Article de méthode

Administration intrabronchique directe pour améliorer le dépôt sélectif d'agent dans le poumon de souris

DOI :

10.3791/59450

⸱

20 mai 2019

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, University of Colorado Denver, 2Department of Medicine, Denver Health Medical Center

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'administration intratrachéale (IT) des agents expérimentaux chez les souris a souvent comme conséquence la livraison asymétrique aux poumons distal.  Dans ce rapport, nous décrivons une approche intrabronchique directe (IB) pour cannuler chaque poumon dans les souris vivantes non-opératoirement.  Cette approche peut être utilisée pour administrer sélectivement des agents à un poumon ou peut être adaptée pour améliorer l'administration d'agents symétriques aux deux poumons.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'administration intratrachéale (IT) des agents expérimentaux est une technique essentielle dans les modèles murins des maladies pulmonaires diffuses, telles que la fibrose pulmonaire induite par la bléomycine.  Cependant, la distribution des agents intratracheally-administrés au poumon distal de souris est souvent asymétrique, avec des concentrations parenchymales de poumon augmentées dans le poumon gauche plus petit (mais également accessible) de la souris.  Décrit dans ce rapport est une nouvelle approche intrabronchique (IB) pour canuiller les poumons gauches et/ou droits des souris vivantes non-opératoirement.  Il est également démontré comment cette approche peut être utilisée pour administrer sélectivement des agents à un poumon ou adaptée (par l'intermédiaire de l'administration de l'IB corrigée des doses) afin d'améliorer la symétrie gauche-droite des agents expérimentaux, améliorant ainsi les modèles de maladie pulmonaire telle que la fibrose pulmonaire induite par la bléomycine.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'administration pulmonaire directe d'agents expérimentaux chez la souris permet l'étude des réponses immunitaires pulmonaires, des lésions pulmonaires aigues et de la fibrose pulmonaire. L'administration pulmonaire directe est généralement effectuée par instillation intratrachéale (IT), comme décrit précédemment1,2,3. Cependant, cette approche n'est pas sélective, affectant les deux poumons d'une manière non ciblée et souvent asymétrique.  La modélisation expérimentale des lésions pulmonaires peut bénéficier de la capacité de cibler sélectivement un poumon spécifique, permettant l'utilisation du poumon contralatéral comme un contrôle. Inversement, la modélisation précise des maladies pulmonaires diffuses humaines bénéficie de la distribution symétrique d'agents expérimentaux au parenchyme pulmonaire bilatéral.

L'objectif global de ce rapport est de décrire une méthode d'administration sélective d'agents expérimentaux au poumon gauche ou droit d'une souris (figure 1). Cette approche d'administration intrabronchique (IB) permet le traitement unilatéral d'un poumon de souris et peut être facilement adaptée pour assurer la livraison égale d'un agent aux bronches bilatérales de mainstem. En utilisant l'administration de l'IB pour fournir de plus grandes doses d'agents expérimentaux au poumon droit plus grand et de plus petits volumes au poumon gauche plus petit (c.-à-d., l'administration de l'IB dose-ajustée), démontrée dans ce rapport est une amélioration de l'homogénéité du poumon pulmonaire l'administration d'agents expérimentaux, optimisant le modèle de lésions pulmonaires diffuses chez la souris. En tant que tel, ce rapport peut avoir de la valeur pour les chercheurs qui cherchent soit à administrer unilatéralement des agents expérimentaux aux souris ou d'améliorer la symétrie des dépôts de médicaments dans les deux poumons.

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Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tous les protocoles sur les animaux ont été approuvés par l'University of Colorado Denver Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Toutes les procédures décrites ci-dessous (sections 4 à 7) ont été optimisées à l'aide de souris C57BL/6 mâles et femelles. Cette approche a été validée à l'aide de souris dont le poids corporel varie de 19 à 40 g.

1. Création d'une plate-forme pour l'administration de l'IB

  1. Pliez le bookend de l'angle original de 90 degrés entre l'aile basale et l'aile debout à 70 degrés (Figure 2A).
  2. Percer un trou au centre de l'aile debout du bookend en métal (Figure 2A).
  3. Percer un trou de taille identique à la position correspondante de la planche en plastique. Percer deux trous plus petits de façon inférieure et latérale (figure2A).
  4. Drape zunez une suture de soie 4:0 entre ces petits trous dans la planche en plastique (Figure 2A).
  5. Placez le crochet et le ruban adhésif sur le bord de la planche en plastique (Figure 2A).
  6. Assembler la planche en plastique au bookend en métal avec la vis (Figure 2B). Assurez-vous que l'écrou vis-écrou est suffisamment serré pour maintenir la planche en position tout en permettant l'ajustement de l'angle, si nécessaire.
  7. Assurez-vous que la rotation de la planche en plastique est dans le sens des aiguilles d'une montre et dans le sens inverse des aiguilles d'une montre, se déplaçant librement.
    REMARQUE : Le mouvement dans le sens des aiguilles d'une montre est représenté dans le présent rapport sous la forme d'une rotation de degré(MD) et le mouvement dans le sens inverse des aiguilles d'une montre est représenté comme une rotation de degré (-) .
  8. Utilisez un protracteur d'angle pour positionner la planche en plastique à 30 degrés, 86, -30 et -74 degrés et marquez-les sur le bookend, respectivement.

2. Création de cathéters étendus pour l'administration des agents de l'IB

  1. Faire une coupe d'angle droit avec une lame pointue sur la pointe d'un cathéter original de 22 G (25 mm, voir Tableau des matériaux) (Figure 3, étape 1a).
  2. Bevel (50 '60 ') l'extrémité de l'autre cathéter d'origine (25 mm) avec la lame, puis coupé à angle droit de la plaque tournante (Figure 3, étape 1b).
  3. Coller les deux cathéters à leurs extrémités émoussées avec un angle légèrement inférieur à 180 degrés (figure3, étape 2).
  4. Émousser la pointe bevée en fondant avec une cautérisation à basse température (voir Tableau des matériaux).
  5. Polir le cathéter étendu avec du papier de verre de taille "0" sur la zone collée et la pointe bevée du cathéter étendu (figure 3, étape 3).
  6. Marquez sur le cathéter étendu avec des couleurs différentes à 25 mm, 30 mm et 35 mm (figure3, étape 3).
  7. Indiquer le côté bevel du cathéter prolongé en étiquetant son moyeu avec un marqueur.
  8. Rincer le cathéter prolongé avec de l'eau DI, en faisant le plein à l'intérieur du cathéter avec 70 % d'éthanol. Airdry le cathéter.
  9. Stériliser avec la lumière UV pendant 10 min avant utilisation.

3. Préparation préalable à la procédure

  1. Faire tous les agents administrés dans une hotte de sécurité biologique sous la technique stérile.
  2. Nettoyez le lieu de travail avec 70 % d'éthanol.
  3. Stériliser tous les outils chirurgicaux avec 70% d'éthanol.
  4. Fixez la base de la plate-forme de travail au banc immédiatement en face du chercheur en apposant des pinces C à l'aile basale du serre-livres.
  5. Générer plusieurs spiromètres de fortune, qui sont des dispositifs qui permettront de détecter le flux d'air des marées chez les souris. En bref, déposer 60 l de salin stérilisé dans une seringue de 1 ml (plunger enlevé) avec une pointe de chargement de gel.
    REMARQUE : La goutte déposée d'occludes salins du baril et se déplace vers le haut et vers le bas lorsqu'elle est exposée à la ventilation des marées3.
  6. Attachez lâchement le moyeu d'un cathéter étendu de 22 G au spiromètre de fortune.
  7. Placez chacun des gouttes de verre de chaque côté de la plate-forme pour faciliter l'accès.
  8. Connectez la chambre d'induction de l'isoflurane à la machine d'anesthésie des rongeurs (voir Tableau des matériaux) dans un coffret de sécurité biologique compatible avec l'isoflurane.

4. Approche d'intubation informatique non opérationnelle

  1. Anesthésiez une souris C57BL/6 (mâle ou femelle, 8 à 10 semaines, 25 g) avec de l'oxygène (2 L/min) et 5 % d'isoflurane (voir Tableau des matériaux)dans une chambre d'induction pendant 4 min.
  2. Aspirez l'agent expérimental à livrer (p. ex., colorant bleu Evans ou FITC-dextran, comme le démontre la figure 4) en deux pipettes, puis placez-les de chaque côté de la plate-forme pendant la sédation.
  3. Assurer un taux respiratoire d'environ 24 à 30 respirations/min avant de retirer la souris de la chambre d'induction de l'anesthésie.
    REMARQUE : L'anesthésie d'isoflurane dure typiquement pendant 4 min, suffisante pour toutes les procédures d'IB. Si l'opérateur n'est pas compétent avec la technique, la kétamine/xylazine (80 mg/kg et 10 mg/kg intrapéritonement, voir Tableau des matériaux) peut être utilisé pour une anesthésie plus prolongée.
  4. Suspendre la souris par ses inciseurs sur la ligne de suture drapée en position de supine. Fixer la souris avec deux à trois morceaux de crochet et boucler la bande lâchement, en évitant la restriction de la ventilation.
  5. Allumez l'illuminateur à fibres optiques LED (voir Tableau des matériaux, Figure 2C).
  6. Placez l'opérateur derrière la plate-forme (dorsal à la souris).
  7. Orientez le goulot d'oie de l'illuminateur afin qu'il illumine la zone du larynx à travers la peau. La distance entre la souris et la source de lumière est de 2 à 3 cm (figure2C).
  8. Confirmez la profondeur de l'anesthésie avec une pincement d'orteil/patte avant d'effectuer toutes les procédures ci-dessous.
  9. Tenez les forceps stériles avec la main dominante, puis tirez la langue hors de la cavité buccale avec les forceps.
  10. Tenez le dépresseur stérile avec la main non dominante, puis aplatissez la racine de la langue avec le dépresseur pour exposer largement l'oropharynx. Les forceps peuvent alors être libérés, libérant la main dominante.
  11. Utilisez la main dominante pour intuber le cathéter prolongé dans la trachée par la cavité buccale (Figure 2C).
  12. Confirmer le placement en observant si la bulle dans la seringue se déplace de haut en bas à chaque respiration.
  13. Des détails supplémentaires de l'intubation informatique ont été publiés précédemment3. Le temps total de procédure, à l'exclusion de l'anesthésie, dure de 10 à 15 s pour un opérateur bien formé.

5. Approches non opérationnelles d'intubation et de livraison de l'IB

  1. Approche de l'IB à la cannulation lobar sélective du poumon droit distal
    1. Après avoir effectué le cannulation informatique (étape 4.11), faites pivoter la planche en plastique à 30 degrés (figure 4A).
    2. Tenez le moyeu du cathéter et guidez-le naturellement en parallèle à la ligne médiane de la souris, en l'étendant aux profondeurs basées sur le poids comme décrit dans le tableau 1.
      REMARQUE : La résistance à ces profondeurs doit être notée. À ce stade, la souris deviendra légèrement tachypneic, comme expliqué dans les résultats représentatifs. Pour un opérateur expérimenté, environ 90% des tentatives cannule avec succès le poumon droit (avec la tachypnée notée).
    3. Fournir 20 l de 0,3 % de colorant bleu Evans (EBD, voir Table of Materials) avec une pointe de chargement de gel.
    4. Distribuer 1/2 aliquots (0,1 ml chacun) d'air à l'aide du goutte-à-goutte en verre.
      REMARQUE : Cela assure le dégagement de la solution résiduelle d'EBD (ou agents expérimentaux) de l'intérieur du cathéter.
    5. Retirez le cathéter, puis maintenez la position de la souris pendant 30 s.
    6. Placez l'animal sur une couverture chauffante jusqu'à ce qu'il retrouve conscience. La récupération est généralement terminée dans les 2 minutes.
  2. Approche de l'IB pour le cannulation segmenté sélectif du poumon gauche distal
    1. Après avoir effectué le cannulation informatique (étape 4.11), faites pivoter la planche en plastique -74 ' (Figure 4B).
    2. Maintenez le moyeu du cathéter et exercez une légère pression pour faire avancer le cathéter dans les bronches du tronc principal gauche, tout en exerçant une pression modeste à la fois vers le bas (90 degrés) et vers le bookend. Aux profondeurs indiquées dans le tableau 1, l'opérateur doit noter la résistance au fur et à mesure que les segments inférieurs du poumon gauche sont engagés. Si la tachypnée se produit, retirez le cathéter à la position de 20 à 25 mm, et retentez.
    3. Après avoir cannulating les segments inférieurs gauches de poumon, un changement de position est exigé pour permettre l'assistance gravitationnelle pour l'administration d'agent. Faites pivoter la planche en plastique -30 ' (Figure 4B).
    4. Fournir 40 L de 0,3 % d'EBD avec une pointe de chargement de gel.
      REMARQUE: Il est possible de fournir un plus grand volume d'agent parce que le poumon gauche n'a qu'un seul lobe.
    5. Distribuer 1/2 aliquots (0,1 à 0,3 ml chacun) d'air à l'aide des gouttes de verre.
      REMARQUE : Cela assure le dégagement de tout EBD résiduel (ou agents expérimentaux) de l'intérieur du cathéter.
    6. Retirez le cathéter, puis maintenez la position de la souris pendant 30 s.
    7. Placez l'animal sur une couverture chauffante jusqu'à ce qu'il retrouve conscience. La récupération est généralement terminée dans les 2 minutes.
  3. Adaptation de l'administration de l'IB pour permettre la livraison de l'agent à l'intégralité du poumon gauche ou droit
    REMARQUE : Si l'opérateur cherche à livrer des agents non pas à un lobe pulmonaire droit spécifique ou à un segment pulmonaire gauche, mais plutôt à l'ensemble du poumon (poumon droit ou gauche), le cathéter doit être légèrement retiré aux bronches du tronc principal respectif, comme suit.
    1. Administration pulmonaire entière droite
      1. Après l'étape 4.11, faites pivoter la planche en plastique à 30 degrés (figure 5A).
      2. Tenez le moyeu du cathéter et guidez-le naturellement en parallèle à la ligne médiane de la souris, l'atteignant à des profondeurs nécessaires pour le cannulation lobar distal latéral droit (tableau 1).
      3. Confirmer l'apparence du signe de tachypnée.
      4. Faites pivoter la souris à -74 degrés pour permettre l'assistance par gravité pour la livraison de l'agent (figure 5B).
      5. Retirez le cathéter à une position qui correspond au décollage de la bronche du tronc principal droit (tableau 1). Assurez-vous que le bevel du cathéter fait face vers le bas (figure 5B).
      6. Fournir 30 L de 0,3 % d'EBD avec une pointe de chargement de gel au poumon droit.
      7. Distribuer 1/2 aliquots (0,1 à 0,3 ml chacun) d'air à l'aide d'un goutte-à-goutte en verre.
      8. Retirez le cathéter, puis maintenez la position de la souris pendant 30 s. Placez l'animal sur une couverture chauffante jusqu'à ce qu'il retrouve conscience. La récupération est généralement terminée dans les 2 minutes.
    2. Administration pulmonaire entière laissée
      1. Après l'étape 4.11, faites pivoter la planche en plastique -74 ' (Figure 6A). Alternativement, la rotation peut se produire après l'étape 5.3.1.8 en retirant le cathéter à la trachée, permettant l'administration bilatérale d'agent d'IB.
      2. Maintenez le moyeu du cathéter et exercez une légère pression pour faire avancer le cathéter dans le cathéter principal gauche, tout en exerçant une pression modeste à la fois vers le bas (90 degrés) et vers le bookend. La profondeur de l'intubation est guidée par le tableau 1.
      3. Confirmez le signe de non tachypnea.
      4. Faites pivoter la souris à 86 degrés pour permettre une assistance gravitationnelle avec l'administration de l'agent.
      5. Retirez le cathéter vers les bronches du tronc principal gauche (les mêmes distances que le poumon droit sont suffisantes, tableau 1) et faites pivoter le beveter du cathéter vers le bas (Figure 6B).
      6. Fournir 30 L de 0,3 % d'EBD avec une pointe de chargement de gel au poumon gauche.
      7. Distribuer 1/2 aliquots (0,1 à 0,3 ml chacun) d'air à l'aide d'un goutte-à-goutte en verre.
      8. Retirez le cathéter, puis maintenez la position de la souris pendant 30 s. Placez l'animal sur une couverture chauffante jusqu'à ce qu'il retrouve conscience. La récupération est généralement terminée dans les 2 minutes.

6. Utilisation d'approches séquentielles de cannulation de l'IB pour fournir des volumes d'agent ajustés en dose à chaque poumon

  1. Groupe d'administration informatique
    1. Effectuer IT cannulation tel que décrit dans les étapes 4.1-4.11.
    2. Fournir 60 L de 0,05 % FITC-dextran (voir Tableau des matériaux) avec une pointe de chargement de gel (Figure 1B).
    3. Distribuer 1/2 aliquots (0,1 à 0,3 ml chacun) d'air à l'aide des gouttes de verre.
    4. Gardez la position pour 60 s et permettre la récupération de la souris comme décrit ci-dessus.
  2. Administration bilatérale symétrique de l'IB
    1. Effectuer les étapes 5.3.1.1-5.3.1.8 (poumon droit) et les étapes 5.3.2.1-5.3.2.8 (poumon gauche).
    2. Administrer des volumes égaux (30 l) de 0,05 % de FITC-dextran (ou un agent expérimental) de chaque côté du poumon.
  3. Administration bilatérale de l'IB corrigée des doses
    1. Effectuer l'étape 5.3.1.1-5.3.1.8 (poumon droit) et les étapes 5.3.2.1-5.3.2.8 (poumon gauche).
    2. Administrer un volume plus important (40 l) de 0,05 % de FITC-dextran au poumon droit plus grand, et un volume plus faible (20 L) de 0,05 % DE FITC-dextran au poumon gauche plus petit. Au lieu de FITC-dextran, un agent expérimental peut être administré.

7. Utilisation de l'administration de l'IB corrigée des doses pour améliorer la symétrie des lésions pulmonaires induites par la bléomycine à dose unique (BLM)

  1. Groupes d'administration BLM
    1. Groupe d'administration IB-BLM ajusté en fonction de la dose (1,2 mg/kg, voir Table of Materials) groupe d'administration : 60 L (20 l pour le poumon gauche et 40 l pour le poumon droit, respectivement) de la solution BLM ont été livrés à des souris (n ' 5). Les commandes (n '5) ont reçu des volumes similaires de salin.
      REMARQUE : Se référer aux étapes 5.3.1 et 5.3.2.
    2. Groupe d'administration informatique : 60 lde de solution BLM ont été livrés à des souris avec des techniques d'administration informatique.
      REMARQUE : Reportez-vous aux étapes 6.1.1-6.1.4.
  2. Mesure de la fonction pulmonaire
    1. Le jour 21 après BLM ou salin, anesthésier les souris avec une injection intrapéritonéale (IP) de kétamine (160 mg/kg) et de xylazine (32 mg/kg).
    2. Après avoir confirmé la profondeur de l'anesthésie par pincement de patte/orteil, effectuer une trachéotomie avec une canule de 18 G (voir Tableau des matériaux).
    3. Connectez les souris au ventilateur et mesurez la mécanique respiratoire telle que décrite précédemment4.
  3. Collecte et traitement des tissus pulmonaires
    1. Après la mesure de la mécanique pulmonaire, euthanasiez les souris anesthésiées par ponction cardiaque.
    2. Ouvrez la paroi thoracique et induise des pneumothoraces bilatérales.
    3. Gonfler les poumons avec 1 % d'agarose de fonte faible (40 oC)5 en PBS à une pression constante (42 cm H2O).
    4. Couper quatre à cinq morceaux du poumon le long du long axe transversalement, fixer dans 10% de formaline, et incorporer dans la paraffine.
    5. Coupez des sections de 5 m et tachez avec le trichrome de Masson pour visualiser les dépôts de collagène.

8 Soins post-procéduraux

  1. À la fin des procédures de survie, placez l'animal sur une couverture chauffante jusqu'à ce qu'il retrouve conscience. La récupération est généralement terminée dans les 2 minutes.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'intubation sélective de l'IB cible des lobes spécifiques (poumon droit) ou des segments basilaires (poumon gauche).

L'administration de l'IB de l'EBD au poumon droit a été exécutée comme décrit dans la section 5.1. Après l'achèvement de l'expérience, des souris ont été administrées une dose mortelle de kétamine intrapéritonéale/xylazine, et des poumons ont été moisis pour la démonstration de la distribution d'...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les lésions pulmonaires ont été modélisées classiquement chez les rongeurs en utilisant l'administration informatique d'agents nuisibles tels que BLM6. Une telle administration informatique, cependant, ne conduit qu'à des blessures inégales, reflétant la nature non ciblée de la livraison des poumons avec cette approche7. Ces limitations de la modélisation des lésions pulmonaires sont des défis instructifs rencontrés lors de la tentative de la livraison informatique d'agents...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont pas d'intérêts financiers concurrents.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ces travaux ont été financés par la subvention HL125371 de l'NHLBI à E.P.S. et par la subvention W81XWH-17-1-0051 du DOD (CDMRP) à Y.Y.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
22 G Cathéter IV blindéBD381423
BleomycinEnzo sciences de la vieBML-AP302-0010
Mini appareil compact d’anesthésie des rongeurs  ;DRE Veterinary9280
Evans colorant bleuSigma-AldrichE2129
FITC-dextranSigma-AldrichFD150
IsofluranePiramal Critical CareNDC  ;
LED-30W Fibre Optique Double Col de Cygne Microscope IlluminatorAmScopeLED-30W
Cautère à basse température avec pointe fine  ;Aiguille BovieAA02
Precisionglide, 18G x 1"BD305195Pointe biseautée, 12 mm de longueur  ;
XylazineAKORNNDC 59399-110-20
ZatamineVetOneNDC 13985-702-10  ;kétamine

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. MacDonald, K. D., Chang, H. Y., Mitzner, W. An improved simple method of mouse lung intubation. Journal of Applied Physiology. 106 (3), 984-987 (2009).
  2. Thomas, J. L., et al. Endotracheal intubation in mice via direct laryngoscopy using an otoscope. Journal of Visualized Experiments. (86), (2014).
  3. Vandivort, T. C., An, D., Parks, W. C. An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice. Journal of Visualized Experiments. (108), 53771(2016).
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Mots-clés

Injection intratrach alecanulation pulmonaireadministration bilat raleadministration ajust e selon la dosecolorant bleu d EvansFITC dextranfibrose induite par la bl omycine

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