Article de méthode

Procédure d'exploitation standard pour la surveillance du Lyssavirus de la population de chauves-souris à Taiwan

DOI :

10.3791/59421

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27 août 2019

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1Animal Health Research Institute, Council of Agriculture, Executive Yuan, 2Institute of Ecology and Evolutionary Biology, National Taiwan University, 3Bat Conservation Society of Taipei

Dans cet article

Résumé

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Ce protocole introduit une procédure d'exploitation de laboratoire standard pour l'essai diagnostique des antigènes de lyssavirus dans les chauves-souris à Taiwan.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les virus du genre Lyssavirus sont des agents pathogènes zoonotiques, et au moins sept espèces de lyssavirus sont associées à des cas humains. Parce que les chauves-souris sont des réservoirs naturels de la plupart des lyssavirus, un programme de surveillance du lyssavirus des chauves-souris a été menée à Taiwan depuis 2008 pour comprendre l'écologie de ces virus chez les chauves-souris. Dans le le but, des organisations non gouvernementales de conservation des chauves-souris et des centres locaux de lutte contre les maladies animales ont coopéré pour recueillir les chauves-souris mortes ou les chauves-souris qui meurent de faiblesse ou de maladie. Les tissus cérébraux des chauves-souris ont été obtenus par autopsie et soumis à l'essai fluorescent direct d'anticorps (FAT) et à la réaction en chaîne de polymère de transcription inverse (RT-PCR) pour la détection des antigènes de lyssavirus et des acides nucléiques. Pour la FAT, au moins deux conjugués différents de diagnostic de rage sont recommandés. Pour le RT-PCR, deux ensembles d'amorces (JW12/N165-146, N113F/N304R) sont utilisés pour amplifier une séquence partielle du gène nucléoprotéine de lyssavirus. Ce programme de surveillance surveille les lyssavirus et autres agents zoonotiques chez les chauves-souris. Taiwan bat lyssavirus est trouvé dans deux cas de la pipistrelle japonaise (Pipistrellus abramus) en 2016-2017. Ces résultats devraient informer le public, les professionnels de la santé et les scientifiques des risques potentiels de communiquer avec les chauves-souris et d'autres espèces sauvages.

Introduction

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Les virus du genre Lyssavirus sont des agents pathogènes zoonotiques. Il existe au moins sept espèces de lyssavirus associées à des cas humains1. En plus des 16 espèces de ce genre1,2,3, Taiwan chauve-souris lyssavirus (TWBLV)4 et Kotalahti chauve-souris lyssavirus5 ont été récemment identifiés chez les chauves-souris, mais leurs statuts taxonomiques n'ont pas encore être déterminés.

Les chauves-souris sont les hôtes naturels de la plupart des lyssavirus, à l'exception de Mokola lyssavirus et Ikoma lyssavirus, qui n'ont pas encore été identifiés chez les chauves-souris1,2,3,6. L'information sur les lyssavirus chez les chauves-souris asiatiques est encore limitée. Deux lyssavirus non caractérisés chez les chauves-souris asiatiques (l'un en Inde et l'autre en Thaïlande)7,8 ont été signalés. Un cas de rage humaine associé à une morsure de chauve-souris en Chine a été rapporté en 2002, mais le diagnostic a été fait seulement par observation clinique9. En Asie centrale, aravan lyssavirus a été identifié dans la chauve-souris à oreilles de souris inférieure (Myotis blythi) au Kirghizistan en 1991, et Le lyssavirus de Khujand a été identifié dans la chauve-souris moustachue (Myotis mystacinus) au Tadjikistan en 200110. En Asie du Sud, Gannoruwa bat lyssavirus a été identifié chez le renard volant indien (Pteropus medius) au Sri Lanka en 20153. En Asie du Sud-Est, plusieurs études sérologiques sur les chauves-souris aux Philippines, en Thaïlande, au Bangladesh, au Cambodge et au Vietnam ont montré une séroprévalence variable11,12,13,14, 15. Bien que le lyssavirus d'Irk a été identifié dans la plus grande chauve-souris à nez tubulaire (Murina leucogaster) dans la province de Jilin, Chine en 201216, l'espèce exacte et l'emplacement des lyssavirus dans les populations de chauves-souris d'Asie de l'Est restent inconnus.

Pour évaluer la présence de lyssavirus dans les populations de chauves-souris taïwanaises, un programme de surveillance utilisant à la fois la FAT directe et le RT-PCR a été lancé. Taiwan bat lyssavirus a été identifié dans deux cas de pipistrelle japonaise (Pipistrellus abramus)4 en 2016-2017. Dans le présent article, une procédure d'opération standard de laboratoire est introduite pour la surveillance de lyssavirus de la population de chauves-souris à Taiwan. Le diagramme de flux du diagnostic de lyssavirus de chauve-souris dans notre laboratoire est présenté dans la figure 1.

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Protocole

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1. Précautions de sécurité lors de la manipulation des lyssavirus

  1. Veiller à ce que tous les travailleurs de laboratoire qui manipulent des échantillons de chauves-souris reçoivent une prophylaxie antirabique pré-exposition17. Surveiller les niveaux d'anticorps antirabiques des travailleurs à l'avance et les réexaminer tous les 6 mois17. La vaccination de suivi contre la rage est nécessaire pour ceux dont les niveaux d'anticorps sont inférieurs à 0,5 UI/mL17.
  2. Selon les règlements de biosécurité du pays où se trouve le laboratoire, assurez-vous que les procédures suivantes sont effectuées dans des laboratoires appropriés de niveau de biosécurité (p. ex., les laboratoires BSL-2 à Taiwan et les laboratoires BSL-3 en Australie), et que les travailleurs sont actuellement qualifiés et portent un équipement de protection individuelle approprié18.
    REMARQUE : La vaccination contre la rage offre peu ou pas de protection contre les lyssavirus appartenant aux phylogroupes II et III18. Les travailleurs doivent être informés que plusieurs agents pathogènes zoonotiques ont été identifiés chez les chauves-souris19 et doivent manipuler des échantillons dans des conditions de laboratoire appropriées au niveau de la biosécurité avec un équipement de protection individuelle approprié.

2. Collecte d'échantillons

  1. Utilisation trouvée chauves-souris faibles ou malades ou des carcasses.
    REMARQUE : Les chauves-souris faibles ou malades sont livrées à la Bat Conservation Society of Taipei pour des soins vétérinaires ou de la recherche, tandis que les carcasses sont soumises directement à l'Institut de recherche en santé animale. Aucune chauve-souris en bonne santé n'a été euthanasiée dans ce programme de surveillance.
  2. Demandez à un écologiste chauve-souris d'identifier les espèces de chauves-souris au moyen de caractéristiques morphologiques20.
  3. Effectuer le codage à barres de l'ADN de l'espèce chauve-souris lorsque le lyssavirus positif est diagnostiqué, en utilisant des procédures publiées précédemment21.
  4. Soumettez une fiche d'information de chaque carcasse de chauve-souris (site de collecte, espèces, signes cliniques, etc.).

3. Nécropsie de spécimens de chauves-souris

  1. Préparer les matériaux.
    1. Préparer un tableau de dissection propre et placer un tampon absorbant stérile pour l'autopsie.
    2. Préparer les tubes de collecte pour la collecte des organes de chauve-souris.
    3. Préparer des pinces jetables et des scalpels pour l'autopsie. Changez d'outils entre l'autopsie de chaque chauve-souris. Préparer les boules de coton humidifiées avec 70 % d'éthanol pour nettoyer les pinces et les scalpels pendant l'échantillonnage.
    4. Préparer deux lames de microscope pour le FAT. Recueillir des spécimens frais et les fixer dans la solution formaline pour l'examen histopathologique.
  2. Examiner tous les orifices externes avant l'autopsie. Photographiez les caractéristiques externes de la chauve-souris, en particulier la tête, les oreilles et les ailes, pour la différenciation des espèces.
  3. Recueillir un échantillon d'écouvillonoral. Placer la chauve-souris dans la charge ventrale sur la planche et fixer la tête de la chauve-souris avec une pince à épiler. Couper la peau le long de la ligne médiane de la calvaria avec un scalpel et tirer la peau sur les côtés latéraux. Couper le crâne le long de la ligne médiane de la calvaria avec un scalpel et l'ouvrir avec une pince à épiler pour exposer le tissu cérébral.
  4. Retirez le tissu cérébral du crâne et placez-le sur un dépresseur de langue stérile, et faites des frottis d'impression du tissu cérébral (voir l'étape 4.2). Recueillir un petit morceau de tissu cérébral frais et le fixer en formaline pour l'examen histopathologique. Contenir le tissu cérébral restant dans un tube pour l'extraction d'acide nucléique.
  5. Nettoyer les pinces et le scalpel avec des boules de coton humidifiées avec 70% d'éthanol pour enlever les tissus conservés entre la collecte des spécimens.
  6. Placez la chauve-souris sur la planche en documbency dorsal et fixez-la sur la planche avec des aiguilles des deux côtés de l'axille et du talon arrière.
  7. Inciser la peau le long de la ligne médiane du corps de la mandibule à l'anus. Soulevez et séparez la peau et les tissus musculaires sous-jacents à l'œilplé. Recueillir les glandes salivaires, qui sont près de l'os mandibulaire.
  8. Soulevez légèrement le sternum à l'œil plàou, et coupez le sternum et la paroi abdominale le long de la ligne médiane à l'eau avec un scalpel. Couper les clavicules avec un scalpel. Fixer les cages thoraciques gauche et droite sur la planche avec des aiguilles pour ouvrir la cavité thoracique.
  9. Enregistrez les lésions brutes et le degré de changement post-mortem.
  10. Retirer les tissus viscéraux (c.-à-d. le cœur, les poumons, le foie, les reins, les intestins) de la carcasse à l'aide d'une pince à épiler et d'un scalpel. Recueillir les spécimens viscéraux au besoin pour la recherche future.
    REMARQUE : La collecte d'échantillons en double est recommandée. L'un doit être recueilli pour le diagnostic moléculaire, et l'autre doit être congelé à -80 oC avec ou sans moyen de transport viral pour la culture virale22.

4. Test direct d'anticorps fluorescents (FAT)

  1. Faites des frottis d'impression du tissu cérébral pour le FAT. Effectuer le FAT comme décrit précédemment18,23 avec les modifications suivantes.
  2. Séparez doucement le tissu cérébral du tissu nerveux connecté avec des pinces à épiler et transférez le tissu cérébral à un dépresseur de langue stérile. Couper la section transversale du cerveau, y compris le tronc cérébral et le cervelet18,23. Faites des frottis d'impression du tissu cérébral en touchant légèrement la surface coupée du tissu cérébral, et appuyez sur la diapositive sur le tissu de lentille pour enlever l'excès de tissu.
  3. Fixer les lames avec de l'acétone à -20 oC pendant 30 min. Séchez les glissières testées et les contrôles positifs et négatifs avant de les tacher avec conjugué.
  4. L'utilisation de chacun des deux anticorps antirabiques conjugués au FITC disponibles dans le commerce pour la coloration de l'antigène du lyssavirus est fortement recommandée23. Déterminer la concentration de travail de la conjuguée commerciale avant la première coloration. Déposer les conjugués dilués à l'intérieur d'un filtre à seringues de 0,45 M sur les lames et les couver à 37 oC pendant 30 min dans une chambre humide.
  5. Égoutter l'excédent conjugué des lames et laver les lames avec de la saline tamponnée par le phosphate (PBS) après l'incubation.
  6. Déposer une petite quantité de 10 % de glycérol sur les glissières et recouvrir de lames de couverture.
  7. Examinez les diapositives à l'utilisation d'un microscope fluorescent.

5. Extraction d'acide nucléique

  1. Ajouter le volume approprié de MEM-10 (milieu essentiel minimum complété par 10% de sérum bovin fœtal) au tissu cérébral (10% w/v).
  2. Homogéner le tissu cérébral avec une perle d'acier de 5 mm dans un instrument d'homogénéisateur et une centrifugeuse à 825 x g pendant 10 min.
  3. Extraire l'acide nucléique, dont le volume final est de 50 l, à moins de 200 l du supernatant à l'aide du kit d'extraction total d'acide nucléique disponible dans le commerce avec instrument.

6. RT-PCR et analyse phylogénétique

REMARQUE : Plusieurs ensembles d'amorces ont été publiés pour détecter tous les lyssavirus connus ou lyssavirus spécifiques. Le protocole décrit ici est un exemple que notre laboratoire utilise et peut ne pas répondre à tous les besoins expérimentaux. Sélectionnez des amorces appropriées en fonction des besoins du laboratoire.

  1. Préparer le réactif RT-PCR en une seule étape comme suit : ajouter 5 l d'acide nucléique extrait au mélange de réaction contenant 2,5 l de tampon de réaction 10x, 0,5 L d'amorces avant et inverse (10 M de chacun), 4 l de 1,25 m dNTP, 0,3 l d'inhibiteur de la RNase (40 U/L) , 0,3 L de transcriptase inversée (10 U/L), 0,4 l de polymérase d'ADN (5 U/L) et 11,5 l d'eau traitée par LE DEPC.
    REMARQUE : L'ensemble d'amorces utilisé dans ce protocole est JW12 (5'-ATGTAACACCTACAATG-3') et N165-146 (5'-GCAGGGTAYTTRTACTCATA-3')24. Modifier la préparation des réactifs et des conditions de cyclisme en fonction des ensembles d'amorce utilisés.
  2. Effectuer le cyclisme dans les conditions suivantes : incubation à 42 oC pendant 40 min; dénaturation initiale à 94 oC pendant 10 min; 35 cycles de 94 oC pour 30 s, 55 oC pour 30 s et 72 oC pour 30 s; et enfin, une extension ultérieure à 72 oC pendant 10 min.
  3. Utilisez un autre ensemble d'amorce ou plus pour augmenter la sensibilité diagnostique.
    1. Utilisez N113F (5'-GTAGGATGCTATATGGG-3') et N304R (5'-TTGACGAAGATCTTGCTCAT-3')25,26 pour préparer le réactif RT-PCR en une seule étape comme suit: ajouter 5 'L d'acide nucléique extrait à un mélange de réaction contenant 5 'L de 10x tampon, 5 'L de amorces avant et inversées (4 M de chacun), 5 L de 1,25 md dNTP, 0,5 l d'inhibiteur de la RNase (40 U/L), 0,2 L de transcriptase inversée (10 U/L), 1 l de polymérase d'ADN (5 U/L) et 23,3 l d'eau traitée par DEPC.
    2. Effectuer le cyclisme dans les conditions suivantes : incubation à 42 oC pendant 40 min; dénaturation initiale à 95 oC pendant 5 min; 35 cycles de 95 oC pour 1 min, 55 oC pour 1 min et 20 s, et 72 oC pour 1 min; et enfin, une extension ultérieure à 72 oC pendant 10 min.
      REMARQUE : Selon les besoins de laboratoire, choisissez des amorces appropriées pour le diagnostic. N113F a été initialement conçu pour l'amplification du virus de la rage, mais il peut ne pas fonctionner bien pour d'autres lyssavirus. L'ensemble de N113F et N304R fonctionne bien pour le virus de la rage (variante du blaireau de furet de Taiwan) et le lyssavirus de chauve-souris de Taiwan. Il sera plus facile d'obtenir des séquences de nucléoprotéines entières en utilisant l'ensemble des amorces JW12 et N304R si le lyssavirus est amplifié par les deux ensembles d'amorces ci-dessus.
  4. Analyser le produit PCR sur 2% électrophoresis gel agarose et visualiser par éclairage de lumière UV.
  5. Séquencer le produit PCR par service de séquençage commercial.
  6. Entrez ou téléchargez la séquence sur la page Web de l'outil de recherche local de base sur l'alignement nucléotide (BLAST). Sélectionnez la base de données « autres (nr etc.) » et entrez dans l'organisme sous le titre Lyssavirus. Sélectionnez l'algorithme MegaBlast et exécutez le BLAST.

7. Isolement du virus

REMARQUE : Effectuez l'isolement de virus quand 1) le FAT ou 2) le RT-PCR indique la positivité.

  1. Homogénéiser le spécimen du cerveau dans une suspension de 10% (w/v) dans MEM-10. Centrifugeuse à 825 x g pendant 10 min.
  2. Inoculer 200 l de supernatant avec une suspension de 3 x 106 cellules MNA (neuroblastome de souris) dans 1 ml de MEM-10 pour 1 h à 37 oC avec 1% de CO2. Transférer la suspension à cellules homogénéiques du cerveau à un flacon de 25 cm2 et ajouter 6 ml de MEM-10.
  3. Cultivez 1 ml de suspension à cellules homogénéiques du cerveau dans un toboggan en verre à 4 puits recouvert de téflon de 6 mm de diamètre en même temps.
  4. Après 3 à 4 jours d'incubation à37 oC avec 1 % de CO 2, fixez les cellules sur la diapositive de 4 puits avec 100 % d'acétone (v/v).
  5. Tainer les diapositives avec deux anticorps antirabiques conjugués au FITC suivant les étapes 4.4-4.7. Les cellules sont infectées lorsque les inclusions intracytoplasmiques sont étudiées. Enregistrez le pourcentage de cellules infectées.
  6. Effectuer la trypsinisation et la sous-culture de la culture cellulaire inoculée lorsque les diapositives sont tachées comme négatives:
    1. Retirer le milieu et rincer le flacon avec 5 ml de PBS.
    2. Ajouter 1 ml de trypsine dans le flacon et frapper fermement le fond du flacon.
    3. Ajouter 6 ml de MEM-10 et resuspendre les cellules.
    4. Mettre la suspension cellulaire dans un nouveau flacon de tissu (6 ml) et sur une glissière de 4 puits (1 ml).
  7. Répéter les étapes 7,4 à 7,6 jusqu'à ce que l'infectiosité à 100 % soit atteinte.
  8. Recueillir le supernatant après 24 h d'incubation.

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Résultats

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De 2014 à mai 2017, 332 carcasses de chauves-souris de 13 espèces ont été recueillies pour surveillance. Deux ont été testés positifs. Dans le premier cas de chauve-souris, l'impression cérébrale a donné un résultat négatif à l'aide du FAT avec l'un des anticorps antirabiques conjugués au FITC (figure 2), tandis que les RT-PCR employant chacun des deux ensembles d'amorces (JW12/N165-146, N113F/N304R) ont donné résultats positifs (figure 3). Une séquence de 428 b...

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Discussion

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Cette procédure d'exploitation standard de laboratoire (SOP) fournit un processus de série pour tester des échantillons de chauve-souris pour la présence d'antigènes de lyssavirus à Taiwan. Les principales étapes comprennent l'emploi de FAT et RT-PCR. La sélection d'échantillons appropriés et l'isolement réussi du virus sont également importants. En outre, un certain dépannage a été effectué pendant la surveillance des lyssavirus chauves-souris. La principale différence était les animaux cibles. Initialement (2008-2009),...

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Déclarations de divulgation

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Aucun conflit d'intérêts n'est déclaré.

Remerciements

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Nous remercions Tien-Cheng Li, Yi-Tang Lin, Chia-Jung Tsai et Ya-Lan Li pour leur aide au cours de cette étude. Cette étude a été appuyée par la subvention no 107AS-8.7.1-BQ-B2 (1) du Bureau of Animal and Plant Health Inspection and Quarantine, Council of Agriculture, Executive Yuan, Taiwan.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
2,5 % Trypsine (10x)Gibco15090046Trypsine
25 cm2 flaconGreiner bio-one690160
AcétoneHoneywell32201-1L
Agarose IVWR Life Science97062-250
AlcoolNIHON SHIYAKU RÉACTIFNS-32294
AMV Transcriptase inversePromegaM5101
Antibiotique-Antimycosique(100X)  ;Gibco15240-062MEM-10
LameBraunBA215
Centrifugeuseeppendorf5424R
Système de chimilumineanceTOP BIO CO.MGIS-21-C2-1M
Tube de collecteQiagen990381
Tube de collecteSSI2341-SO
Lame de couvertureMuto Pure chemical Co., LTD.24505
Analyseur d’ADNApplied Biosystems3700XL
Sérum fœtal bovinGibco10437028MEM-10
FITC Anti-Rabies Monoclonal GlobulinFujirebio Diagnostic Inc.800-092Anticorps antirabiques conjugués FITC : réactif B
Lame de verre à quatre puits avec revêtement en téflonThermo Fisher Scientific30-86H-WHITE
Système d’électrophorèse sur gelMajor ScienceMJ-105-R
HBSS (1x)Gibco14175095Incubateur de trypsine
ASTECSCA-165DS
Microscope inverséOlympusIX71
L-Glutamine 200 mM (100x)GibcoA2916801MEM-10
LIGHT DIAGNOSTICS Réactif de graisse antirabiqueEMD Millipore Corporation5100Anticorps antirabiques conjugués FITC : réactif A
MagNA Pure Compact InstrumentRoche03731146001
MagNA Pure Compact NA Isolation Kit 1Roche03730964001
MEM (10x)Gibco11430030MEM-10
MEM NEAA (100x)Gibco11140050MEM-10
MEM solution vitaminiqueGibco11120052MEM-10
NaHCO3Merck1.06329.0500MEM-10
AiguilleTerumoNN*2332R9
PBSMedicago09-8912-100
Synthèse d’amorcesMission Biotech
RNasin inhibiteur de ribonucléasePromegaN2111
Service de séquençageMission Biotech
SlideThermo ScientificAA00008032E00MNT10
Pyruvate de sodium (100 mM)Gibco11360070MEM-10
Perles d’acier inoxydableQIAGEN69989
Tampon absorbant stérile3M1604T-2
Filtre à seringueNalgene171-0045
Taq polyméraseJMR HoldingsJMR-801
ThermocycleurApplied Biosystems2720
TissueLyser IIQIAGEN85300
Abaisse-langueHONJER CO., LTD.
pince à épilerTennyson instrument médical en développement CO., LTD.A0601
Tartrate de tylosineSigmaT6271-10GMEM-10
122246

Références

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