Évaluation d’une réaction en chaîne de polymérase de transcription inverse imbriquée universelle pour la détection des lyssavirus

Résumé

Une réaction en chaîne de polymérase de transcription inverse imbriquée de Pan-lyssavirus a été développée pour détecter spécifiquement tous les lyssavirus connus. La validation à l’aide d’échantillons de cerveau de la rage de différentes espèces animales a montré que cette méthode a une sensibilité et une spécificité équivalentes au test d’anticorps fluorescent étalon-or et pourrait être utilisée pour le diagnostic systématique de la rage.

Résumé

Pour détecter le virus de la rage et d’autres espèces membres du genre lyssavirus au sein de la famille des Rhabdoviridae, la réaction en chaîne de polymérase de transcription inverse imbriquée de Pan-LYSSAVIRUS (RT-PCR imbriquée) a été développée pour détecter la région conservée du gène nucléoprotéique (N) des lyssavirus. La méthode applique la transcription inversée (RT) en utilisant l’ARN viral comme modèle et oligo (DT)₁₅ et les hexamères aléatoires comme amorces pour synthétiser l’ADN complémentaire viral (CDNA). Ensuite, l’ADNc viral est utilisé comme un modèle pour amplifier un fragment de gène de BP N de 845 dans la PCR de première ronde utilisant des amorces externes, suivi par la PCR imbriquée de deuxième ronde pour amplifier le fragment final de BP de 371 utilisant des amorces internes. Cette méthode peut détecter différents clades génétiques des virus de la rage (RABV). La validation, en utilisant 9 624 échantillons de cerveau de huit espèces animales domestiques dans 10 ans de diagnostics cliniques de rage et de surveillance en Chine, a montré que la méthode a 100% de sensibilité et 99,97% de spécificité par rapport à la fluorescence directe test d’anticorps (FAT), la méthode étalon-or recommandée par l’Organisation mondiale de la santé (OMS) et l’Organisation mondiale de la santé animale (OIE). En outre, la méthode pourrait également amplifier spécifiquement le fragment de gène N ciblé de 15 autres espèces de lyssavirus approuvées et deux nouvelles, dans le 10e rapport du Comité international sur la taxonomie des virus (ICTV), tel qu’évalué par une détection mimique de N plasmides génétiques de tous les lyssavirus. La méthode fournit une alternative pratique au FAT pour le diagnostic de la rage et a été approuvée en tant que norme nationale (GB/T36789) de la Chine.

Introduction

La rage est une maladie zoonotique mondiale causée par des virus dans le genre lyssavirus¹. Les lyssavirus (famille Rhabdoviridae) sont des virus à ARN monocaténaires avec un génome d’environ 12 kb qui encode cinq protéines: N, phosphoprotéine (P), protéine matricielle (M), glycoprotéine (G), et la grande protéine ou polymérase (L). À partir des séquences nucléotidiques du gène N, de la distance génétique et des schémas antigéniques, les lyssavirus ont été divisés en 16 espèces, comprenant le virus de la rage classique (RABV) et les virus liés à la rage (RRV): le virus de la chauve-souris de Lagos (LBV), le virus Duvenhage (DUVV ), Mokola virus (MOKV), European bat lyssavirus 1 (EBLV-1), European bat lyssavirus 2 (EBLV-2), Australian bat lyssavirus (ABLV), Aravan virus (ARAV), Ikoma virus (IKOV), Bokeloh bat lyssavirus (BBLV), Gannoruwa bat lyssavirus (GBLV), Irkut virus (IRKV), Khujand virus (KHUV), virus de la chauve-souris du Caucase occidental (WCBV), Shimoni bat virus (SHIBV), et Lleida bat lyssavirus (LLEBV)². Récemment, deux lyssavirus supplémentaires ont été identifiés: kotalahti bat lyssavirus (KBLV) isolé de la chauve-souris de Brandt (Myotis murin) en Finlande en 2017³ et Taiwan bat lyssavirus (twblv) isolé d’un Pipistrelle japonais ( Pipistrellus abramus) à Taiwan, Chine en 2016 – 2017⁴.

Tous les mammifères sont sensibles à la rage; Cependant, aucune lésion pathognomonique brute ou aucun signe clinique spécifique ne permet son identification, et le diagnostic ne peut être effectué que dans le laboratoire⁵. La méthode la plus couramment utilisée pour le diagnostic de la rage est la graisse, qui est considérée comme la norme de l’or par l’OMS et l’OIE^5,6. Néanmoins, le FAT peut produire des résultats peu fiables sur des échantillons de tissus cérébraux dégradés/autolysés. En outre, il ne peut pas être utilisé pour le dosage des échantillons de fluides biologiques tels que le liquide céphalo-rachidien (LCR), la salive et l’urine, ce qui exclut largement son emploi dans le diagnostic antemortem⁷. Les tests diagnostiques conventionnels alternatifs, tels que le test d’infection de la culture tissulaire de la rage (RTCIT) et le test d’inoculation de la souris (MIT), nécessitent plusieurs jours⁶, un inconvénient majeur lorsqu’un diagnostic rapide est essentiel.

Divers tests de diagnostic moléculaire (p. ex., la détection de l’ARN viral par RT-PCR, le test d’immunosorbant PCR – enzyme-linked [PCR-ELISA], l’hybridation in situ et la PCR en temps réel) sont utilisés comme techniques rapides et sensibles pour le diagnostic de la rage⁸. La RT-PCR est maintenant recommandée par l’OIE pour le diagnostic de routine de la rage, et une PCR heminested (HN) est décrite dans le manuel des tests diagnostiques et des vaccins pour les animaux terrestres de l’OIE pour détecter tous les lyssavirus⁵. Ici, nous décrivons un pan-lyssavirus imbriqué RT-PCR, qui permet la détection spécifique et sensible de l’ensemble des 18 espèces de lyssavirus comparables ou supérieures à celle obtenue par la graisse. Le principe de la méthode est un RT de l’ARN cible (région conservée du gène du lyssavirus N) dans l’ADNc, suivi de l’amplification de l’ADNc par deux cycles de PCR. L’ADNc subit la PCR de première ronde avec des amorces externes pour amplifier un fragment de BP de 845; Ensuite, la PCR de deuxième cycle utilise le premier produit d’ACP comme modèle pour amplifier un fragment de BP 371 avec des amorces internes. Les deux cycles de PCR augmentent significativement la sensibilité du dosage.

Protocole

L’utilisation de souris dans ce protocole a été approuvée par le Comité administratif sur le bien-être des animaux de l’Institut de médecine vétérinaire militaire, l’Académie des sciences médicales militaires, Chine (autorisation du Comité d’utilisation et de soins des animaux de laboratoire, permis numéro JSY-DW-2010-02). Toutes les directives institutionnelles et nationales pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire ont été suivies.

1. extraction d’ARN

1. Extraire l’ARN des tissus cérébraux soupçonnés de rage, des biopsies cutanées, de la salive ou du LCR ou de la culture cellulaire infectée par le RABV, en utilisant des méthodes d’extraction à base d’isothiocyanate-phénol-chloroforme de guanidinium ou des kits d’extraction d’ARN viral disponibles dans le commerce. Utilisez l’ARN préparé immédiatement ou stockez-le à-80 ° c jusqu’à ce que nécessaire.

2. transcription inversée de l’ARN viral

1. Retirez les réactifs RT énumérés dans le tableau 1 du congélateur, conservez-les sur la glace, puis Décongelez-les et vortex-les avant utilisation.
2. Préparer 12 μL de mélange réactionnel RT dans un tube PCR de 0,2 mL avec les réactifs énumérés dans le tableau 1. Permettre des variations de pipetage en préparant un volume de mélange principal au moins une taille de réaction supérieure à la quantité requise.
3. Ajouter 8 μL d’échantillon, d’ARN témoin positif ou de contrôle négatif au mélange de réaction RT dans une station de travail PCR dans une salle de modèle. Le contrôle positif RT est un ARN extrait de la culture cellulaire infectée par la souche fixe de RABV CVS-11 (Challenge virus standard-11) et stocké à-80 ° c. Le contrôle négatif contient la RNase-Free ddH₂O.
4. Mélanger le contenu des tubes RT par vortexing; puis, Centrifugez brièvement.
5. Chargez les tubes de réaction dans un thermocycleur. Mettre en place le programme de synthèse du cDNA avec les conditions suivantes: 42 ° c pour 90 min, 95 ° c pendant 5 min et 4 ° c en attente. Réglez le volume de réaction à 20 μL. Démarrez la course RT.

3. PCR de première ronde

1. Conserver les réactifs de PCR énumérés dans le tableau 2 sur la glace dans une salle blanche jusqu’à leur utilisation; puis les décongeler et les tourbillonner.
2. Préparer le mélange PCR de première ronde dans un tube PCR de 0,2 mL avec les réactifs énumérés dans le tableau 2.
3. Ajouter un échantillon de 2 μL d’ADNc ou de plasmide dans le mélange PCR de première ronde dans une station de travail PCR dans une pièce de gabarit. Le contrôle positif de la PCR est l’ADNc CVS-11 préparé comme mentionné à l’étape 2,3 pour la méthode RT ci-dessus. Le contrôle négatif PCR est FD₂O.
4. Transférer les tubes scellés à un thermocycleur PCR et à un cycle en utilisant les paramètres énumérés dans le tableau 3.

4. PCR de deuxième cycle

1. Préparer le mélange PCR de deuxième cycle dans un tube PCR de 0,2 mL à l’aide des réactifs énumérés dans le tableau 4.
2. Ajouter 2 μL de produit PCR de première ronde dans le mélange PCR de deuxième cycle. En outre, inclure ddH₂O comme un contrôle négatif de la PCR de deuxième cycle.
3. Effectuer le cycle thermique PCR en utilisant les mêmes paramètres que ceux donnés à l’étape 3,4.

5. analyse des produits PCR par électrophorèse sur gels d’agarose

1. Préparez un gel d’d’agarose à 1,5% en ajoutant 1,5 g d’d’agarose à 100 mL de tris-acétate-EDTA (TAE) et en le dérésolvant à fond en le chauffant dans un four à micro-ondes.
2. Ajouter le bromure d’éthidium (EB) (à une concentration finale de 0,01%) ou une autre substitution commerciale EB. Verser le gel dans le moule et le laisser solidifier à température ambiante pendant au moins 30 min.
3. Préparez les échantillons de chargement en mélangeant 5 μL de chaque produit PCR avec 1 μL de tampon de chargement 6x.
4. Chargez les échantillons et le marqueur d’ADN approprié séparément dans les puits et exécutez le gel pendant environ 30-45 min à 120 V jusqu’à ce que la ligne de colorant soit approximativement 75%-80% vers le bas du gel.
5. Éteignez l’alimentation, débranchez les électrodes de la source d’alimentation, puis, retirez délicatement le gel de la boîte de gel.
6. Utilisez un dispositif de documentation de gel UV pour visualiser et photographier les fragments d’ADN.

6. caractérisation de la RT-PCR imbriquée

1. 6,1. spécificité et sensibilité pour la détection de 18 lyssavirus plasmides
   1. Commander 18 plasmides commerciaux contenant le gène N complet de chaque lyssavirus (16 espèces d’ICTV et deux espèces nouvelles) pour la PCR.
   2. Calculez le numéro de copie du plasmide à l’aide du numéro d’Avogadro (N_a) et de la formule suivante.
      [(g/μL d’ADN plasmidique)/(longueur du plasmide en BP x 660)] x 6,022 x 10²³ = nombre de molécules/μl
   3. Préparer des solutions de stock (2,24 x 10⁹ molécules/μl) des 18 plasmides dans le ddH₂O.
   4. Effectuer des dilutions sérielles de 9 10 de tous les 18 plasmides dans le ddH₂o. Diluer 10 μl de chaque bouillon de plasmide avec 90 ΜL de FD₂o. vortex et centrifuger brièvement.
   5. Effectuer l’amplification PCR comme décrit aux sections 3-5.
   6. Analysez la spécificité et la sensibilité de la PCR imbriquée en détectant une série de plasmides de lyssavirus.
2. Détermination du d détection l imit
   1. Ajuster le titre de la souche du virus de la rage CVS-11 culture cellulaire à 10^5,5 tcid₅₀/ml (le titre du virus est déterminé selon le manuel de l’OIE)⁵.
   2. Effectuer des dilutions série 5 10 de CVS-11 (la solution de stock est 10^5,5 tcid₅₀/ml) comme décrit à l’étape 6.1.4.
   3. Effectuer l’extraction de l’ARN et les procédures d’amplification RT-PCR imbriquées de toutes les dilutions virales, comme décrit dans les sections 1-5.
3. Le compar ison de le RT-PCR imbriquée avec le "Gold standard" Fat
   1. Testez tous les échantillons cliniques par RT-PCR imbriquée, puis confirmez les résultats avec le séquençage⁹du gène Fat⁵ et N.
   2. Utilisez les données normalisées pour une analyse statistique avec SAS 9,1. Utilisez le test Kappa et le test chi-squared de McNemar pour une comparaison statistique des tests diagnostiques (commande SAS: proc FREQ; table/agree). Calculez les intervalles de confiance en supposant une distribution abinomale.
4. Évaluation de l’efficacité dans le test des échantillons dégradés
   1. Exposer deux échantillons de tissu cérébral clinique confirmés de chiens enragés à 37 ° c.
   2. Dosage des deux échantillons chaque jour d’exposition à 37 ° c par RT-PCR imbriquée, le FAT et le MIT⁵.

Résultats

Les résultats de la RT-PCR imbriquée pour détecter 18 espèces de lyssavirus sont présentés dans la figure 1. Tous les contrôles positifs de PCR ont montré les 845 BP attendus dans le premier et le 371 BP dans les amplifications de deuxième cycle sans bande dans le contrôle négatif. Tous les 18 lyssavirus ont produit les bandes de 845 et/ou de 371 BP attendues, ce qui indique que la RT-PCR imbriquée a détecté tous les 18 lyssavirus. Seize plasmides de lyssavirus avaient une amplification effi...

Discussion

Actuellement, le RABV est un lyssavirus majeur responsable de la quasi-totalité de la rage humaine et animale en Chine, ainsi que dans d’autres pays. En outre, une variante de l’IRKV a été identifiée pour la première fois à partir d’une chauve-sourisurina leucogaster de Mdans la province de Jilin, dans le nord-est de la Chine, en 2012, et il a été rapporté que la mort d’un chien dans la province du Liaoning était de 2017¹¹. Plus récemment, un nouveau lyssa...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
50 & fois ; TAE	Divers	Divers
6 & ; tampon de chargement	TakaRa	9156
Agarose	US Everbright® ; Inc	A-2015-100g
ddH2O	Divers
Marqueur DL 2 000	Takara	3427A
dNTPs (10 mM)	TakaRa	4019
dNTPs (2,5 mM)	TakaRa	4030
	Tanon	EPS300
Ex-Taq (5 U/&mu ; L)	TakaRa	RR001
Système d’imagerie en gel	UVITEC	Fire Reader Tubes
microcentifuge	Divers	Divers
M-MLV transcriptase inverse (200 UI/µ ; L)	TakaRa	2641A  ;
Spectrophotomètre NanoDrop 1000	Thermoscientifique	ND1000
Oligo (dT)15	TakaRa	3805
Machine PCR	BIO-RAD	T100
Tubes PCR	Divers
Phusion ADN haute fidélité Polyméarase	NEW ENGLAND BioLabs	M0530S
Pipettors	Divers	Divers
Amorce aléatoire	TakaRa	3801
Inhibiteur de la RNase (40 UI/µ ; L)	TakaRa	2313A
RNase ddH2O	TakaRa	9102
Taq Buffer (10× ;)	TakaRa	9152A
Embouts	Divers	Divers
Mélangeur Vortex	Divers