliser des gants stériles jetables pour prévenir les complications infectieuses.
  2. Anesthésier le rat donneur par inhalation d’isoflurane (induction à 3% – 4% et entretien à 1% – 2%) pour le reste de la procédure. Donner à tous les animaux donneurs et receveurs une buprénorphine préemptive sous-cutanée à 0,1 mg/kg de poids corporel pour l’analgésie.
  3. Maintenant, placez le rat dans une position décubitus dorsal et Immobilisez les membres avec du ruban adhésif stérile.
  4. Utilisez une tondeuse mécanique pour enlever les poils de la zone abdominale.
    1. Appliquez un lubrifiant pour les yeux et utilisez de la gaze stérile imbibée d’iode povidone, suivie d’une gaze imbibée d’alcool isopropylique, pour stériliser le champ chirurgical.
    2. Avant la première incision, assurez-vous que le rat est convenablement anesthésié en vérifiant l’absence du réflexe de retrait de pincement de l’orteil.
  5. En utilisant des ciseaux, commencez par faire une grande incision longitudinale de la peau et du muscle de la symphyse pubis au xiphoïde, et entrez dans la cavité péritonéale.
  6. Insérez deux rétracteurs de chaque côté de la paroi abdominale afin d’exposer la cavité intra-abdominale.
  7. Recouvrir l’intestin d’une gaze stérile humide et la déplacer vers le côté droit de l’abdomen, exposant l’aorte, la veine cave et le rein gauche. Appliquez 1 mL de solution saline préchauffée avec une seringue de 1 CC pour garder les intestins et les organes abdominaux humides et à une température normale.
    1. Appliquez une deuxième gaze humide pour couvrir et mobiliser l’estomac et la rate crânienne au rein et une petite gaze humide pour couvrir le rein exposé (figure 1a).
  8. Utiliser des pinces de dissection microchirurgicales pour isoler et mobiliser l’artère rénale gauche et la veine du tissu conjonctif et de l’autre. Isoler la veine rénale gauche en cautérant la veine gonadique gauche et isoler l’artère rénale gauche en cautérant l’artère surrénale. Après cela, mobiliser l’aorte et la veine cave supérieure et inférieure du pédicule rénal gauche en disséquant le tissu conjonctif avec des forceps disséchants (figure 1B).
  9. Diviser et mobiliser l’urètre à partir du tissu conjonctif en utilisant des pinces de dissection, et faire une incision diagonale à une longueur de 2 cm mesurée à partir du bassin rénal, en utilisant des microciseaux. Insérez un brassard en polyamide (voir le tableau des matériaux) à mi-chemin dans l’urètre et fixez le brassard en plaçant un noeud avec 8-0 suture en soie (figure 1C).
    NOTE: il est important de ne pas enlever tous les tissus graisseux et conjonctifs de l’urètre, car ils protègent contre l’obstruction causée par les adhérences, et leur élimination peut provoquer une nécrose urétrale. Prêter une attention particulière à la préservation du récipient fournissant de l’oxygène à l’urètre.
  10. Mobiliser le rein gauche en le séparant de la graisse périnéphrique en utilisant des pinces ou des microciseaux disséchants. Laissez la capsule adipeuse du rein attachée et utilisez ce site pour manipuler le rein.
    1. Exposer la veine cave inférieure.
  11. Administrer 200 unités d’héparine à l’aide d’une seringue avec une aiguille de 27 G dans la veine du pénis. Faire pression sur le site d’injection avec un coton-tige pendant au moins 1 min pour éviter les saignements.
  12. Identifiez la veine portale (PV) et la Vena cave inférieure (IVC) (figure 1D). Rincer le rein en injectant 50 mL de solution saline froide mélangée avec 500 unités d’héparine dans la veine portante à l’aide d’une aiguille de 16 G (figure 1E). Avant de rincer, coupez la veine cave inférieure au niveau infrahépatique et la veine portale caudale au site d’insertion de l’aiguille pour permettre au sang de sortir de la circulation. Commencez à rincer le rein en infutilisant graduellement la solution saline. Observez un changement de couleur du rein du rouge foncé à une couleur grise et pâle uniforme (figure 1F).
  13. Après le rinçage, ligaturer l’artère rénale et la veine proximale de l’aorte et de la veine cave et placer le rein rincé dans une boîte de Petri dans une solution saline froide sur glace. La figure 2 A représente l’aperçu schématique de la procédure de donneur.
  14. Une fois que le rein est dans une solution saline froide, fixez et immobilisez la poignée du brassard de veine (voir le tableau des matériaux) et tirez doucement la veine rénale à travers le brassard. Ensuite, fixez la veine rénale au-dessus du brassard en plaçant trois noeuds en utilisant une suture de soie de huit zéros (figure 2b).
    Remarque: prêchez une attention particulière à l’orientation de la veine tout en la fixant en place. Les veines pivotées provoquent une obstruction du flux sanguin et conduisent à une thrombose.

2. procédure du bénéficiaire

  1. Répétez les étapes 1.1 à 1.11 de la procédure de donneur.
  2. Placer deux pinces à micro-vaisseaux atraumatiques sur l’artère rénale gauche et la veine proximale de l’aorte et de la Vena cave (figure 3A).
  3. Ligate la veine rénale réceptrice proximale à l’entrée du rein. Rincer la veine rénale avec une solution saline héparinée pour éliminer tout le sang restant du vaisseau.
  4. Glissez la veine rénale ligné au-dessus de la veine rénale menottée précédemment positionnée dans le rein donneur et fixez-la avec un 8-0 suture en soie (figure 3B). Maintenez la même orientation positionnelle lorsque vous fixez la veine rénale sur le brassard.
  5. Ligate l’urètre au niveau du pôle inférieur du rein gauche. Mobilisez le rein de la graisse périnéphrique.
  6. Ligate l’artère rénale proximale à l’entrée du rein receveur. Rincer avec de la solution saline hépariné pour éliminer tout excès de sang dans le récipient. Effectuer une anastomose de bout en bout de l’artère rénale avec 8 à 10 sutures interrompues à l’aide d’une suture en nylon 10-0 (figure 3C). Manœuvre de l’artère en utilisant la couche adventitielle.
  7. Retirez les pinces du récipient pour réamorcer la reperfusion du rein. Commencez par retirer la bride de la veine suivie de la bride sur l’artère (figure 3D). Utilisez un coton-tige stérile pour faire légèrement pression sur les zones d’suintement autour de la région de l’anastomose. Quelques minutes suffisent pour obtenir une anastomose de brevet.
  8. Observez brièvement le rein pour évaluer la perfusion adéquate. Immédiatement après la reperfusion, le rein doit changer de couleur et retrouver graduellement sa couleur rouge foncé naturelle après quelques minutes (figure 3E). On observe parfois un péristaltisme visible de l’urètre et de la production d’urine sur place.
  9. Terminez en insérant la pointe exposée du brassard urétral dans l’urètre du receveur et fixez l’uétre du receveur avec un 8-0 suture en soie (figure 2C et figure 3F).
  10. Afin de maintenir en position le donneur et le receveur, attacher les extrémités de chaque côté de l’urètre les uns aux autres.
  11. En option, le rein droit peut être néphrectomisé en attachant l’artère rénale droite et la veine avec une suture de soie 4-0 et en enlevant le rein.
  12. Enlevez tous les gazes de la cavité abdominale, retournez tous les organes à leur position naturelle, injectez 1 ml de solution saline sur les intestins pour les garder humides, et fermez l’abdomen en utilisant une suture absorbable 4-0 sur le muscle rectus et une suture de soie 4-0 pour fermer la peau de manière interrompue.

3. soins postopératoires

  1. Placer l’animal dans une cage propre avec accès à l’eau et à la nourriture ad libitum et permettre la récupération sur un coussin chauffant à 37 ° c.
  2. Injecter 0,1 mg/kg de buprénorphine par voie sous-cutanée pour l’analgésie et surveiller l’animal pour le récupérer. L’administration d’analgésiques supplémentaires peut être nécessaire dans les prochains jours, en fonction des signes d’inconfort ou de douleur. Les antibiotiques ne sont pas administrés systématiquement, car les complications infectieuses sont rares.
  3. Observez la récupération pendant 1 – 2 h avant de retourner l’animal à l’animalerie. Inspecter l’animal 2x – 3x par jour pendant les 24 premiers h, suivi d’une inspection quotidienne. Faites attention aux signes de douleur et de détresse, d’ingestion orale et de sortie urinaire.
  4. Retirez les mailles 7 – 10 jours après l’opération.

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Résultats

Nous avons effectué des greffes de rein syngéniques (n = 5) et allogéniques (n = 5). Les animaux ayant une greffe syngénique ont atteint une survie à long terme sans traitement immunosuppresseur. Les animaux qui ont reçu une greffe allogénique sans immunosuppression ont rejeté leur greffe et succombé à une insuffisance rénale avec une survie médiane de 8 jours (figure 4a). La créatinine sérique moyenne a augmenté modestement dans le groupe syngénique alors ...

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Discussion

Dans ce manuscrit, nous décrivons en détail la méthode chirurgicale pour l’AC orthotopique chez le rat, y compris tous les équipements nécessaires pour effectuer cette procédure (figure 5). En 1965, Fisher et Lee ont publié le premier rapport sur l’AC chez les rats, qui est devenu le début d’un champ d’investigation passionnant18. Depuis lors, de nombreuses modifications ont été introduites pour améliorer la reproductibilité de ce modèle. Il a servi de modèle animal e...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été financé par un don généreux du domaine familial Bombeck.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Buprénorphine HCLReckitt Benckiser Healthcare UKNDC12496-0757-5
Pince à dissection, incurvéeZhenbang, Chine11cm Poignée plate  ;
Héparine sodique injectable USPSagent Pharmaceuticals  ;NDC25021-400-10
Micro-pinces, droites, lissesJingzhong, ChineWA3010
Micro porte-aiguillesJingzhong, ChineWA2010
Micro pinces pour récipientsJingzhong, ChineWA40120
Micro ressort sciccor 1ROBOZRS-5620
Micro ressort sciccor 2F.S.T.91501-09
Micro ressort sciccor 3Zhenbang, Chine8.5cm Vannas, incurvé
Prograf (Tacrolimus/FK506)Astellas
RatsCharles River & Biosciences Taconiques  ;LEW/Crl & DA-M  ;
ShaverWahl79600-2101
Suture 4-0EthiconJ304H
Suture, 4-0  ;Suture Ethicon683G
, 10-0  ;Ethicon2820G
Seringues & AiguillesBD
Fil, 8-0Ashaway75290
Manchette urétéraleMicrolumen160-1Tube en polymide, Diamètre 0,41 mm  ;
Ballon veineuxIntramedic BD7441PE-200 Tube en polyéthylène non radio-opaque ID : 1,4 mm, OD : 1,9 mm

Références

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