Analyse du développement de la chambre cardiaque durant l’embryogenèse de souris à l’aide de toute monture épifluorescence

Résumé

Nous présentons les protocoles afin d’examiner le développement de coeur de souris au microscope de toute monture épifluorescente sur des embryons de souris disséqués de ventriculaire spécifiques MLC-2v-tdTomato journaliste souris knock-in. Cette méthode nous permet de directement visualiser chaque étape de la formation ventriculaire au cours du développement de coeur de souris sans fastidieuses méthodes histochimiques.

Résumé

Le but du présent protocole est de décrire une méthode pour la dissection des embryons de souris et la visualisation des cavités ventriculaires embryonnaires de souris au cours du développement de coeur à l’aide de la souris knock-in ventriculaire journaliste fluorescents spécifiques (MLC-2v-tdTomato souris). Développement de coeur implique une formation du tube cardiaque linéaire, le tube de coeur looping et quatre chambre septation. Ces processus complexes sont hautement conservées chez tous les vertébrés. Le coeur embryonnaire de souris a été largement utilisé pour les études sur le développement cardiaque. Toutefois, en raison de leur taille extrêmement petite, coeurs embryonnaires de souris de dissection est techniquement difficile. En outre, visualisation de formation de chambre cardiaque souvent a besoin d’hybridation in situ, bêta-galactosidase, coloration à l’aide de la souris journaliste LacZ ou immunostaining des coeurs embryonnaires sectionnés. Ici, nous décrivons comment disséquer coeurs embryonnaires de souris et de visualiser directement formation chambre ventriculaire du MLC-2v-tdTomato de souris au microscope toute monture épifluorescente. Avec cette méthode, il est possible d’examiner directement la formation du tube cardiaque et une boucle et quatre formation de chambre sans plus loin la manipulation expérimentale des embryons de souris. Bien que la ligne de souris knock-in journaliste MLC-2v-tdTomato est utilisée dans le présent protocole à titre d’exemple, le présent protocole peut être appliqué aux autres lignées de souris transgéniques journaliste fluorescents spécifiques à cœur.

Introduction

Formation de chambre pendant le développement du cœur est un processus complexe qui passe par plusieurs stades embryonnaires morphologiquement distinctes^1,2. La forme en croissant de progéniteurs cardiaques de population forme un tube cardiaque linéaire et puis subit une élongation et une boucle pour obtenir la forme de la spirale du coeur en développement. Après son processus de cloisonnement, le coeur en développement se transforme en le cœur à quatre cavités. Interruption de le quelconque de ces processus résulte du développement de cardiopathies congénitales. Ainsi, il est important de comprendre les mécan....

Protocole

Toutes les procédures d’animaux ont été effectués avec l’approbation du comité de l’emploi et Vanderbilt University Medical Center institutionnels animalier.

1. la collecte des embryons et la dissection de la souris

1. S’accouplent MLC-2v-tdTomato^+/- souris femelles vieux de 8 à 10 semaine avec MLC-2v-tdTomato^+/- souris mâles âgé de 8-10 semaine pour obtenir le MLC-2v-tdTomato^{+ / +}, tdTomato-2v-MLC^+/- et MLC-2v-tdTomato^{- / -} embryons.
2. Vérifier les barrages pour bouchons vaginales tous les matins. Midi le jour de la détection plug vaginal est considéré comme E0.5.
   Rem....

Résultats

Au cours du développement du cœur, MLC-2v est considéré comme le premier marqueur pour chambre ventriculaire spécification¹⁷. Comme illustré à la Figure 1, nous avons disséqué les embryons entiers de souris et coeurs embryonnaires de souris MLC-2v-tdTomato journaliste knock-in et examiné MLC-2v-tdTomato expression du rapporteur au cours du développement du cœur. Dans souris mise knock-in journaliste MLC-2v-tdTomato, expression constitu.......

Discussion

La méthode décrite ici est relativement simple d’examiner le développement chambre ventriculaire, sans effectuer des expériences à forte main-d'oeuvre pour étiqueter ventriculaires ou cardiaque spécifique des gènes de structure ou de protéines. Ainsi, cette méthode minimise les variabilités techniques qui souvent trouvées dans les sections de cœur immunostained.

Il y a deux étapes cruciales pour réaliser avec succès cette méthode notamment l’évaluation précise de l’âge embryonnaire de souris e.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
microscope de dissection	Leica	MZ125
Échelle d’ADN (100 pb)	Promega	G2101
	Leica	M165 FC
GoTaq Green master Mix	Promega	M712
Machine PCR (maître cycleur)	Eppendorf	6336000023