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Article de méthode

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

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⸱

DOI :

10.3791/59437

⸱

21 mai 2019

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Queen's University

Dans cet article

Résumé

Cet article décrit deux méthodes pour quantifier des réponses de défense dans Arabidopsis thaliana suivant l'exposition aux eliciteurs immunisés : l'éclatement oxydant transitoire, et l'inhibition de la croissance de plant.

Résumé

Les plantes ont développé un système immunitaire robuste pour percevoir les agents pathogènes et se protéger contre les maladies. Cet article décrit deux essais qui peuvent être employés pour mesurer la force de l'activation immunisée dans Arabidopsis thaliana suivant le traitement avec des molécules d'éveil. Présenté en premier est une méthode pour capturer l'éclatement oxydatif rapidement induit et dynamique, qui peut être surveillé à l'aide d'un analyse à base de luminol. La deuxième est une méthode décrivant comment mesurer l'inhibition induite par le système immunitaire de la croissance des semis. Ces protocoles sont rapides et fiables, ne nécessitent pas de formation ou d'équipement spécialisé, et sont largement utilisés pour comprendre la base génétique de l'immunité végétale.

Introduction

Pour percevoir et se défendre contre les agents pathogènes, les plantes ont évolué récepteurs de reconnaissance des modèles liés à la membrane (PRR) qui détectent les molécules microbiennes conservées en dehors de la cellule connue sous le nom de modèles moléculaires microbe-associés (MAMPs)1. La liaison des MMP à leurs PrR cognate initie la signalisation immunitaire médiée par la kinase protéique, ce qui entraîne une résistance aux maladies à large spectre2. L'une des premières réponses après l'activation de PRR est la phosphorylation et l'activation des protéines hydropètes DE membrane plasmatique intégrale RESPIRATORY BURST OXIDASE HOMOLOG (RBOH) qui catalysent la production d'espèces d'oxygène réactif extracellulaires (ROS)3 , 4. ROS jouent un rôle important dans l'établissement de la résistance aux maladies, agissant à la fois comme messagers secondaires pour propager la signalisation immunitaire ainsi que les agents antimicrobiens directs5. La première observation d'une rafale oxydative immunisée a été décrite utilisant des tubercules depomme de terre de cv. Rishiri suivant l'inoculation d'infestans de Phytophthora 6. La production de ROS a été évaluéedans plusieurs espèces végétales utilisant des disques de feuille 7, cultures de suspension cellulaire8,et protoplastes6. Décrit ici est une méthode simple pour assainer la production de ROS déclenchée par des motifs dans les disques de feuilles d'Arabidopsis thaliana (Arabidopsis).

En réponse à la perception de MAMP, les protéines RBOH activées catalysent la production de radicaux de superoxyde (O2-), les radicaux hydroxyles (OH), et l'oxygène de singlet (1O2) qui sont convertis en peroxyde d'hydrogène (H2O 2) dans l'espace extracellulaire9. H2O2 peut être quantifié par chemiluminescence à base de luminol en présence de l'agent oxydant raifort peroxidase (HRP)10. HRP oxyde H2O2 générant un ion hydroxyde (OH)et un gaz d'oxygène (O2) qui réagissent avec le luminol pour produire un intermédiaire instable qui libère un photon de lumière10. L'émission de photons peut être quantifiée en tant qu'unités lumineuses relatives (RLUs) à l'aide d'un lecteur de microplaques ou d'un imageur capable de détecter la luminescence, qui sont devenues des pièces d'équipement standard dans la plupart des laboratoires moléculaires. En mesurant la lumière produite sur un intervalle de 40-60 minutes, une rafale oxydative transitoire peut être détectée dès 2-5 minutes après le traitement de l'incitation, avec un pic de 10-20 minutes, et revenir à des niveaux basaux après 60 minutes11. La lumière cumulative produite au cours de ce cours de temps peut être utilisé comme une mesure de la force immunitaire correspondant à l'activation des protéines RBOH12. Pratiquement, cet essai ne nécessite pas d'équipement spécialisé ou de préparation d'échantillons encombrants.

Le pic peu de temps après la détection de MAMP, l'éclatement oxydatif estconsidéré une réponse immunitaire tôt, avec l'activation de MAPK et la production d'éthylène 5. Les réponses immunitaires postérieures incluent la reprogrammation transcriptionnelle, la fermeture stomatal, et le dépôt de callose2,5. L'exposition prolongée aux MAMP active continuellement la signalisation immunitaire énergétiquement coûteuse entraînant l'inhibition de la croissance des plantes, ce qui indique un compromis entre le développement et l'immunité13. L'inhibition de la croissance des semis déclenchéepar par les motifs (SGI) est largement utilisée pour évaluer la production immunitaire dans l'Arabidopsis et a fait partie intégrante de l'identification de plusieurs composants clés de la signalisation immunitaire, y compris les PrR14,15 ,16. Par conséquent, cet article présente en outre un analyse pour le SGI déclenché par le modèle dans Arabidopsis, par lequel les semis sont cultivés dans des plaques multi-bien contenant des médias standard ou des médias complétés par un stimulant immunitaire pendant 8-12 jours, puis pesé à l'aide d'une échelle analytique.

Pour démontrer comment les essais ROS et SGI peuvent être utilisés pour surveiller la signalisation par le PRR, trois génotypes qui représentent des extrants immunitaires variables ont été choisis : (1) le type sauvage Arabidopsis accession Columbia (Col-0), (2) le bak1-5 dominant-négatif mutant dans lequel le multi-fonctionnel PRR co-récepteur BRASSINOSTEROID INSENSITIVE 1-ASSOCIATED KINASE 1 (BAK1) est non fonctionnel dans la signalisation immunitaire17,18, et (3) le mutant récessif cpk28-1, qui n'a pas le protéine régulatrice CALCIUM-DEPENDENT PROTEIN KINASE 28 (CPK28) et affiche des réponses immunitaires accrues19,20. Les essais ROS et SGI sont présentés en réponse à un épitope de peptide d'elfe synthétiquement produit18 du facteur bactérien d'allongement Tu (EF-Tu), reconnu en Arabidopsis par le PRR EF-Tu RECEPTOR (EFR)15. Ces protocoles peuvent être utilisés avec d'autres stimulants immunitaires tels que la flagelline de protéine de motilité bactérienne14 ou les protéines endogènes d'incitation de plante (AtPeps)16,cependant, il convient de noter que la réactivité de plante diffère selon le l'obtenir21. Ensemble, les essais ROS et SGI peuvent être utilisés pour l'évaluation rapide et quantitative des réponses précoces et tardives de PRR-négociées.

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Protocole

1. Détection de l'éclatement de ROS dans les disques de feuilles d'Arabidopsis suivant l'obtention immunitaire

  1. Croissance et entretien des usines.
    1. Pour synchroniser la germination, stratifier les graines d'Arabidopsis en suspendant environ 50 graines dans 1 ml d'agar stérile de 0,1 % [w/v] et les stocker à 4 oC (pas de lumière) pendant 3 à 4 jours.
      REMARQUE : Stratisfier un contrôle de fond de type sauvage (par exemple, Col-0) et des génotypes à rendement immunitaire élevé et faible (par exemple, cpk28-1 et bak1-5, respectivement) pour servir de contrôles internes.
    2. Semer les graines sur le sol et germer dans des conditions de courte journée standard(22 oC, 10 h de lumière, 150 mE/m 2/s d'intensité lumineuse et 65 à 70 % d'humidité relative).
    3. Après environ 7 jours, utilisez des forceps pour transplanter des semis individuels dans de nouveaux pots, séparés d'au moins 4 cm pour permettre le développement complet de la rosette. Transplantez 6 à 12 semis par génotype et retournez à des conditions de courte journée standard. Arroser et fertiliser régulièrement les plantes (1 g/L de 20-20-20 engrais toutes les 2 semaines).
  2. Recueillir les disques de feuilles dans des assiettes de 96 puits pour la récupération pendant la nuit.
    1. À 4-5 semaines après la germination (Figure 1A), utilisez un poinçon de biopsie de 4 mm pour enlever un disque de feuille par plante, en évitant la veine moyenne et en prenant soin de limiter les blessures (Figure 1B). Placer les disques de feuilles dans une plaque de luminomètre inutilisée de 96 puits contenant 100 oL de ddH2O avec le côté adaxial orienté vers le haut pour empêcher la dessiccation22 (Figure 1C). Si vous évaluez plusieurs facteurs, retirez 1 disque de feuille de la même feuille pour chaque traitement de l'éveil.
      REMARQUE : Échantillondez les feuilles qui sont complètement élargies, de la troisième à la cinquième place du haut de la rosette, et à peu près de la même taille et de la même âge pour limiter la variabilité. Si possible, couper les disques de feuilles en deux à l'aide d'une lame de rasoir avant la récupération pendant la nuit, car cela augmente la surface exposée à la solution d'incitation23.
    2. Récupérer toute la nuit à température ambiante pour éviter l'interférence du ROS produit par la blessure lors de la collecte du disque de feuilles. Couvrir les plaques avec un couvercle pour éviter l'évaporation.
  3. Effectuer le traitement d'incitation et mesurer la production de ROS.
    1. Programmez le lecteur de plaque avant d'ajouter la solution de réaction, car cela réduira le temps entre l'initiation de l'éclatement ros et les premières mesures enregistrées. Utilisez un logiciel commercial qui convient au lecteur de plaques. Dans notre cas (voir Tableau des contenus),cliquez sur Paramètres, et sélectionnez le LUM96 Cartridge et le type de lecture cinétique. Cliquez sur la catégorie Zone lecture et faites glisser pour sélectionner un sous-ensemble de puits ou la plaque entière à lire. Sous l'onglet PMT et Optique, fixez le temps d'intégration à 1 000 ms. Sous l'onglet Timing, fixez le temps d'exécution total à 40-60 min et l'intervalle à 2 min.
    2. Retirer l'eau de chaque puits à l'aide d'une pipette multicanal.
      REMARQUE : Ne perforez pas les disques de feuilles, car cela peut causer un stress de blessure et entraîner des sorties DE ROS plus variables.
    3. Préparer une solution de réaction contenant 100 M de luminol, 10 g/mL HRP, et la concentration souhaitée de l'obspirateur (par exemple : elf18 à 1 nM, 10 nM, 100 nM, ou 1 000 nM) en ddH2O stérile en utilisant 10 ml de solution pour une plaque de 96 puits.
      REMARQUE : Dissoudre les peptides lyophilisés dans des h2O stériles dans des tubes à faible liaison pour faire un bouillon de 10 mm, un gel éclair dans le liquide N2et le stocker à -80 oC. Lorsqu'ils sont prêts à l'emploi, diluer les stocks dans le H2O stérile pour générer un stock de travail de 100 M et le stocker à -20 oC.
    4. Utilisez une pipette multicanal pour distribuer 100 L du mélange de réaction à chaque puits, en ajoutant la solution à tous les disques de feuilles du même traitement en même temps22. Inclure une réaction de contrôle (aucun sourceur) pour chaque génotype afin d'évaluer les niveaux de ROS basiques en l'absence d'obtention. Mesurez immédiatement les émissions de lumière pour toutes les longueurs d'onde du spectre visible à l'aide d'un lecteur de microplaques.
      REMARQUE : Préparez et appliquez la solution de réaction sous faible luminosité, car le luminol et le HRP sont des réactifs sensibles à la lumière. Gardez les réactifs sur la glace ou à -20 oC à moins d'être utilisés.
    5. Mesurer l'émission de lumière avec un temps d'intégration de 1 000 ms à intervalles de 2 min sur une période de 40 à 60 min dans un lecteur de microplaques afin de capturer l'éclatement oxydant dynamique (Figure 1D).
      REMARQUE : Utilisez un temps d'intégration plus long pour améliorer la sensibilité aux résultats11, tout en veillant à ce que tous les échantillons dans une plaque de 96 puits puissent être mesurés en un seul intervalle.
  4. Interprétation des données.
    1. Pour chaque génotype, utilisez une application de feuille de calcul pour calculer le nombre moyen de photons et l'erreur standard à chaque point de temps, et affichez la production DE ROS en fonction du temps à l'aide d'une parcelle de dispersion.
      figure-protocol-1
      Où t - chaque point de temps
    2. Vous pouvez également résumer le nombre de photons pour chaque disque de feuille et présenter la moyenne de ces valeurs pour chaque génotype à l'aide d'un graphique à barres avec des barres d'erreur standard ou une boîte et une parcelle de moustaches.
      figure-protocol-2

2. Seedling Growth Inhibition Assay

  1. Stériliser les graines et semer sur les assiettes De Murashige et Skoog (MS).
    1. Préparer une demi-résistance stérile (0,5x) moyenne de SP (2,16 g/L) contenant 0,8 % d'agar [w/v]. Verser le support dans des plaques (90 x 15 mm) dans une hotte à débit laminaire.
    2. Stériliser environ 100 graines dans un tube microcentrifuge en lavant avec 1 ml d'éthanol à 70 % pendant 2 min et retirer par aspiration. Ajouter 1 ml d'eau de Javel à 40 % et incorporer délicatement la roche pendant 17 min à température ambiante. Retirer l'eau de Javel par aspiration et laver trois fois dans 1 ml d'eau stérile pendant 5 min. Resuspendre dans 1 ml d'agar stérile de 0,1 %.
      REMARQUE : Vous pouvez également utiliser un protocole de stérilisation des graines de gaz chlore24.
    3. Semer environ 100 graines par génotype sur des plaques d'agar MS à l'aide d'une pipette et sceller avec du ruban adhésif micropore dans une hotte à écoulement laminaire.
      REMARQUE : Évitez de placer les graines à proximité, car cela rendra la transplantation des semis difficile plus tard.
    4. Stratifier les graines en plaçant les plaques à 4 oC (pas de lumière) pendant 3-4 jours pour synchroniser la germination (Figure 2A).
  2. Transplanter les semis dans des plaques de 48 puits contenant des peptides d'incitation immunitaire.
    1. Après stratification, déplacez les plaques à la lumière dans des conditions de courte journée(22 oC, 10 h de lumière, 150 mE/m 2/s d'intensité lumineuse et 65-70% d'humidité relative) pendant 3-4 jours pour permettre la germination.
    2. Dans une hotte à débit laminaire, préparer des dilutions peptidiques (0 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM et 1 000 nM) dans un média liquide stérile de 0,5x MS contenant 1 % de saccharose [w/v], en utilisant 25 ml de MS pour chaque plaque de 48 puits. Préparer les plaques en pipetilisant 500 l de milieu liquide MS ou de milieu MS contenant des peptides par puits. Si disponible, utilisez un pipettor répétitif pour la préparation de la plaque afin d'accélérer le processus.
      REMARQUE : Pour chaque génotype, cultiver des semis dans la SP sans obtenir de facteur à l'autre pour tenir compte des différences inhérentes à la croissance des semis.
    3. À l'aide de forceps stériles, transplantez soigneusement un semis à chaque puits de la même taille et de la même âge, en veillant à ce qu'il n'y ait aucun dommage au semis ou à la rupture de la racine et que la racine soit immergée dans les médias. Pour chaque génotype, transplanter un minimum de 6 à 8 semis dans chaque dilution peptidique (figure 2B).
      REMARQUE : Transplanter les semis à 4 jours après la germination, car les racines courtes sont plus faciles à manipuler, et les semis plus anciens peuvent donner des résultats moins optimaux.
    4. Plaques d'étanchéité avec du ruban adhésif micropore et retour à la lumière dans des conditions de temps court standard (22 oC, 10 h de lumière, 150 mE/m2/s intensité lumineuse et 65-70% d'humidité relative). Laisser pousser les semis pendant 8 à 12 jours.
  3. Déterminer l'inhibition de la croissance en pourcentage.
    1. Retirer soigneusement les semis des assiettes de 48 puits et les sécher en tapant sur du papier essuie-tout. Peser les semis à l'échelle analytique et enregistrer les valeurs. Si disponible, utilisez une échelle analytique équipée de sortie USB pour enregistrer les valeurs de poids frais sur une feuille de calcul. Avant de peser les semis, prenez une photo pour afficher visuellement l'inhibition de la croissance (figure 2C).
    2. Déterminer l'inhibition de la croissance en pourcentage des semis traités par l'un ou l'autre par rapport aux semis cultivés dans la SP seulement (figure 2D) comme suit :
      figure-protocol-3
    3. Tracez les données à l'aide d'un graphique à barres avec des barres d'erreur standard ou à l'aide d'une parcelle de boîte et de moustaches pour mieux afficher la variance inter-expérimentale.

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Résultats

Mutant cpk28-119,25 et bak1-517,18 plantes ont été utilisées pour démontrer les résultats attendus pour les génotypes avec des réponses immunitaires élevées et faibles, respectivement, en rafale oxydative et SGI tests par rapport à un contrôle de fond de type sauvage (Col-0). Pour évaluer les effets dépendants de la dose, une série de dilution peptide 10 ...

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Discussion

Cet article décrit deux méthodes pour assainer les réponses immunitaires déclenchées par modèle dans Arabidopsis, offrant des approches quantitatives à l'évaluation de la production immunitaire sans l'utilisation d'équipement spécialisé. En combinaison, le ROS et le SGI déclenchés par des motifs peuvent être utilisés pour évaluer les réponses précoces et tardives à la perception des microbes, respectivement.

La principale limitation de l'effort oxydatif est la variabilité. Pour des ra...

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Remerciements

Les travaux de notre laboratoire sont financés par le Programme de découverte du Conseil canadien de recherches sur les ressources naturelles et le génie (CRSNG), le Fonds du chef de la Fondation canadienne pour l'innovation John R. Evans et l'Université Queen's. KS et IS sont appuyés par des bourses d'études supérieures de l'Ontario et des bourses d'études supérieures du CRSN Canada pour les étudiants à la maîtrise (CGS-M).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
20-20-20 EngraisPlant Prod10529Mélanger 1g/L dans de l’eau et appliquer sur les plantes toutes les 2 semaines pour une croissance optimale.
Poinçon à biopsie de 4 mmMedical Mart232-33-34-PUn set de foreurs de liège d’une surface de 0,125 cm^2 peut également être utilisé.
Plaques stériles à 48 puits avec couvercleCLS3548Sigma-Aldrich
avec projet SheidVWRVWR-225ACToute balance analytique standard peut être utilisée pour les tests d’initiation de croissance, cependant, une sortie informatique directe est optimale.
BioHit mLine Pipette mécanique multicanaux 12 (30-300 uL)Sartorius725240N’importe quelle pipette multicanaux peut être utilisée, ainsi qu’un seul pipeteur si nécessaire.
elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG)EZ Biolabcp7211Stocker 10 mM de peptide stock à -80C dans des tubes à faible liaison protéique. Une fois décongelé, stockez le stock de travail de 100 uM à -20 °C.
PinceFisher Scientific22-327379
Raifort PeroxydaseSigma-AldrichP6782Dissoudre dans de l’eau pure. Conserver à -20C et à l’abri de la lumière.
LuminolSigma-AldrichA8511se dissoudre dans le DMSO. Conserver à -20C et à l’abri de la lumière.
Sel basal Murisage et Skoog CedarlaneLabsMSP09-100LTMagasin au 4C.
SolSunGrow HorticultureSunshine Mix #1D’autres types de sol peuvent également être utilisés pour cultiver Arabidopsis. Mélanger avec de l’eau lors du remplissage des casseroles.
SpectraMax Paradigm Lecteur de microplaques multimode avec module LUMDispositifs moléculairesDoit demander un devis Toutlecteur de plaques capable de détecter la luminescence peut être utilisé pour ces dosages.
SaccharoseSigma-AldrichS0389-1KGConserver à température ambiante.
Plaques en polystyrène blanc à 96 puitsFisher Scientific07-200-589
Balance analytique

Références

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Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana
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