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Technologie CRISPR/Cas9 dans la restauration de l'expression de la dystrophine chez les progéniteurs musculaires dérivés de l'iPSC

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DOI :

10.3791/59432

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14 septembre 2019

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1Medical College of Georgia, Augusta University

Dans cet article

Résumé

Ici, nous présentons un protocole de suppression d'exon23 basé cas9 pour reconstituer l'expression de dystrophine dans l'iPSC des fibroblastes de peau souris-dérivés de Dmd et différencient directement des iPSC en cellules myogènes de progéniture (MPC) utilisant le système d'activation de Tet-on MyoD.

Résumé

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie musculaire progressive grave provoquée par des mutations dans le gène de dystrophine, qui mène finalement à l'épuisement des cellules progénitrices de muscle. L'édition génétique de 9 (CRISPR/Cas9) a le potentiel de restaurer l'expression du gène de la dystrophine. Les cellules progénitrices musculaires induites autologues (iPSC) dérivées de cellules musculaires (MPC) peuvent reconstituer la piscine de cellules souches/progénitrices, réparer les dommages et prévenir d'autres complications dans la DMD sans provoquer de réponse immunitaire. Dans cette étude, nous introduisons une combinaison de technologies CRISPR/Cas9 et iPSC non intégrées pour obtenir des progéniteurs musculaires avec l'expression récupérée de protéine de dystrophine. En bref, nous utilisons un vecteur Sendai non-intégration pour établir une ligne iPSC à partir de fibroblastes dermiques de souris Dmdmdx. Nous utilisons ensuite la stratégie de suppression CRISPR/Cas9 pour restaurer l'expression de la dystrophine par une jointure non-homologue du gène recadré de dystrophine. Après la validation de PCR de l'épuisement d'exon23 dans trois colonies de 94 colonies choisies d'iPSC, nous différencions iPSC en MPC par l'expression doxycycline (Dox)-induite de MyoD, un facteur de transcription clé jouant un rôle significatif en réglant la différenciation de muscle. Nos résultats montrent la faisabilité d'utiliser la stratégie de suppression CRISPR/Cas9 pour restaurer l'expression de la dystrophine dans le MPC dérivé de l'iPSC, qui a un potentiel important pour développer de futures thérapies pour le traitement de la DMD.

Introduction

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est l'une des dystrophies musculaires les plus communes et se caractérise par l'absence de dystrophine, affectant 1 des quelque 5 000 garçons nouveau-nés dans le monde1. La perte de la fonction de gène de dystrophine a comme conséquence des défauts structurels de muscle menant à la dégénérescence progressive de myofibers1,2. Le système de thérapie génique à médiation adéno-associée (rAAV) a été testé pour restaurer l'expression de la dystrophine et améliorer la fonction musculaire, comme le remplacement des gènes à l'aide de micro-dystrophines(Dys). Cependant, l'approche rAAV nécessite des injections répétées pour soutenir l'expression de la protéine fonctionnelle3,4. Par conséquent, nous avons besoin d'une stratégie qui peut fournir l'expression efficace et permanente de gène de dystrophine dans les patients présentant Le DMD. La souris Dmdmdx, un modèle de souris pour DMD, a une mutation de point dans l'exon 23 du gène de dystrophine qui introduit un codon prématuré de terminaison et a comme conséquence une protéine tronquée non fonctionnelle manquant du domaine de liaison de Dystroglycan C-terminal. Des études récentes ont démontré l'utilisation de la technologie CRISPR/Cas9 pour restaurer l'expression du gène de la dystrophine par correction génétique précise ou suppression d'exon mutant chez les petits et grands animaux5,6,7. Long et coll.8 ont rapporté la méthode pour corriger la mutation du gène de la dystrophine dans la lignée germinale de souris Dmdmdx par réparation dirigée par homologie (HDR) basée sur l'édition du génome CRISPR/Cas9. El Refaey et coll.9 ont rapporté que le rAAV pouvait exciser efficacement l'exon 23 mutant chez les souris dystrophiques. Dans ces études, les gRNAs ont été conçus dans les introns 20 et 23 pour causer des ruptures d'ADN à double brin, qui ont partiellement restauré l'expression de dystrophine après réparation d'ADN par l'intermédiaire de jointure de fin non-homologue (NHEJ). Encore plus excitant, Amoasii et coll.10 ont récemment signalé l'efficacité et la faisabilité de l'édition du gène CRISPR par le rAAV dans la restauration de l'expression de la dystrophine dans les modèles canins, une étape essentielle dans l'application clinique future.

DMD provoque également des troubles des cellules souches11. Pour les dommages musculaires, les cellules souches musculaires résidentielles réapprovisionnent les cellules musculaires mourantes après la différenciation musculaire. Cependant, les cycles consécutifs de blessures et de réparation conduisent à un raccourcissement des télomères dans les cellules souches musculaires12, et l'épuisement prématuré des piscines de cellules souches13,14. Par conséquent, une combinaison de thérapie autologue de cellules souches avec l'édition de génome pour reconstituer l'expression de dystrophine peut être une approche pratique pour traiter DMD. La technologie CRISPR/Cas9 offre la possibilité de générer des cellules souches pluripotentes induites induites génétiquement corrigées autologues (iPSC) pour la régénération fonctionnelle des muscles et prévenir d'autres complications de la DMD sans provoquer de rejet immunitaire. Cependant, les iPSC ont un risque de formation de tumeur, qui pourrait être allégé par la différenciation de l'iPSC en cellules progénitrices myogéniques.

Dans ce protocole, nous décrivons l'utilisation du virus Sendai non-intégration pour reprogrammer les fibroblastes dermiques des souris dmdmdx en iPSCs et récupérons ensuite l'expression de dystrophine par suppression de génome de CRISPR/Cas9. Après validation de la suppression d'Exon23 dans l'iPSC par génotypage, nous avons différencié l'iPSC genome-corrected en progéniteurs myogéniques (MPC) par la différenciation myogène MyoD-induite.

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Protocole

Toutes les interventions chirurgicales et de manipulation des animaux ont été effectuées par un protocole approuvé par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux de l'Université d'Augusta (IACUC). Les souris ont été alimentées régime standard et l'eau ad libitum.

1. Isolement des fibroblastes primaires de souris des souris adultes de Dmdmdx

  1. Euthanasier les souris adultes Dmdmdx (mâle, 2 mois) par asphyxie co2 et thoracotomie selon l'IACUC approuvé par Medical College of Georgia, Université d'Augusta. Couper la queue avec un scalpel stérile dans un état stérile sous le capot laminaire. Rincer la queue avec 70 % d'éthanol pendant 5 min, puis laver à l'œil de salin stérilisé tamponné par le phosphate (PBS) dans un plat de 6 cm.
  2. Peler la peau de la queue par une incision pointue de la base à l'extrémité de la queue le long de la peau de la queue, puis décoller délicatement la peau de la queue avec une pince à épiler. Émincer la peau à une taille de 1 mm3 à l'aide d'un scalpel stérile et déplacer le tissu cutané haché à un plat de 6 cm dans le milieu essentiel minimal de Dulbecco / F12 Ham (DMEM/ F12) contenant 0,1% de collagène IV et 1 U/mL de dispase.
  3. Diger le tissu cutané dans un plat de culture pendant 2 h à 37 oC dans un incubateur de CO2 à 5 %.
  4. Enrober une plaque de 6 puits de fibronectin et de 0,2 % de gélatine (1 ml de fibronectin dans 199 mL de gélatine de 0,2 %; Tableau des matériaux) et incuber à 37 oC pendant 1 h.
  5. Dissocier le tissu cutané digéré avec une pointe de tuyauterie de 1 ml et transférer le tissu et le supernatant dans un tube conique stérile de centrifugeuse de 15 ml. Centrifugeuse à 217 x g pendant 3 min à température ambiante, jetez le supernatant et suspendez la pastille dans 1,5 ml de fibroblaste moyen(Tableau des matériaux).
  6. Culture les granulés, y compris les tissus de la peau digérés incomplets à partir de l'étape 1.5 sur la plaque de 6 puits enduit de fibronectine et 0,2% de gélatine à partir de l'étape 1.4 dans un 37 oC, 5% CO2 incubateur. Remplacer le milieu 24 h après le placage initial pour enlever les cellules non attachées, et changer le milieu tous les 48 h.

2. Reprogrammer les fibroblastes de peau de souris en iPSCs

  1. Deux jours avant la transduction, digérez les fibroblastes dermiques de souris à partir de l'étape 1.6 avec la solution de détachement cellulaire(tableau des matériaux)dans un incubateur de 37 oC avec une atmosphère humidifiée de 5 % de CO2 pendant 5 min.
  2. Compter les cellules à l'aide d'un hemacytomètre et d'une centrifugeuse à 217 x g pendant 3 min.
  3. Cellules de graines à une densité de 1 à 2 x 105 cellules par puits sur une plaque de 6 puits et la culture avec le milieu de fibroblaste (Tableau des matériaux) dans un incubateur de 37 oC avec une atmosphère humidifiée de 5% CO2.
  4. Le jour de la transduction (jour 0), estimez les cellules et calculez le volume de chaque virus nécessaire pour atteindre la multiplicité cible de l'infection (MOI) de 5, 5 et 3 (c.-à-d., KOS MOI 5, hc-Myc MOI 5, hKlf4 MOI 3) selon le manuel commercial.

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  1. Décongeler trois tubes sendai dans un bain d'eau de 37 oC pour 5 à 10 s et ajouter les volumes calculés de chacun des trois tubes sendai à 1 ml de fibroblaste moyen(Tableau des matériaux).
  2. Retirez le milieu fibroblaste de l'étape 2.3 et ajoutez le mélange de virus de reprogrammation aux puits contenant les cellules. Incuber les cellules toute la nuit dans un incubateur de 37 oC avec une atmosphère humidifiée de 5 % de CO2.
  3. Remplacer le milieu par un fibroblaste frais moyen 24 h après la transduction. Culture des cellules pendant une semaine avec échange moyen tous les deux jours.
  4. Récoltez les fibroblastes infectés par la souris le jour 7 après la transduction avec 0,05 % de trypsine/EDTA et placez-les sur des plats qui sont auparavant recouverts de fibronectin et de gélatine de 0,2 %.
  5. Culture les fibroblastes infectés de souris à partir de l'étape 2.6 avec le milieu de croissance embryonnaire complet de cellules souches de souris (ES) (tableau des matériaux) dans un incubateur de 37 oC avec une atmosphère humidifiée de 5% CO2 et changer moyen par jour.
  6. À partir du 8ème jour, observez la plaque sous un microscope inversé tous les deux jours pour identifier l'apparition des amas cellulaires avec la morphologie de la souris ES.

3. Utilisation de la cytométrie de la tache et du débit vivant de phosphatase alcalin pour quantifier l'efficacité de la reprogrammation

  1. Retirez les supports de culture de chaque puits et rincez-le avec le DMEM/F-12 pendant 2 à 3 min.
  2. Appliquer 2 ml de 1x sauce alcaline phosphatase (AP) solution de travail des taches vivantes (1:500 dilution dans DMEM/F-12) sur les cellules adhérentes, et couver dans un incubateur de 37 oC avec une atmosphère humidifiée de 5% CO2 pendant 30 min.
  3. Aspirez la tache ap en direct et lavez-les deux fois avec du PBS pendant 5 min chacun.
  4. Diger les cellules avec la solution de détachement cellulaire (Table des matériaux) dans un incubateur de 37 oC avec une atmosphère humidifiée de 5 % de CO2 pendant 5 min. Effectuer la cytométrie du débit pour déterminer l'efficacité de la reprogrammation.

4. Sélection et récolte de cellules de la même sien

  1. Examiner les colonies à partir de l'étape 2.8 sous un microscope inversé.
  2. Marquez les colonies au fond du plat avec un marqueur d'objet auto-inking.
  3. Appliquer les anneaux de clonage graissés pour couvrir les colonies cellulaires marquées. Ajouter 100 oL de 0,05 % de trypsine/EDTA à chaque anneau de clonage à 37 oC pendant 5 min, puis transférer les cellules digérées avec des pointes de pipette de 100 l sur des plaques de culture de 48 puits contenant un milieu de croissance mES.
  4. Incuber les cellules dans des plaques de culture de 48 puits dans un incubateur de 37 oC avec une atmosphère humidifiée de 5 % de CO2. Passer les cellules à 6 cm plat quand ils atteignent 70% confluence.
  5. Répétez les étapes 4.3 et 4.4 plusieurs fois jusqu'à ce que des clones uniformes en forme de dortoir soient obtenus.

5. Congélation des iPSC pour la cryoconservation

  1. Dissocier les iPSC sélectionnés de l'étape 4.5 avec la trypsine, le verset, et le plasma de poussin (TVP ; Tableau des matériaux) solution à 37 oC dans un incubateur de CO2 de 5 % pendant 30 min.
  2. Recueillir les cellules dans un tube conique stérile de 15 ml et une centrifugeuse à 217 x g pendant 3 min à température ambiante.
  3. Aspirer le supernatant et re-suspendre le granule de cellules dans 2 ml de souris ES milieu congelé (Tableau des matériaux) pour obtenir 1 ml par cryovial.
  4. Ajouter les cellules aux cryovials et congeler à l'aide d'un contenant de congélation qui fournit le taux critique et répété de refroidissement de -1 oC/min requis pour la cryoconservation à -80 oC pendant la nuit.
  5. Transférer les flacons congelés dans un réservoir d'azote liquide.

6. Coloration immunofluorescence pour les marqueurs de cellules souches dans les iPSC

  1. Les iPSC de semence s'agitent de l'étape 5.1 cultivées avec le milieu mES dans un toboggan de chambre de 8 puits recouvert de poly-D-lysine/laminine (Tableau des matériaux) à la densité appropriée pour atteindre entre 1-2 x 104 cellules par puits et couver dans un incubateur de 37 oC avec un atmosphère humidifiée de 5 % de CO2 pendant 48 h.
  2. Immerger les lames dans 4 % de formaldéhyde pendant 15 min à température ambiante, puis les glisser deux fois en PBS pendant 5 min à chaque fois.
  3. Incuber les sections avec un réactif de blocage IgG souris (Table des matériaux), et 5% sérum de chèvre pendant 1 h à température ambiante.
  4. Diluer les anticorps primaires dans le diluant protéique (souris-anti-SSEA1, 1:100, lapin-anti-Nanog, 1:500; lapin-anti-POU classe 5 homeobox 1 [OCT4], 1:500; lapin-anti-SRY-box 2 [SOX2], 1:500; lapin-anti-Lin-28 homolog A [Lin28A], 1:400) (Tableau de Matériaux). Appliquer les anticorps sur les cellules et incuber à 4 oC pendant la nuit dans une chambre humidifiée.
  5. Jetez la solution d'anticorps primaire et lavez les diapositives 3x dans PBS.
  6. Appliquer des deuxièmes anticorps (anticorps anti-souris de chèvre alexa488 et anti-lapin conjugué alexa555, 1:400 chacun) dans le diluant protéique M.O.M. sur les toboggans et incubependant 45 min à température ambiante.
  7. Laver les diapositives 3x en PBS et monter les sections avec le support de montage contenant 4'6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).
  8. Prenez des photos avec un microscope confocal.

7. Enquêter sur la pluripotence des iPSC in vivo

  1. Dissocier les iPSC de l'étape 5.1 en cellules simples à l'aide d'une solution TVP dans un incubateur de 37 oC avec une atmosphère humidifiée de 5 % de CO2 pendant 30 min.
  2. Compter les cellules à l'aide d'un hemacytomètre et d'une centrifugeuse à 217 x g pendant 3 min.
  3. Aspirer le supernatant et resuspendre la pastille avec le milieu de mES dans un tube de centrifugeuse stérile de 1,5 ml à une concentration de 5 x 105 cellules/30 l pour la transplantation cellulaire.
  4. Enlever les cheveux des deux membres postérieurs des souris immunodéficientes à l'aide de tondeuses à cheveux.
  5. Anesthésiez les souris à la kétamine (100 mg/kg) et nettoyez le site d'injection avec 75 % d'alcool.
  6. Injecter 30 L de suspension iPSC de l'étape 7.3 intramusculairement dans le gastrocnemii, à l'aide d'une aiguille de 31 G.
  7. Deux semaines après l'injection, récolter la souris gastrocnemii et intégrer dans la température de coupe optimale (OCT) composé, congeler et couper en sections de 5 m15,16.
  8. Fixer les sections dans 4 % de formaldéhyde pendant 15 min à température ambiante, puis laver les lames deux fois en PBS pendant 5 min à chaque fois.
  9. Bloquer les cellules avec 5% de diluant de protéines de sérum de chèvre pendant 1 h à température ambiante.
  10. Ajouter l'anticorps primaire dilué (lapin anti-AFP, 1:50; lapin anti-SMA, 1:50; lapin anti-TH, 1:50) aux toboggans et incuber à 4 oC pendant la nuit dans une chambre humidifiée.
  11. Jetez la solution d'anticorps primaire, lavez les cellules 3x (5 min/lavage) en PBS, ajoutez un anticorps de chèvre-anti-lapin dilué de 1:400 Alexa555 aux glissières, et incubez pendant 45 min à température ambiante.
  12. Laver les glissières 3x (5 min/lavage) en PBS, et monter les sections avec le support de montage contenant DAPI.

8. Construction d'un vecteur lentiviral CRISPR/Cas9 ciblant les introns flanquant la dystrophine exon 23

  1. Concevoir deux paires d'oligos gRNA ciblant la dystrophine intron-flanked exon 23 par http://crispor.tefor.net/crispor.py.
    REMARQUE : Les paires conçues sont les suivantes :
    i22sense: 5'-CACCGTTAAGCTTAGGTAAAATCAA- 3'
    i22anti-sens: 5'-AAACTTGATTTTACCTAAGCTTAAC-3'
    i23sense: 5'-CACCGAGTAATGTGTCATACCTTTTT- 3'
    i23anti-sens: 5'-AAACAGAAGGTATCACATTACTC-3').
  2. Digest et déphosphorylate 5 g de plasmide CRISPR lentiviral (lenti-CRISPRv2-blast [un cadeau de Mohan Babu] et lenti-Guide-Hygro-iRFP670 [un cadeau de Kristen Brennand]) (Table of Materials) avec BsmB1/Esp3I pour 30 min à 37 oC. Pour 5 g de plasmides, ajouter 3 l de BsmB1 à limiter l'enzyme, 3 l de phosphatase alcaline rapide, 6 l de tampon de digestion enzymatique 10x et 0,6 L de 100 mL de DTT en 60 degrés de réaction).
  3. Chargez les réactions sur un gel agarose de 0,8%. Exécuter le gel à 100'150 V pendant 30 min.
  4. Purifez le plasmide digéré en gel à l'aide d'un kit d'extraction de gel (Table of Materials) et elute en 20 oL de H2O.
  5. Phosphorylate et anneal chaque paire d'oligonucléotides gRNA contenant 1 L de chaque oligonucléotide à 100 M, 1 l de tampon de ligature T4 de 10x, 0,5 oL de t4 polynucléotide kinase (PNK), 6,5 l de ddH2O à 37 oC pendant 30 min, puis 95 oC pendant 5 min, puis rampe d à 25 oC à 5 oC/min.
  6. Ligate une dilution 1:200 des oligonucléotides de gRNA annealed dans le plentiCRISPR V2-Blast ou plentiGuide-Hygro-iRFP670. Mélanger 50 ng de vecteurs digérés BsmB1/Esp3I avec 1 l de duplex oligo dilué et 5 l de tampon de 2x ligase plus 1 an de ligase dans un système de réaction de 11 L et incuber pendant 10 min à température ambiante.
  7. Effectuer la transformation avec 3 L de produit de ligature en 50 cellules compétentes L (Tableau des matériaux) selon les instructions du fabricant.
  8. Étendre les cellules compétentes transformées dans une plaque d'agar avec 100 'g/mL de carbenicilline et incuber à 31,5 oC pendant 18 h.
  9. Choisissez des colonies avec des pointes et une culture de pipette stériles de 10 ll dans 5 ml de bouillon formidable (Table of Materials) contenant 100 og/mL de carbenicilline à 31,5 oC, 185 tr/min dans un incubateur shaker pendant 21 h.
  10. Purifier l'ADN plasmide à l'aide des kits de mini-préparation et midi-préparation (Table des Matériaux).
  11. Vérifier les plasmides mini-préparation par la digestion de restriction. Pour le système de réaction de 20 L, ajouter 1 g d'ADN plasmide, 2 l de tampon de réaction digeste (Tableau des matériaux) et 1 L de mélange d'enzymes de restriction (0,5 L de KpnI-HF et 0,5 L d'AgeI-HF pour plentiCRISPR V2-Blast-i22; 0,5 l de NotI-HF et 0,5 l d'EcoRI-HF pour le plentiCRISP-HF pour l'EcoRI-HF pour le plentiCRISP-HF pour le plentiCRISP-HF pour l'EcoRI-HF pour le plentiCRISP-HF pour le plentiCRISP-HF plentiGuide-Hygro- iRFP670- i23). Incuber le système de réaction pendant 1 h à 37 oC.
  12. Chargez les réactions sur un gel agarose de 0,8%. Exécuter le gel à 100'150 V pendant 30 min.
    REMARQUE: Les bandes correctes pour plentiCRISPR V2-Blast-i22 devrait être 622 bp et 12,2 kb, et les bandes correctes pour plentiGuide-Hygro-iRFP670- i23 devrait être 2,6 kb et 7,1 kb.

9. Emballage vectoriel lentiviral

  1. Culture 7 x 105 293FT cellules dans 5 ml de médias DMEM contenant 10% de sérum bovin fœtal dans un plat de 6 cm pendant la nuit à 37 oC, 5% CO2.
  2. Préparer un cocktail (1 g de plentiCRISPR V2-Blast-i22 ou plentiGuide-Hygro-iRFP670-i23, 750 ng de plasmide d'emballage psPAX2, 250 ng de plasmide enveloppe pMD2.G, et 5 l de réagent de transfection A [Table of Materials] en 100 'L de sérum réduit MEM media).
  3. Préparer un mélange de 5 l de réactif de transfection B (Tableau des matériaux) dans 100 'L de sérum réduit MEM media.
  4. Ajouter 100 ll de mélange de réactif B de transfection au mélange de plasmide à partir de l'étape 9.2 et incuber pendant 5 min à température ambiante.
  5. Ajoutez le complexe ADN-lipidique (à partir de l'étape 9.4) goutte à goutte aux cellules 293FT. Incuber toute la nuit à 37 oC avec 5 % de CO2.
  6. Ajouter l'améliorateur de production de virus (500x) (Tableau des matériaux) à chaque plat le lendemain et incuber pendant 24 h à 37 oC, 5 % CO2.
  7. Recueillir le milieu des cellules à l'aide de pipettes sur les deux prochains jours et filtrer le milieu à travers un filtre de 0,45 m pour enlever les cellules.

10. Concentration et purification des vecteurs lentiviraux

  1. Précipitez le vecteur lentiviral au milieu de l'étape 9,7 pendant la nuit à 4 oC avec 5 x polyéthylène glycol 4000 (PEG4000, concentration finale de 8,5 %) et 4 M NaCl (concentration finale de 0,4 M).
  2. Centrifuger le média viral contenant la solution PEG4000 à 2 095 x g et 4 oC pendant 30 min, retirez et jetez le supernatant.
  3. Resuspendre les granulés avec 500 ll de sérum réduit meM media (lentivirus titer: lenti-CRISPR V2-gRNAi22: 1.56 x 108, lenti-iRFP670-gRNAi23: 1.3 x 108, lenti-CRISPR V2-contrôle: 3.13 x 107, lenti-iRFP670-control: 5.9 x 107 ). Conserver à -80 oC jusqu'à utilisation.

11. Suppression de l'exon 23 dans les iPSC souris avec deux ARN guides (gRNAs) couplés avec Cas9

  1. Plaquer les iPSC de souris à partir de l'étape 4.5 dans une plaque de 24 puits recouverte de fibronectine et de gélatine.
  2. Une fois que les cellules atteignent 50 % de confluence, passez au milieu de culture frais (milieu de croissance embryonnaire complète des cellules souches de souris) contenant 8 polybrenes g/mL).
  3. Ajoutez 100 L de la solution de particules lentivirales de l'étape 10.3 incluant lenti-CRISPR V2-gRNAi22, lenti-iRFP670-gRNAi23 et contrôle (vecteur vide : lenti-CRISPR V2, lenti-iRFP670) aux iPSC de souris. Incuber les cellules pendant 3 jours à 37 oC avec 5 % de CO2.
  4. Sélectionnez les cellules infectées de façon stable avec des supports contenant 2,5 g/mL de blasticidin et 100 'g/mL d'hygromycine B en déterminant la concentration minimale de blasticidin et d'hygromycine B nécessaire pour tuer la cellule non infectée.
    REMARQUE : Les cellules non infectées seraient tuées par la blasticicine et l'hygromycine B.
  5. Diger les iPSC de souris sélectionnées avec 0,5 ml de solution TVP chaque puits (24-bien plaque) et incuber les cellules pendant 30 min à 37 oC avec 5% CO2.
  6. Dissocier les iPSC en cellules simples par pipetting, compter les cellules avec une chambre de comptage cellulaire, puis diluer environ 150 cellules simples digérées avec mES milieu en 10 cm plat pour la culture à 37 oC avec 5% CO2.
  7. Après environ 10 jours, choisissez des colonies individuelles au microscope inversé à l'aide de 10 pointes de pipette stériles ll (96 colonies doivent être cueillies).
  8. Transférer les colonies cueillies dans 50 oL de solution TVP chaque puits (96 puits, une colonie chacun puits), digérer à 37 oC pendant 30 min, puis ensemencer les cellules digérées en deux plaques de culture de 96 puits pour conserver la culture (une pour le génotypage).
  9. Incuber dans un incubateur de CO2 à 37 oC jusqu'à 70 % de confluents.

12. Identification des colonies iPSC avec suppression exon23

  1. Retirez le milieu dans une plaque de 96 puits lorsque les colonies cellulaires atteignent 70 % de confluence.
  2. Ajouter 25 l de réactif de lyse(Tableau des matériaux)contenant la solution Protéase K (1 ml de protéase K dans 100 ml de réactif de lyse) à chaque puits, et transférer le lysate dans une plaque PCR de 96 puits.
  3. Sceller la plaque PCR et incuber les plaques à 55 oC pendant 30 min, puis à 95 oC pendant 45 min pour lyser les cellules et dénaturer la protéinase K.
  4. Effectuer la réaction PCR avec 2 ll de lysate à partir de l'étape 12.3. Pour la réaction PCR de 20 L, ajouter 2 l de lysate, 10 l de 2x adhérence de polymérase d'ADN (Tableau des matériaux), 7 l d'eau sans DNase, et 1 l d'amorces d'exon 23 DMD (tableau 1).
  5. Utilisez les paramètres suivants pour la réaction de PCR : 98 oC pour 1 min, 35 cycles de 98 oC pour 10 s, 60 oC pour 15 s, 72 oC pour 30 s, et une extension finale à 72 oC pour 1 min.
  6. Chargez la réaction PCR sur un gel agarose de 2%. Exécuter le gel à 100'150 V pendant 30 min.
  7. Inspectez le gel sous la lumière UV (l'efficacité knock-out est 3/94).

13. Utilisation du système d'activation Tet-on MyoD pour différencier directement l'iPSC en cellules progénitrices myogéniques (MPC)

  1. Emballez le LV-TRE-VP64-mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2 et LV-TRE-VP16 souris MyoD-T2A-dsRedExpress2 (un cadeau de Charles Gersbach) (Table of Materials) tel que décrit précédemment pour lenti-CRISPRv2-blast et lenti-gRNA-iRFP670 vecteurs dans les sections 9 et 10.
  2. Infecter la souris iPSC avec lentivirus-TRE-VP64-MyoD-T2A-dsRed-Express2 ou lentivirus-TRE-VP16-MyoD-T2A-dsRedExpress2 tel que décrit précédemment pour lenti-CRISPRv2-blast et lenti-gRNA-iRFP670 vectors in steps 11.1-11.3.
  3. Sélectionnez les cellules dont la puromycine est de 1 g/mL après trois jours d'infection afin d'obtenir une population cellulaire transductrice pure.
  4. Ajoutez 3 doxycyclinedes de 3 g/mL dans les médias culturels (10 % de DMEM FBS) à la différenciation MPC. Remplacer le milieu frais complété par de la doxycycline tous les deux jours.

14. Transcription inversée quantitative PCR pour évaluer la différenciation musculaire dynamique et l'expression d'exon DMD 22-24

  1. Extraire l'ARN cellulaire après 0, 3, 6, et 10 jours après traitement de doxycycline utilisant le réactif d'isolement d'ARN, transcrivent inversement l'ARN dans le cDNA en utilisant le premier kit de synthèse de cDNA de brin (tableau des matériaux).
  2. Pour le système de réaction qPCR de 20 L, ajouter 1 l d'ADNc, 10 l de tampon de réaction PCR (Tableau des matériaux), 8 L d'ADN H2O, et 1 L de mélange d'amorces avant et inverses (glyceraldéhyde-3-phosphate dehydrogenase [GAPDH], muscle squelettique [ACTA1], OCT4 et DMD exon22, DMD exon23, et DMD exon24, voir tableau 1).
  3. Utiliser les paramètres suivants pour la réaction pcR : 50 oC pour 2 min, 95 oC pour 2 min, 40 cycles de 95 oC pour 15 s, 60 oC pour 1 min, courbe de fonte de 65,0 à 95,0 oC, incrément de 0,5 oC.

15. Coloration immunofluorescence de la chaîne lourde de myosine 2 (MYH2) et de l'expression de protéine de dystrophine

  1. Cellules modifiées induites par la doxycycline de plaque, lenti-TRE-MyoD de l'étape 13.4 sur les diapositives de culture de 8 puits.
  2. Fixer les cellules dans 4% de formaldéhyde pendant 15 min à température ambiante, puis laver les diapositives deux fois en PBS pendant 5 min à chaque fois.
  3. Bloquer les cellules avec 5% de diluant de protéines de sérum de chèvre pendant 1 h à température ambiante.
  4. Ajouter l'anticorps lapin-anti-dystrophine (1:300) et l'anticorps souris-anti-MYH2 (1:100) aux diapositives, incuber à 4 oC pendant la nuit dans une chambre humidifiée.
  5. Jetez la solution d'anticorps primaire, lavez les cellules 3x (5 min/lavage) en PBS, ajoutez 1:400 diluant Sataïd Alexa488-anticorps anti-lapin conjugués et anticorps anti-souris de chèvre Alexa555-conjugués aux glissières, et incubez pendant 45 min à température ambiante.
  6. Laver les diapositives 3x (5 min/lavage) en PBS, et monter les sections avec le support de montage contenant DAPI.

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Résultats

Établissement des fibroblastes de peau de Dmdmdx dérivés d'iPSC. Nous avons démontré l'efficacité de générer des iPSC de souris à partir de souris Dmdmdx dérivées fibroblaste de peau en utilisant les vecteurs de reprogrammation sans intégration. La figure 1A a démontré que l'apparition de cellules souches embryonnaires (ESC) semblables à des colonies à trois semaines après l'infection. Nous évaluons l'efficacité de l'induction d'iPSC par la ta...

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Discussion

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie héréditaire destructrice et finalement mortelle caractérisée par un manque de dystrophine, menant à l'atrophie progressive de muscle1,2. Nos résultats démontrent l'expression rétablie de gène de dystrophin dans les cellules myogenic de progéniture d'iPSC d'iPSC par l'approche de la suppression CRISPR/Cas9-négociée d'exon23. Cette approche présente trois avantages.

To...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

Tang et Weintraub ont été partiellement soutenus par NIH-AR070029, NIH-HL086555, NIH-HL134354.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
chirurgicaux
Aiguille de calibre 31Divers  ;
Incision pointuedivers  ;
Scalpels stérilesdivers  ;
Pince à épilerdivers  ;
Milieu fibroblastique (pour 100 mL de milieu complet)Numéro de cataloguede l’entrepriseVolume
2-Mercaptoéthanol (55 mM)Gibco21-985-0230,1 mL
Slution antibiotique 100xCORNINGMT30004CI1 mL
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - haute teneur en glucoseSIGMAD642987 mL
Fœtal Sérum bovin caractériséHyCloneSH30396.0310 mL
solution de L-glutamineSIGMAG75131 mL
de solution d’acides aminés non essentiels MEM (100x)  ;Gibco111400761 mL
de solution de PVT (pour 500 mL de solution complète)Numéro decataloguede l’entreprise
Volume Sérum de pouletGibco16110-0825 mL
EDTASigma-AldrichE6758186 mg
Solution salineà 500 mL
Trypsine (2,5 %)Thermo150900465 mL
Milieu de croissance mES (pour 500 mL de solution complète)Numéro de cataloguedel’entreprise
2-Mercaptoéthanol (55 mM)Gibco21-985-0230,5 mL
Sérum antimycosique antibiotique 100xCORNINGMT30004CI5 mL
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucoseSIGMAD6429408,5 mL
Sérum fœtal bovin CaractériséHyCloneSH30396.0375 mL
L L-Glutaminesolution SIGMAG75135 mL
Facteur inhibiteur de la leucémie recombinante de souris (LIF), 0,5 x 106 U/mLEMD Millipore CorpCS210511500 &mu ; Supplément
inhibiteur L MEK/GS3EMD Millipore CorpCS210510-500UL500 &mu ;
L MEM Solution d’acides aminés non essentiels (100x)  ;Gibco111400765 mL
Le milieu cellulaire ES ne doit pas être stocké pendant plus de 4 semaines et avec des inhibiteurs pas plus de 2 semaines.
mES (pour 50 mL de solution complète)CompanyNuméro de catalogueVolume
Dimethyl sulfoxide (DMSO)SIGMAD26505 mL
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucoseSIGMAD642924.9 mL
Sérum fœtal bovin caractériséHyCloneSH30396.0325 mL
Facteur inhibiteur de la leucémie recombinante de souris (LIF), 0,5 x 106 U/mLEMD Millipore CorpCS21051150 &mu ; L
Nom du matériau/de l’équipementEntrepriseNuméro de catalogueRRID
0,05 % Trypsine/0,53 mM EDTACORNING25-052-CI
4 % ParaformaldéhydeThermo scientificJ19943-k2
Solution d’accutaseSIGMAA6964Solution de détachement cellulaire
AgeI-HFNEBR3552L
Anticorps anti-souris conjugué à Alexa488InvitrogenA32723AB_2633275
Anticorps anti-lapin conjugué à Alexa488InvitrogenA32731AB_2633280
Anticorps anti-lapin conjugué à Alexa555InvitrogenA32732AB_2633281
anti-AFPThermo scientificRB-365-A1AB_59574
anti-&alpha ;-Lisse Actine musculaire (D4K9N) XPCST19245SAB_2734735
anti-DystrophineThermoPA5-32388AB_2549858
anti-LIN28A (D1A1A) XP  ;   ;   ;CST8641SAB_10997528
anti-MYH2DSHBmAb2F7AB_1157865
anti-Nanog-XPCST8822SAB_11217637
anti-Oct-4A (D6C8T)CST83932SAB_2721046
anti-Sox2abcamAB97959AB_2341193
anti-SSEA1(MC480)  ;CST4744sAB_1264258
anti-TH (H-196)SANTA CRUZ  ;sc-14007AB_671397
Phosphatase alcaline Coloration vivante (500x)ThermoA14353
Blasticidine SSigma-Aldrich203350
BsmBI/Esp3INEBR0580L/R0734L
CarbenicillineMillipore205805-250MG
Collagénase IV  ;Worthington Biochemical CorporationLS004189
Cellules compétentesTakaRa636763
CutSmart  ;NEBB7204S
CytoTune-iPS 2.0 Sendai Kit de reprogrammationThermoA16517
Réactif de lyse DirectPCR (cellule)VIAGEN BIOTECH302-C
Dispase (1 U/mL)STEMCELL Technologies7923
Chlorhydrate de doxycyclineFisher BioReagentsBP26535
EcoRI-HFNEBR3101L
Fibronectine plasma bovinSIGMAF1141
  ;
QIAEX II Kit d’extraction de gel (500)		QIAGEN20051
Gélatine de peau porcine, type ASIGMAG1890
HardSet Antifade Mounting Medium avec DAPIVectorH-1500
Hygromycine B (50 mg/mL)Invitrogen10687010
Kétamine HCL InjectionHENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH45822
KpnI-HFNEBR3142L
lenti-CRISPRv2-blastAddgene83480
lenti-Guide-Hygro-iRFP670Addgene99377
Lipofectamin 3000 Kit de transfectionInvitrogenL3000015
souris LV-TRE-VP64 MyoD-T2A-dsRedExpress2  ;   ;Addgene60625
LV-TRE-VP16 souris MyoD-T2A-dsRedExpress2Addgene60626
souris sur souris (M.O.M.) Kit de baseVectorBMK-2202
NotI-HFNEBR3189L
Opti-MEM I Média sérique réduitThermoFisher31985070
Polyéthylène glycol 4 000Alfa AesarAAA161510B
PolybreneSIGMATR1003
Corning  ; BioCoat Poly-D-Lysine/Laminin Lamede culture CORNINGCB354688
PowerUp SYBR Green Master MixThermoFisherA25742
PrimeSTAR Max PremixTakaRaR045
Proteinase KVIAGEN BIOTECH507-PKP
Puromycine DihydrochlorideMP BiomedicalsICN19453980
qPCR Lentivirus Kit de titrageabmLV900
Kit de ligature rapideNEBM2200S
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)QIAGEN27106
QIAGEN Plasmid Plus Midi Kit (100)QIAGEN12945
RevertAid RT Reverse Transcription KitThermo scientificK1691
RNAzol RTCentre de recherche moléculaire, INCRN 190
T4 Tampon de réaction de ligase d’ADNNEBB0202S
T4 Polynucléotide kinaseNEBM0201S
Bouillon formidable ModifiéFisher BioReagentsBP9729-600
Réactif ViralBoost (500x)ALSTEMVB100
Instruments tamponnée au phosphat Volume

Références

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  2. Batchelor, C. L., Winder, S. J. Sparks, signals and shock absorbers: how dystrophin loss causes muscular dystrophy. Trends Cell Biology. 16 (4), 198-205 (2006).
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  8. Long, C., et al. Prevention of muscular dystrophy in mice by CRISPR/Cas9-mediated editing of germline DNA. Science. 345 (6201), 1184-1188 (2014).
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Mots-clés

dition g nomique CRISPR Cas9Restauration de l expression de la dystrophineDystrophie musculaire de DuchenneJonction d extr mit s non homologuesD l tion de l exon 23Diff renciation induite par MyoDReprogrammation par vecteur SendaiValidation par PCRlectrophor se sur gel d agarose

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