Évaluation d’une réaction en chaîne de polymérase de transcription inverse imbriquée universelle pour la détection des lyssavirus

Résumé

Une réaction en chaîne de polymérase de transcription inverse imbriquée de Pan-lyssavirus a été développée pour détecter spécifiquement tous les lyssavirus connus. La validation à l’aide d’échantillons de cerveau de la rage de différentes espèces animales a montré que cette méthode a une sensibilité et une spécificité équivalentes au test d’anticorps fluorescent étalon-or et pourrait être utilisée pour le diagnostic systématique de la rage.

Résumé

Pour détecter le virus de la rage et d’autres espèces membres du genre lyssavirus au sein de la famille des Rhabdoviridae, la réaction en chaîne de polymérase de transcription inverse imbriquée de Pan-LYSSAVIRUS (RT-PCR imbriquée) a été développée pour détecter la région conservée du gène nucléoprotéique (N) des lyssavirus. La méthode applique la transcription inversée (RT) en utilisant l’ARN viral comme modèle et oligo (DT)₁₅ et les hexamères aléatoires comme amorces pour synthétiser l’ADN complémentaire viral (CDNA). Ensuite, l’ADNc viral est utilisé comme un modèle pour amplifier un fragment de gène de BP N de 845 dans la PCR de première ronde utilisant des amorces externes, suivi par la PCR imbriquée de deuxième ronde pour amplifier le fragment final de BP de 371 utilisant des amorces internes. Cette méthode peut détecter différents clades génétiques des virus de la rage (RABV). La validation, en utilisant 9 624 échantillons de cerveau de huit espèces animales domestiques dans 10 ans de diagnostics cliniques de rage et de surveillance en Chine, a montré que la méthode a 100% de sensibilité et 99,97% de spécificité par rapport à la fluorescence directe test d’anticorps (FAT), la méthode étalon-or recommandée par l’Organisation mondiale de la santé (OMS) et l’Organisation mondiale de la santé animale (OIE). En outre, la méthode pourrait également amplifier spécifiquement le fragment de gène N ciblé de 15 autres espèces de lyssavirus approuvées et deux nouvelles, dans le 10e rapport du Comité international sur la taxonomie des virus (ICTV), tel qu’évalué par une détection mimique de N plasmides génétiques de tous les lyssavirus. La méthode fournit une alternative pratique au FAT pour le diagnostic de la rage et a été approuvée en tant que norme nationale (GB/T36789) de la Chine.

Introduction

La rage est une maladie zoonotique mondiale causée par des virus dans le genre lyssavirus¹. Les lyssavirus (famille Rhabdoviridae) sont des virus à ARN monocaténaires avec un génome d’environ 12 kb qui encode cinq protéines: N, phosphoprotéine (P), protéine matricielle (M), glycoprotéine (G), et la grande protéine ou polymérase (L). À partir des séquences nucléotidiques du gène N, de la distance génétique et des schémas antigéniques, les lyssavirus ont été divisés en 16 espèces, comprenant le virus de la rage classique (RABV) et les virus liés à la rage (RRV): le virus de la chauve-souris de Lagos (LBV), le virus Duvenhage (DU....

Protocole

L’utilisation de souris dans ce protocole a été approuvée par le Comité administratif sur le bien-être des animaux de l’Institut de médecine vétérinaire militaire, l’Académie des sciences médicales militaires, Chine (autorisation du Comité d’utilisation et de soins des animaux de laboratoire, permis numéro JSY-DW-2010-02). Toutes les directives institutionnelles et nationales pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire ont été suivies.

1. extraction d’ARN

1. Extraire l’ARN des tissus cérébraux soupçonnés de rage, des biopsies cutanées, de la salive ou du LCR ou de la culture cellulaire infectée par le RABV, en utilisant ....

Résultats

Les résultats de la RT-PCR imbriquée pour détecter 18 espèces de lyssavirus sont présentés dans la figure 1. Tous les contrôles positifs de PCR ont montré les 845 BP attendus dans le premier et le 371 BP dans les amplifications de deuxième cycle sans bande dans le contrôle négatif. Tous les 18 lyssavirus ont produit les bandes de 845 et/ou de 371 BP attendues, ce qui indique que la RT-PCR imbriquée a détecté tous les 18 lyssavirus. Seize plasmides de lyssavirus avaient une amplification effi.......

Discussion

Actuellement, le RABV est un lyssavirus majeur responsable de la quasi-totalité de la rage humaine et animale en Chine, ainsi que dans d’autres pays. En outre, une variante de l’IRKV a été identifiée pour la première fois à partir d’une chauve-sourisurina leucogaster de Mdans la province de Jilin, dans le nord-est de la Chine, en 2012, et il a été rapporté que la mort d’un chien dans la province du Liaoning était de 2017¹¹. Plus récemment, un nouveau lyssa.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
50 & fois ; TAE	Divers	Divers
6 & ; tampon de chargement	TakaRa	9156
Agarose	US Everbright® ; Inc	A-2015-100g
ddH2O	Divers
Marqueur DL 2 000	Takara	3427A
dNTPs (10 mM)	TakaRa	4019
dNTPs (2,5 mM)	TakaRa	4030
	Tanon	EPS300
Ex-Taq (5 U/&mu ; L)	TakaRa	RR001
Système d’imagerie en gel	UVITEC	Fire Reader Tubes
microcentifuge	Divers	Divers
M-MLV transcriptase inverse (200 UI/µ ; L)	TakaRa	2641A  ;
Spectrophotomètre NanoDrop 1000	Thermoscientifique	ND1000
Oligo (dT)15	TakaRa	3805
Machine PCR	BIO-RAD	T100
Tubes PCR	Divers
Phusion ADN haute fidélité Polyméarase	NEW ENGLAND BioLabs	M0530S
Pipettors	Divers	Divers
Amorce aléatoire	TakaRa	3801
Inhibiteur de la RNase (40 UI/µ ; L)	TakaRa	2313A
RNase ddH2O	TakaRa	9102
Taq Buffer (10× ;)	TakaRa	9152A
Embouts	Divers	Divers
Mélangeur Vortex	Divers